羅詠熙， 黃雪瑩， 冼若婷， 余皖鑫， 梁莉欣， 梁兆佳， 陳紫韻， 侯丹， 余挺

廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院·口腔醫(yī)學重點實驗室·廣州口腔疾病研究所，廣東廣州（510182）

慢性牙周炎是口腔菌群失調引起的可導致牙周組織破壞的慢性感染性疾病。重度牙周炎的全球患病率達11.2%，是失牙的主要原因［1］。牙周組織破壞的程度主要取決于宿主易感性，牙周炎易感性可受到多種全身代謝病的影響，如心血管疾病、糖尿病、肥胖、代謝綜合征等［2］。宿主代謝免疫失調是重大代謝病加重牙周炎的重要機制［3］。高尿酸血癥（hyperuricemia，HU）是繼“三高”（高血壓、高血糖、高血脂）后的第四高，全球患病率約15%，中國患病率約13.3%［4］。嘌呤分解代謝過程中，尿酸（uric acid，UA）生成增多或排出減少均可引起HU。UA 結晶在關節(jié)中沉積可引起痛風性關節(jié)炎，在關節(jié)外組織沉積可引起腎結石、慢性腎病。而且，HU 是多種重大代謝病包括肥胖、糖尿病、心血管疾病、骨質疏松癥的危險因素［5］。HU 主要通過上調系統(tǒng)性炎癥導致多器官（包括骨組織）損害［6］。

近年研究顯示，血液、唾液UA 水平變化與多種口腔硬組織疾病相關，包括根尖周炎［7］、牙周炎［8］、植體周?。?］、牙根吸收［10］。牙周炎患者的血漿UA 水平較健康對照組更高［11］。在IgA 腎病患者中，伴重度牙周炎者比伴輕中度牙周炎者的血清UA 水平更高［12］。牙周基礎治療后的血清UA 水平較治療前降低［13］。然而，以往研究關注的血液尿酸水平變化均處于正常生理范圍，尚缺乏HU 與牙周炎關聯(lián)的直接證據(jù)［14］。鑒于HU 與牙周炎的動物模型均已成熟化，利用復合模型探索兩種疾病的相關性具備可行性。本研究擬建立HU 與牙周炎的復合動物模型，并探索HU 與牙周炎是否具有相關性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗動物由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。14只SPF級KM小鼠（雄性，5周齡，體質量28～32 g）購入后適應性喂養(yǎng)3 d。實驗通過廣州醫(yī)科大學動物實驗中心倫理委員會批準（批號GY2019-028）。

1.2 模型建立

1.2.1 HU 模型建立 將小鼠隨機分為兩組，即高尿酸（HU）飼料組和正常對照（NC）飼料組（n＝7）。HU 組喂以誘導飼料（博泰宏達生物，北京），配方為標準飼料+添加成分（表1）。添加成分為5%氧嗪酸鉀、2.5%尿酸，添加比例參照以往研究［15］。NC 組喂以無特殊添加成分的標準飼料（廣東省醫(yī)學實驗動物中心）作為對照。HU 模型通過血清檢測UA 濃度進行驗證。以往研究中，小鼠尿酸濃度升高，與對照組有統(tǒng)計學差異，則可認為HU 動物模型構建成功［16］。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF 級，溫度（20～26）℃，3～4 只一籠飼養(yǎng)，自由飲食。誘導期設為35 d［15］。記錄基線體質量和誘導35 d 體質量。

1.2.2 牙周炎模型建立 飼料誘導25 d，進入牙周炎誘導期。參照以往研究［17］，腹腔注射4%水合氯醛溶液麻醉（0.1 mL/10 g 體質量）下，5-0 絲線（愛惜康，上海強生）結扎右側上頜第二磨牙，誘導牙周炎（P 側），左側不結扎作為對照（C 側）。結扎5 d時，異氟烷氣麻下檢查絲線穩(wěn)定性，若脫落則進行二次結扎。結扎10 d 后處死，結扎期間飼料不變。

1.2.3 模型建立的時間軸 5 周齡的雄性KM 小鼠適應性喂養(yǎng)后，隨機分為兩個飼料組，分別用誘導飼料和標準飼料喂養(yǎng)，飼料誘導期為35 d，第25 d結扎右側上頜第二磨牙，結扎期間飼料不變，25 d至35 d 為牙周炎誘導期，35 d 處死小鼠，組織取材。

表1 誘導飼料和標準飼料的各成分質量分數(shù)Table 1 Ingredients′mass fractions in induced food and standard food

1.3 組織取材

飼料誘導前，尾靜脈采空腹全血80 μL，分離血清，凍存（-20 ℃），用于基線UA 檢測。誘導期結束后，心臟穿刺采血用于終點UA 檢測。35 d 頸椎脫臼處死，分離雙側上頜骨，用以micro-CT 分析。

1.4 血清UA 濃度檢測

血清置于室溫解凍，按照尿酸試劑盒（建成生物，南京）說明操作。檢測原理為尿酸酶法，產(chǎn)物檢測采用酶比色法，酶標儀測定產(chǎn)物水平并換算成尿酸濃度。

1.5 頜骨micro-CT 分析

頜骨使用micro-CT（SkyScan1172，Bruker 公司，比利時）掃描，掃描參數(shù)為80 kV，100 μA，掃描層厚8 μm，掃描結束后利用配套軟件進行三維圖像重建。用于分析的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI），下界為第二磨牙的根分叉頂，上界為其根尖，近中界為右上第一磨牙近中根的近中，遠中界為右上第三磨牙遠中根的遠中。每5 層劃定一次ROI，直至完成。分析得出ROI 區(qū)的總體積、扣除牙根后的骨體積以及骨礦物質密度。骨體積分數(shù)＝扣除牙根后的骨體積/總體積［18］。

1.6 組織學分析

頜骨掃描結束后，于常溫下用10%EDTA 脫鈣2 周，沖水過夜，組織修整，脫水，石蠟包埋，冠狀面朝下。切片，厚度為5 μm，調整角度使三顆磨牙冠根在一個平面上，后行蘇木素-伊紅染色，染色后拍照。定性分析牙周炎癥和牙槽骨吸收。具體可參照以往研究［19］。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，用均數(shù)± 標準差表示，用t 檢驗進行比較。對UA 濃度與牙槽骨吸收指標、體質量進行Pearson 相關性分析。P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HU 模型驗證

飼料誘導前，NC組體質量（30.66±0.78）g，HU組體質量（30.92±0.99）g，差異無統(tǒng)計學意義（t＝-0.538，P＝0.601）；飼料誘導35 d 后，NC 組體質量（48.96± 3.46）g，HU 組體質量（42.35 ± 4.11）g，差異有統(tǒng)計學意義（t＝3.106，P＝0.010）。

飼料誘導前，NC 組血清UA（33.33 ± 5.97）μmol/L，HU 組血清UA（29.40 ± 11.03）μmol/L，差異無統(tǒng)計學意義（t＝0.828，P＝0.424）。飼料誘導35 d 后，HU 組血清UA（112.94±26.82）μmol/L，NC組血清UA（72.21 ± 19.95）μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（t＝-3.058，P＝0.011）。

2.2 牙周炎模型驗證

HU 小鼠中，C 側、P 側骨體積分數(shù)為（42.41 ±7.81）%、（29.01 ± 11.09）%，差異有統(tǒng)計學意義（t＝-2.421，P＝0.036）；C 側、P 側骨礦物質密度為（0.74 ± 0.08）g/cm3、（0.53 ± 0.16）g/cm3，差異有統(tǒng)計學意義（t＝-2.896，P＝0.016）。NC 小鼠獲得的結果與HU 小鼠類似，C 側、P 側骨體積分數(shù)為（50.27 ±10.84）%、（29.56 ± 15.27）%，差異有統(tǒng)計學意義（t＝-2.709，P＝0.022）；C 側、P 側骨礦物質密度為（0.73 ± 0.05）g/cm3、（0.52 ± 0.14）g/cm3，差異有統(tǒng)計學意義（t＝-3.409，P＝0.007）。兩飼料組牙周炎側相對于對照側的牙齦乳頭消失，附著喪失明顯，結締組織大量炎癥細胞浸潤，骨吸收明顯（圖1、圖2）。

2.3 HU 對牙槽骨吸收的影響

HU 組、NC 組P 側骨體積分數(shù)為（29.01 ±11.09）%、（29.56 ± 15.27）%，差異無統(tǒng)計學意義（t＝-0.072，P＝0.944）；HU 組、NC 組P 側骨礦物質密度為（0.53±0.16）g/cm3、（0.52±0.14）g/cm3，差異無統(tǒng)計學意義（t＝0.038，P＝0.970）。

2.4 血清UA 濃度與牙槽骨吸收的相關性

Figure 1 micro-CT topograph of the periodontitis side and control side in the HU group and NC group圖1 HU 組與NC 組中牙周炎側與對照側的micro-CT 形貌圖

Figure 2 HE staining of pathology slides on the periodontitis side and control side in the HU group and NC group ×100圖2 HU 組與NC 組中牙周炎側與對照側的HE 染色組織病理圖 ×100

在進行UA 濃度與牙槽骨吸收指標的相關性分析之前，先進行了UA 濃度與體質量的相關性分析。結果顯示，UA 濃度與體質量無相關性（r＝-0.493，P＝0.103）。HU 組P 側中，UA 濃度與總體積（r＝0.043，P＝0.935）、扣除牙根后的骨體積（r＝0.098，P＝0.854）、骨體積分數(shù)（r＝0.097，P＝0.855）及骨礦物質密度（r＝0.299，P＝0.565）均無相關性；NC 組P 側中亦發(fā)現(xiàn)類似結果，UA 濃度與總體積（r＝-0.188，P＝0.721）、扣除牙根后的骨體積（r＝0.08，P＝0.880）、骨體積分數(shù)（r＝0.003，P＝0.996）及骨礦物質密度（r＝-0.003，P＝0.996）均無相關性。

3 討 論

本研究首次建立HU 與牙周炎的聯(lián)合動物模型，結果顯示兩種模型均建立成功。然而，基于micro-CT 的頜骨大體形態(tài)分析未發(fā)現(xiàn)HU 或UA 水平與牙槽骨吸收有直接關系。micro-CT 的頜骨形態(tài)分析結果暫不支持HU 與牙周炎相關。

建立HU 動物模型的方法有敲除尿酸氧化酶基因、補充外源性尿酸、補充尿酸前體物質、利用尿酸酶抑制劑（如氧嗪酸鉀）抑制尿酸酶活性以及利用抗尿酸排泄藥物（如乙胺丁醇）抑制腎臟排除尿酸［15］。誘導飼料中含有氧嗪酸鉀和尿酸，不僅抑制尿酸酶的活性，而且外源性補充尿酸，從而使血尿酸升高。臨床上，男性血尿酸濃度高于420 μmol/L，女性高于360 μmol/L，即稱為高尿酸血癥。動物方面無具體標準，UA 升高即可認為建模成功。絲線結扎法是使用廣泛的牙周炎造模方法。絲線結扎可能會因為牙周創(chuàng)傷、牙齒松動、麻醉并發(fā)癥等系列后果造成小鼠進食受到影響，從而造成代謝狀態(tài)的偏移［20］。本研究基于前期大量的牙周炎與肥胖復合造模經(jīng)驗［19］，將飼料誘導的HU 模型與結扎法誘導的牙周炎模型合并，未觀察到模型合并對兩種成模結果的明顯干擾。而且，HU 組的體質量增長情況亦符合KM 小鼠在標準飼料下的正常生長曲線。

飼料誘導不同于注射法與灌胃法，無法控制小鼠攝入等熱量飼料。高尿酸飼料與基礎飼料盡管存在成分、熱量的輕微差異，但均屬于國標飼料，這并非造成兩飼料組體質量差別的原因。相反，標準飼料的單位熱量稍低，但該組小鼠的體質量反而更高，可能因為誘導飼料中的特殊添加成分氧嗪酸鉀和尿酸造成小鼠食物攝入量減少［21］。本研究結果顯示，體質量與血清UA 或牙槽骨吸收并無相關性，故未參與混雜HU 與牙周炎之間的關系。可能因為兩飼料組的體質量差異（15.6%）在正常范圍，并未達到超重或肥胖（> 25%體質量增長［22］）。

基于micro-CT 的頜骨大體形態(tài)分析，本研究尚未發(fā)現(xiàn)HU 或UA 水平與牙周炎的相關性。Narendra 等［23］也發(fā)現(xiàn)牙周炎及其嚴重程度不影響UA 水平。但也有一些研究表明，血UA 水平與牙周炎及其嚴重程度呈正向關系；例如，牙周炎患者的UA水平較牙周健康高［11］；牙周基礎治療降低牙周炎患者的血清UA 水平［13］。但臨床上UA 水平的升高尚在正常生理范圍內，并未達到HU 的標準。動物實驗顯示，肥胖狀態(tài)的牙周炎大鼠的UA 水平較牙周健康組高［8］。在牙周炎大鼠中，高脂飲食組的UA 水平較正常飲食組更高［24］。本研究與上述研究存在差異的原因可能有兩點：①兩飼料組的體質量差異在正常范圍，未達到超重；②UA 濃度變化的程度存在差異。尚有研究顯示，牙周炎患者的唾液UA 水平較牙周健康者更低［25］，可能因為唾液與血液的UA 代謝存在差異。

基于該復合模型，通過micro-CT 的頜骨大體形態(tài)分析，未發(fā)現(xiàn)HU 對牙槽骨吸收的不利效應，也未發(fā)現(xiàn)尿酸濃度與牙槽骨吸收的相關性，可能有幾點原因：①牙周炎模型雖然構建成功但觀察時間不夠長，在短期內HU 對牙槽骨吸收的潛在不利影響未顯現(xiàn)；②樣本量偏小，個體差異造成的誤差掩蓋了HU 可能存在的不利作用；③系統(tǒng)和牙周組織免疫的全面評估可能有利于發(fā)現(xiàn)HU 的細微影響；④不排除HU 可能無法直接影響但可通過共發(fā)病如肥胖對牙周炎間接施加影響［8］。

綜上所述，本研究成功建立HU 與牙周炎的復合動物模型，為HU 與牙周炎的關系研究打下基礎。micro-CT 的頜骨大體形態(tài)分析暫不支持HU 與牙周炎的直接關聯(lián)，未來尚需更大樣本的動態(tài)實驗、多時間點縱向比較以及多水平指標分析（組織學分析和分子生物學分析）進一步探究HU 與牙周炎的關系。

【Author contributions】Luo YX processed and analyzed the data and wrote the article. Huang XY, Xian RT, Yu WX, Liang LX, and Chen ZY performed the experiments. Liang ZJ directed the data collection and analysis. Hou D guided the writing of the article. Yu T designed the study. All authors read and approved the final manuscript as submitted.