徐 昆， 石清蘭， 胡振斌， 張 旭， 李 瑛

1 廣西中醫(yī)藥大學 研究生院， 南寧 530222； 2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 肝病一區(qū)， 南寧 530023

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在西方國家普通人群的發(fā)病率為20%～30%，在亞洲地區(qū)約為27.37%，而我國成人NAFLD的發(fā)病率在13%～43%[1-2]，并且呈逐年上升趨勢。NAFLD的發(fā)病機制現(xiàn)尚未完全闡明，但與環(huán)境、代謝及遺傳易感性等因素密切相關(guān)，囊括從單純性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)到肝硬化以及肝癌的一系列疾病[3]。外泌體是由多種細胞分泌的直徑在40～100 nm的盤狀膜性囊泡，攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸(miRNA、lncRNA和DNA)等活性成分，能介導細胞間的通訊，在多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用[4]。本文就外泌體對脂質(zhì)代謝，胰島素抵抗(IR)、慢性炎癥及肝纖維化的影響，探討外泌體與NAFLD之間的關(guān)系，為NAFLD的發(fā)病提供一些新的見解。

1 外泌體簡介

外泌體是胞內(nèi)多囊泡體與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質(zhì)中的雙層脂質(zhì)囊泡，可通過多種應(yīng)激條件誘導生成[5]。不同組織細胞來源的外泌體攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸不同，其所發(fā)揮的生物學效應(yīng)也不盡相同。外泌體廣泛存在并分布于各種體液中，以多種方式參與細胞間的通訊，包括直接的膜融合、受體介導的融合以及內(nèi)吞作用，將生物活性物質(zhì)輸送至靶細胞并激活細胞內(nèi)的信號通路，從而構(gòu)成了細胞-細胞間的信息傳遞系統(tǒng)，在細胞通訊、免疫應(yīng)答、細胞遷移、細胞分化等多種生理病理過程中承擔重要作用[4]。NAFLD的發(fā)病機制復雜，糖脂代謝紊亂引起的肝脂肪蓄積是首要原因，而由此引發(fā)的肝臟慢性炎癥及進行性肝纖維化則是其發(fā)展的重要因素。外泌體在NAFLD的發(fā)病、診斷和治療中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

2 外泌體與脂質(zhì)代謝

NAFLD以肝細胞的脂肪蓄積和脂肪變性為主要病理特征，脂質(zhì)代謝紊亂被認為是NAFLD發(fā)生的首要原因。肝臟參與脂質(zhì)代謝的許多重要環(huán)節(jié)，當體內(nèi)的脂肪酸(FA)超過肝臟的處理能力后，過多的脂質(zhì)將以甘油三脂(TG)的形式在肝細胞內(nèi)沉積，引起肝臟脂肪變性[6]。諸多研究證實，外泌體對脂質(zhì)代謝具有顯著影響，其中包含的生物活性分子在調(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成及分化中起著重要作用。因此深入了解外泌體對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用機制，對認識本病具有重要意義。

2.1 外泌體促進脂肪形成 哺乳動物不育系20樣激酶1(MST1)是脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)劑，已被鑒定為miR-199a-5p的靶基因。有研究[7]顯示，在高脂飲食誘導的脂肪變性小鼠模型中，脂肪組織內(nèi)高度表達的miR-199a-5p可經(jīng)外泌體轉(zhuǎn)運至肝臟，并通過抑制MST1的表達來影響SREBP-1c/AMPK信號級聯(lián)，上調(diào)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT1)和脂肪酸合酶(FASN)的表達，隨后刺激FA合成并抑制脂解途徑，最終導致細胞脂質(zhì)蓄積。而在肝臟中特異性表達的miR-122，則可通過與FASN和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的3′非翻譯區(qū)(3′URT)高度結(jié)合，影響血漿中TG、游離脂肪酸(FFA)及膽固醇的含量，從而增加脂肪的生物合成[8]。抵抗素是由脂肪細胞分泌的一種特異性細胞因子，以脂肪細胞外泌體的形式運送至肝細胞，通過抑制AMPKα信號傳導導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并促進肝臟中TG的合成而加劇肝脂肪變性[9]。在低氧條件下，源自脂肪細胞的外泌體還會通過增加FASN、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)及ACC等脂肪合成酶的水平來促進脂質(zhì)合成[8]。此外另有研究[10]表明，在腸黏膜嚴重損傷的小鼠中，高遷移率族蛋白1可由Toll樣受體4(TLR4)信號激活，通過腸外泌體從受損的腸上皮細胞釋放，以外泌體介導的非經(jīng)典藥物分泌途徑分泌，通過作用于肝臟，導致肝臟脂肪變性。

2.2 外泌體影響脂肪分化和棕色化 外泌體是脂肪分化的重要調(diào)控因子，在誘導脂肪干細胞(ADSCs)分化為成熟脂肪細胞中起重要作用。Wnt-1誘導分泌蛋白2是由脂肪組織分泌的一種新型脂肪因子，在前脂肪細胞中高度表達，具有抑制脂肪生成的作用，而miR-450a-5p是脂肪細胞來源外泌體(Ad-Exo)中最豐富的miRNA之一。Zhang等[11]研究表明，當Ad-Exo被ADSCs內(nèi)化后，其中富含的miR-450a-5p可通過與Wnt-1誘導分泌蛋白2的3′URT靶向結(jié)合來抑制其表達，從而促進脂肪分化。亦有研究[12]表明，無論是體外還是體內(nèi)實驗，用脂肪組織的外泌體樣囊泡處理ADSCs時均可導致脂肪滴的出現(xiàn)，并且脂肪形成基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ2(PPARγ2)、aP2及脂聯(lián)素的水平也會相應(yīng)升高。外泌體同樣可以通過調(diào)控白色脂肪棕色化來影響脂肪代謝。鐘瓊慧等[13]研究表明，ADSCs以外泌體的形式分泌miR-27并作用于脂肪組織，通過下調(diào)解耦聯(lián)蛋白1、PPARγ、含PR結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白16及PPARγ共激活因子1α等棕色化相關(guān)蛋白抑制白色脂肪棕色化，從而增加脂質(zhì)蓄積。此外不同組織細胞來源的外泌體中所富含的一些其他miRNAs(如miR-143、miR-192、miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-125b-5p等)在調(diào)控白色脂肪棕色化過程中同樣也發(fā)揮了重要作用[8]。由上可知，外泌體內(nèi)含有的多種功能性物質(zhì)可通過不同途徑影響脂肪代謝，對肝臟脂肪蓄積和脂肪變性起直接或間接的作用。

3 外泌體與IR

NAFLD的發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果，脂質(zhì)異常蓄積導致的肝臟脂肪變性常常是疾病的啟動因素，而IR則是NAFLD發(fā)展的核心環(huán)節(jié)[6]。脂肪組織作為一種高度動態(tài)的代謝器官，可通過分泌含有多種生物活性物質(zhì)的外泌體來調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和全身性胰島素敏感性，此外脂毒性物質(zhì)介導的巨噬細胞極化也是誘發(fā)IR的重要原因。

3.1 外泌體蛋白與IR Sonic Hedgehog(Shh)是一種外泌體蛋白，在脂肪細胞外泌體中高度表達，是控制巨噬細胞極化的關(guān)鍵因子。Song等[14]研究表明，攜帶Shh的脂肪細胞外泌體通過Ptch和PI3K途徑刺激巨噬細胞M1極化，當M1巨噬細胞浸潤到脂肪組織中后，可通過釋放外泌體來降低脂肪細胞中胰島素受體底物1和激素敏感性脂肪酶的表達，從而誘導IR。Deng等[15]進一步證明，M1巨噬細胞釋放的外泌體是促炎細胞因子的重要來源，其中的TNF和IL-6可以阻斷脂肪細胞中的胰島素作用，而IR的產(chǎn)生很可能是通過TLR4/TRIF途徑來完成的。Yuasa等[16]研究表明，與外泌體相關(guān)的鈣蛋白酶2可直接作用于胰島素受體并切割其β亞基，隨后γ-分泌酶對β亞基進行下一步的膜內(nèi)切割。兩種酶對胰島素受體的順序切割在直接抑制胰島素受體底物1的Akt磷酸化的同時也減少了酪氨酸的磷酸化，從而抑制胰島素信號傳導途徑，導致IR的發(fā)生。另有研究[17]表明，高脂飲食小鼠腸道上皮細胞外泌體的脂質(zhì)可發(fā)生明顯改變，從主要的磷脂酰乙醇胺變?yōu)榱字Ｄ憠A，當外泌體通過腸肝軸轉(zhuǎn)運至肝臟后，外泌體磷脂酰膽堿結(jié)合并激活在肝細胞中表達的芳香烴受體(AhR，一種調(diào)節(jié)胰島素反應(yīng)的蛋白質(zhì))，導致激活胰島素信號通路必不可少的基因(如IRS-2)及其下游基因PI3K/蛋白激酶B(Akt)被抑制，從而引發(fā)IR。

3.2 外泌體miRNAs與IR 外泌體中含有豐富的miRNA，可通過多種方式介導IR，在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。例如miRNA-93可通過抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的表達而導致IR[18]；miRNA-145可通過P65轉(zhuǎn)錄因子途徑導致肝細胞IR[19]；miRNA-27a可通過抑制IRS1、Akt及糖原合成酶激酶3β的磷酸化來阻斷胰島素信號通路，通過靶向PPARγ的表達來介導IR等[20]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirtuin1，SIRT1)是眾所周知的胰島素敏感基因，在IR中起重要調(diào)節(jié)作用。Su等[21]研究表明，老年小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)來源的外泌體中含有豐富的miR-29b-3p，當外泌體被脂肪細胞、肌細胞和肝細胞攝取后，其中的miR-29b-3p可與SIRT1 mRNA的3′URT直接結(jié)合并抑制其表達，通過miR-29b-3p/SIRT1依賴性方式介導IR。而另一項研究[22]也表明，在脂肪特異性SIRT1缺陷小鼠中，由自噬誘導釋放的外泌體可通過TLR4/NF-κB途徑損害胰島素敏感性。線粒體功能障礙對IR的形成有著重要影響，NADH脫氫酶泛醌1α亞復合物4是線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ(CⅣ)的一個組成部分，與線粒體功能密切相關(guān)。Tian等[23]研究表明，miR-210在高糖誘導的脂肪組織巨噬細胞衍生的外泌體中高表達，可通過抑制NADH脫氫酶泛醌1α亞復合物4基因的表達來影響CⅣ的活性，而CⅣ活性的受損可直接導致線粒體功能障礙，并通過β氧化途徑減少脂肪酸分解并抑制ATP產(chǎn)生，從而導致β細胞功能障礙和誘發(fā)IR。此外miRNA-155、miRNA-144、miRNA-29b、miRNA-29a、miRNA-222、miRNA-141-3p等miRNAs在全身性IR及糖脂代謝中也起著重要作用。由此可知，外泌體攜帶的蛋白質(zhì)及miRNAs在葡萄糖穩(wěn)態(tài)和IR的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用，弄清這些生物活性物質(zhì)起作用的靶點及通路，不僅有助于認識疾病的發(fā)生發(fā)展，對今后NAFLD的診斷、藥物開發(fā)和治療同樣具有啟發(fā)。

4 外泌體與肝臟炎癥

肝臟脂肪變性常常伴隨著肝細胞的壞死和脂毒性物質(zhì)的產(chǎn)生，由此引發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)則是NAFL向NASH進展的關(guān)鍵。巨噬細胞是脂肪駐留的免疫細胞中最豐富的類型，其數(shù)量和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。巨噬細胞具有高度的可塑性，從抗炎性M2型向促炎性M1型的轉(zhuǎn)換過程中，會產(chǎn)生促炎細胞因子，從而加劇炎癥反應(yīng)[24]。而外泌體作為細胞間信息交流的載體，在脂毒性物質(zhì)和巨噬細胞介導的炎癥中扮演了重要角色。

既往研究表明，膽固醇是NASH發(fā)病機理中的關(guān)鍵脂毒性分子，可影響溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等多種細胞器的功能。Zhao等[25]研究證明，過多的膽固醇會誘導溶酶體功能障礙并抑制多囊體的降解，使肝細胞釋放的外泌體增加，其中包含的肝臟特異性miR-122-5p可直接作用于巨噬細胞，促進巨噬細胞的M1極化，導致炎性細胞因子分泌增加。因此，改善溶酶體功能或抑制miR-122-5p可能是NASH的潛在治療策略。此外Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在高脂高膽固醇飲食誘導的大鼠脂肪性肝炎模型中，脂毒性肝細胞釋放的外泌體可誘導CD11b+和CD86+巨噬細胞的激活，同時促進誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-6和TNFα等炎性因子的釋放。而外泌體中富含的miR-192-5p可抑制Rictor蛋白的表達，通過促進叉頭框轉(zhuǎn)錄因子0亞族1的激活，來介導炎癥反應(yīng)的發(fā)生。另有研究[24]表明，在HFD喂養(yǎng)的小鼠中，成熟脂肪細胞分泌的外泌體高表達miR-34a，可經(jīng)旁分泌的形式轉(zhuǎn)運至巨噬細胞中，通過抑制Krüppel樣因子4的表達來抑制M2極化，從而誘導全身性炎癥的發(fā)生。

死亡受體5(DR5)信號通路在介導巨噬細胞的活化中也起著關(guān)鍵作用。Hirsoua等[27]證明，棕櫚酸酯(PA，一種有毒的飽和游離脂肪酸)可通過CHOP/DR5/caspase8/3信號級聯(lián)激活與鋅離子相關(guān)的RhoA蛋白1，從而導致肝細胞來源的外泌體釋放增加。外泌體中包含的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體可與巨噬細胞表面的同源配體DR5相互結(jié)合，通過NF-κB信號通路將巨噬細胞激活為促炎表型，誘導促炎性細胞因子(IL-1β和IL-6)的表達和釋放。此外亦有研究[28]證明，PA誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可通過IRE1a/XBP-1依賴性方式促進肝細胞外泌體釋放，脂毒性外泌體所富含的C16∶0神經(jīng)酰胺可介導1-磷酸鞘氨醇(S1P)的生成。S1P與巨噬細胞表面的1-磷酸鞘氨醇受體(S1PR)結(jié)合后，可激活巨噬細胞的趨化性，將巨噬細胞募集到肝臟，導致肝臟炎癥的產(chǎn)生。如上所述，外泌體介導的巨噬細胞活化和遷徙是肝臟炎癥損傷的重要推動力量，這不僅加速肝細胞死亡，而且還促進了肝臟纖維化的發(fā)展。因此，深入研究兩者的相互作用機制，抑制兩者之間的信息交流，對延緩甚至阻斷病情發(fā)展，具有至關(guān)重要的作用。

5 外泌體與肝纖維化

肝纖維化是慢性肝損傷期間細胞外基質(zhì)(ECM)過度產(chǎn)生并沉積，導致肝臟結(jié)締組織異常增生的一種病變過程，是NASH向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)之路[29]。肝星狀細胞(HSC)的激活受多種機制調(diào)控，是纖維化發(fā)展的關(guān)鍵步驟[30]?；罨腍SC可轉(zhuǎn)化為成纖維細胞并向肝臟遷徙，釋放大量ECM蛋白，導致肝纖維化的發(fā)生。越來越多的證據(jù)表明，外泌體在HSC的活化及肝纖維化的調(diào)控中起著重要作用。

活化的巨噬細胞不僅可以推動肝臟炎癥的發(fā)展，還可以釋放外泌體激活HSC，誘導纖維化的發(fā)生。Chen等[31]研究表明，源自脂多糖激活的THP-1巨噬細胞釋放的外泌體可以靶向HSC，外泌體富含的miR-103-3p通過與Krüppel樣因子4的3′URT結(jié)合而抑制其表達，從而誘導HSC增殖和活化。來源于HCV感染的肝細胞外泌體釋放增加，其攜帶的miR-192被傳遞到HSC中，通過增加轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達，來誘導HSC的活化[30]。此外，肝lncRNA-H19水平與纖維化嚴重程度也密切相關(guān)。Liu等[32]研究表明，膽管細胞衍生的外泌體中高表達H19，可優(yōu)先被HSC吸收。H19不僅增加G1/S細胞周期過渡來促進HSC的增殖和活化，而且在HSC衍生的成纖維細胞中上調(diào)了纖維化基因表達，促進ECM蛋白形成，從而誘導纖維化。另有研究[33]發(fā)現(xiàn)，用血管緊張素Ⅱ處理的人肝LX-2星狀細胞中，促炎細胞因子(IL-1β、IL-18和TNFα)和ECM蛋白(α-SMA、ColⅠ和ColⅢ)表達增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該結(jié)果的產(chǎn)生與凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)有關(guān)，用ASK1抑制劑GS-4997或siRNA預處理能夠逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ?qū)X-2細胞的影響。因此，從功能上抑制ASK1可能是治療肝纖維化的一種潛在途徑。

miR-122是肝細胞中含量最豐富的miRNA，占總miRNAs的70%。研究報道，miR-122在脂質(zhì)代謝和肝纖維化中具有雙重調(diào)控作用。在肝臟中，miR-122的高表達可以誘導脂質(zhì)合成增加，而miR-122的低表達則可導致纖維化的發(fā)生。Csak等[34]研究表明，miR-122可在多個步驟中影響肝纖維化。首先，在肝細胞中，miR-122的減少可導致缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的表達增加，HIF-1α作用于其靶基因賴氨酸氧化酶，通過參與膠原纖維和彈性纖維的交聯(lián)，促進ECM的形成。其次，miR-122的減少與促分裂原活化蛋白激酶3的增加有關(guān)，促分裂原活化蛋白激酶3與HIF-1α均可啟動內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,誘導上皮細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，促進肝纖維化的發(fā)生。最后，波形蛋白是HSC和成纖維細胞中細胞骨架的主要成分，miR-122的減少可促使波形蛋白表達增加，間接促進HSC的增殖和分化。所以，調(diào)節(jié)肝臟中miR-122的表達，對肝纖維化和脂質(zhì)代謝均具有重要意義。

6 小結(jié)

綜上所述，多種細胞來源的外泌體通過靶向釋放蛋白質(zhì)、miRNA及l(fā)ncRNA等生物活性分子介導細胞間信息傳導，在NAFLD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，阻斷致病性外泌體的分泌及其內(nèi)容物的釋放可能在NAFLD的治療過程中獲益[4]。此外，由于其穩(wěn)定的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，外泌體也可作為藥物運送的載體，參與疾病的治療[35]。在診斷方面，外泌體也顯示出了巨大的優(yōu)勢，其中所包含的miRNAs與疾病進展呈正相關(guān)[36]，可作為肝臟疾病的新型生物標志物。但就目前而言，外泌體所包含的生物活性分子及其與受體細胞的相互作用機制尚未完全闡明，作為一種新的治療和診斷工具尚處于開發(fā)的早期階段，從動物實驗到臨床運用，還需要進行更多的研究[5]。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：石清蘭、胡振斌負責課題設(shè)計，修改論文，指導撰寫文章并最后定稿；徐昆負責擬定寫作思路，資料分析，撰寫論文；張旭、李瑛負責收集整理數(shù)據(jù)。