陳張帆，王 潔，徐錫文，周 茜，陳松林

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；2.山東省海洋漁業(yè)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

先天免疫系統(tǒng)是生物體以非特異方式抵御病原體（包括細(xì)菌和病毒）入侵的首道屏障。作為先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，模式識(shí)別受體（pathogen／pattern recognition receptors，PRRs）通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），觸發(fā)免疫反應(yīng)（如炎癥反 應(yīng)）［1］。NOD樣受體家族（NOD-like receptors，NLRs）是一類(lèi)識(shí)別胞內(nèi)PAMPs的PRR，在機(jī)體的抗細(xì)菌和抗病毒的免疫應(yīng)答中起著重要的調(diào)控作用［2］。目前，在人類(lèi)基因組中已鑒定出22個(gè)NLR蛋白，這些蛋白都具有NLR家族保守的結(jié)構(gòu)域：N末端的效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域，通常包含熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYR）、半胱天冬氨酸募集結(jié)構(gòu)域（CARD）等；C末端的亮氨酸重復(fù)序列（LRR），主要含有配體結(jié)合位點(diǎn)；中段最保守的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NACHT），用于自身低聚反應(yīng)和自我調(diào)控［3-4］。

根據(jù)功能域的不同，魚(yú)類(lèi)的NLRs主要分為3個(gè)亞家族：NLR-A（與哺乳動(dòng)物的NODs同源）、NLR-B（與哺乳動(dòng)物的NALPs同源）、NLR-C（魚(yú)類(lèi)特有）［3］。魚(yú)類(lèi)中的NLR-C亞家族除了具有NLR家族保守的NACHT和LRR結(jié)構(gòu)域外，還具有N末端魚(yú)類(lèi)特有的FISNA（fish-specific NACHT associated）結(jié)構(gòu)域，和／或具有C末端的B30.2結(jié)構(gòu)域。B30.2結(jié)構(gòu)域包含絲氨酸-脯氨酸-精氨酸-酪氨酸模體（SPRY）和脯氨酸-精氨酸-酪氨酸模體（PRY），已被證實(shí)參與調(diào)控哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)［5］。目前，已在斑馬魚(yú)（Danio rerio）［3］、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［6］、牙 鲆（Paralichthysolivaceus）［7］、鮸（Miichthys miiuy）［8］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［9］中報(bào)道了NLR-C亞家族基因的克隆，并發(fā)現(xiàn)NLR-C基因表達(dá)量受LPS和poly I∶C刺激后升高，參與調(diào)控魚(yú)體的先天免疫反應(yīng)。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）是我國(guó)重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、生長(zhǎng)速率快、活動(dòng)范圍小等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者歡迎，養(yǎng)殖前景廣闊［10］。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，病害頻發(fā)，半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展受到嚴(yán)重制約。其中，哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）是引起半滑舌鰨細(xì)菌性疾病的主要病原菌之一，發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為體表皮膚潰爛、爛尾、爛鰭等［11］。為了探究半滑舌鰨抗哈維氏弧菌病的分子機(jī)制，研究人員對(duì)免疫相關(guān)基因進(jìn)行了研究，如Toll樣受體［12］、趨化因子［13］、多聚免疫球蛋白受體［14］、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子［15］等。前期研究中，通過(guò)生物信息學(xué)分析鑒定分析了半滑舌鰨NLR基因家族29個(gè)成員，其中，CsNOD3和CsNOD4基因?qū)S氏弧菌感染表現(xiàn)出快速應(yīng)答模式［16］，CsCIITA參與了半滑舌鰨抗哈維氏弧菌的免疫反應(yīng)，并直接調(diào)控MHC IIA和MHC IIB基因的表達(dá)［17］。本研究通過(guò)克隆分析半滑舌鰨的CsNLRC6和CsNLR-C7基因，檢測(cè)其在健康組織中的分布模式，以及其在不同感染組織中對(duì)哈維氏弧菌的響應(yīng)模式，以期為探討NLR基因家族在半滑舌鰨、乃至硬骨魚(yú)類(lèi)的先天免疫系統(tǒng)中的重要作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

4尾健康半滑舌鰨［平均體質(zhì)量（31.0±6.5）g；平均體長(zhǎng)（17.1±1.0）cm］購(gòu)自山東海陽(yáng)市黃海水產(chǎn)有限公司，解剖收集鰓、心臟、頭腎、腸、腎臟、肝臟、肌肉、皮膚、脾臟、胃等組織樣品，置于-80℃凍存，用于總RNA的提取。

哈維氏弧菌感染實(shí)驗(yàn)參考WEI等［18］的實(shí)驗(yàn)方法，即另取相同來(lái)源60尾10月齡生長(zhǎng)狀態(tài)良好的半滑舌鰨，經(jīng)腹腔注射1.0×104cfu哈維氏弧菌。以感染前0 h作為對(duì)照，在注射12、24、48、72、96 h后，分別在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取樣5尾魚(yú)，解剖收集腎臟、鰓、腸、脾臟和肝臟組織，置于-80℃凍存，用于總RNA的提取。

1.2 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

采用TRIzol試劑（Invitrogen，美國(guó)）提取總RNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，并用超微量分光光度計(jì)P100（Pultton，美國(guó)）檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量。采用PrimerScriptTM RT reagent kit（TaKaRa，中國(guó)大連）進(jìn)行痕量基因組DNA的去除以及cDNA第一鏈的合成。

1.3 獲得CsNLR-C6和CsNLR-C7基因核心片段序列

基于InterProScan［19］對(duì)半滑舌鰨基因組［10］進(jìn)行蛋白功能域的預(yù)測(cè)結(jié)果，以NLR基因家族保守的NACHT結(jié)構(gòu)域和魚(yú)類(lèi)NLR-C家族特有的FISNA結(jié)構(gòu)域進(jìn)行搜索，篩選出16個(gè)半滑舌鰨NLR-C基因［16］，其中根據(jù)CsNLR-C6和CsNLR-C7的cDNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增其開(kāi)放閱讀框（ORF）序列的特異性引物（表1），采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的條帶，PCR反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，3 min；95℃，30 s，58℃，30 s，72℃，2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，純化并克隆到pEASY-T1載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，挑取陽(yáng)性克隆送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司（青島）進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 CsNLR-C6和CsNLR-C7基因序列分析

利用DNAMAN軟件包對(duì)克隆得到的CsNLRC6和CsNLR-C7的核酸和氨基酸進(jìn)行序列比對(duì)。通過(guò)ExPaSy ProtParam工具（http：／／web.expasy.org／protparam）對(duì)其分子量（Mw）和等電點(diǎn)（pI）進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用SMART預(yù)測(cè)CsNLR-C6和CsNLRC7的蛋白結(jié)構(gòu)域，與CsNOD1-5蛋白序列的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)分析。從NCBI上搜索人類(lèi)（Homo sapiens）、斑馬魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）、半滑舌 鰨NOD1、NOD2、NOD3（NLRC3）、NOD4（NLRC5）、NOD5（NLRX1）及同源序列（表2），利用在線服務(wù)器GUIDANCE2 Server（http：／／guidance.tau.ac.il／）［20］，選 擇MAFFT算法（默認(rèn)參數(shù)值）［21］進(jìn)行多重氨基酸序列比對(duì)，使用IQ-TREE軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（-B1000-alrt 1000）［22］。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

基于克隆得到的CsNLR-C6和CsNLR-C7基因的核心片段序列，用Primer3（https：／／primer3.ut.ee／）設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（表1），選用β-actin為內(nèi)參基因。以4尾健康半滑舌鰨各個(gè)組織的cDNA為模板，檢測(cè)兩個(gè)基因的組織表達(dá)量；并以感染哈維氏弧菌后0、12、24、48、72、96 h的5條半滑舌鰨腎臟、鰓、腸、脾臟和肝臟組織的cDNA為模板，檢測(cè)哈維氏弧菌感染后兩個(gè)基因的表達(dá)量變化。使用SYBR?Premix ExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa，中國(guó)大連）進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序設(shè)置如下：95℃，30 s；95℃，3 s，60℃，33 s，40個(gè)循環(huán)；95℃，15 s；60℃，60 s；95℃，15 s。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法，即2-ΔΔCt法，經(jīng)計(jì)算得到CsNLRC6和CsNLR-C7基因的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表現(xiàn)表達(dá)量變化倍數(shù)。使用IBM?SPSS?統(tǒng)計(jì)平臺(tái)（V.19.0）進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Turkey多重比較分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsNLR-C6和CsNLR-C7基因的ORF序列分析

以半滑舌鰨混合組織為模板，擴(kuò)增得到CsNLR-C6和CsNLR-C7基因的ORF序列（GenBank登 錄 號(hào) 分 別 為：MZ753812，MZ753813）。其中，CsNLR-C6的ORF為3234 bp，編碼1078個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白相對(duì)分子量Mw為120.64 kDa，理論等電點(diǎn)pI為6.50；CsNLR-C7的ORF為2961 bp，編碼987個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白相對(duì)分子量Mw為112.68 kDa，理論等電點(diǎn)pI為6.04。SMART軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，兩個(gè)蛋白均含有1個(gè)FISNA結(jié)構(gòu)域，1個(gè)NACHT結(jié)構(gòu)域，1個(gè)B30.2（PRY／SPRY）結(jié)構(gòu)域；此外，CsNLR-C6包含5個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域（圖1-A），而CsNLR-C7包含4個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域（圖1-B）。半滑舌鰨NLR-A亞家族（NOD1-5）均含有NACHT結(jié)構(gòu)域，并在靠近3′端含有數(shù)量不等的LRR結(jié)構(gòu)域（圖2）。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨NLR-C6和NLR-C7含有保守的NACHT結(jié)構(gòu)域和LRR結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明NACHT結(jié)構(gòu)域和LRR結(jié)構(gòu)域廣泛地存在于半滑舌鰨NLR家族中，而FISNA結(jié)構(gòu)域和B30.2結(jié)構(gòu)域是半滑舌鰨NLR-C亞家族特有的。

圖1 半滑舌鰨CsNLR-C6（A）和CsN LR-C7（B）ORF及其氨基酸序列Fig.1 The ORFs and deduced amino acid sequences of CsNLR-C6 and CsNLR-C7

圖2 半滑舌鰨NLR家族的功能域分析Fig.2 Functional domain analysis of NLR family in Cynoglossus semilaevis

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

為了探究CsNLR-C6和CsNLR-C7在脊椎動(dòng)物中的進(jìn)化關(guān)系，使用IQ-TREE軟件對(duì)人類(lèi)、斑馬魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)和半滑舌鰨的NOD1-5以及NLR-C構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。在進(jìn)化樹(shù)上，這些蛋白被分成了6個(gè)進(jìn)化枝：NOD1、NOD2、NOD3、NOD4、NOD5以 及NLR-C。CsNLR-C6、CsNLR-C7與尼羅羅非魚(yú)、斑馬魚(yú)的NLR-C組成一支，與NOD3的進(jìn)化關(guān)系較近。而在其余的進(jìn)化枝中，半滑舌鰨、尼羅羅非魚(yú)與斑馬魚(yú)的進(jìn)化地位均較為接近。

圖3 NLR家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of NLR family in representative species

2.3 CsNLR-C6和CsNLR-C7基因的組織表達(dá)分析

為了檢測(cè)CsNLR-C6和CsNLR-C7基因在健康魚(yú)體組織中的表達(dá)分布，采用qPCR方法檢測(cè)了這兩個(gè)基因在心臟、肝臟、頭腎、鰓、腦、腎、皮膚、脾、胃和肌肉組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明（圖4），CsNLR-C6在免疫相關(guān)組織如鰓、腸、皮膚、脾中具有較高的表達(dá)量，而CsNLR-C7在免疫相關(guān)組織如鰓、頭腎、肝中具有較高的表達(dá)量。這兩個(gè)基因在肌肉組織中的表達(dá)量均較低。

圖4 CsNLR-C6（A）和CsNLR-C7（B）在半滑舌鰨健康組織中的表達(dá)模式Fig.4 Expression profiling of CsNLR-C6（A）and CsNLR-C7（B）in normal tissues of Cynoglossus semilaevis

2.4 哈維氏弧菌侵染半滑舌鰨后CsNLR-C6和CsNLR-C7基因的表達(dá)分析

為了探究CsNLR-C6和CsNLR-C7基因?qū)S氏弧菌感染的響應(yīng)模式，以0 h為對(duì)照，分析了這兩個(gè)基因在哈維氏弧菌感染12 h、24 h、48 h、72 h和96 h后鰓、腸、腎臟、脾臟和肝臟組織中的表達(dá)模式變化。結(jié)果如圖5所示，CsNLR-C6和CsNLR-C7基因在不同組織中的表達(dá)模式并不完全一致。在腸和脾中，兩個(gè)基因的表達(dá)量均在感染48 h后顯著上調(diào)（P＜0.05）；在鰓和腎臟中，CsNLR-C6基因的表達(dá)量分別在感染48 h和感染12 h后顯著上調(diào)（P＜0.05），而CsNLR-C7基因的表達(dá)量均在感染12 h后顯著下降（P＜0.05）。而在這兩個(gè)組織中，CsNLR-C7基因在感染24 h后呈現(xiàn)出不同趨勢(shì)：在鰓中，CsNLR-C7基因表達(dá)量持續(xù)維持在相比0 h顯著降低的水平上；而在腎臟中，CsNLR-C7基因表達(dá)量有所升高，并在感染48 h后較0 h提高（1.70±0.28）倍（P＜0.05），之后又漸漸回落至正常水平。在肝臟中，CsNLR-C6基因的表達(dá)量在感染12 h后有所升高，但與0 h相比并無(wú)顯著差異，之后一直維持在穩(wěn)定水平上；而CsNLR-C7基因的表達(dá)量在感染48 h后顯著升高（P＜0.05）。

圖5 半滑舌鰨CsNLR-C6和CsNLR-C7在哈維氏弧菌感染后鰓（A）、腸（B）、腎（C）、脾（D）、肝（E）的表達(dá)模式變化Fig.5 Expression profiling of CsNLR-C6 and CsNLR-C7 in gill（A），intestine（B），kidney（C），spleen（D），and liver（E）at different time after V.harveyi infection

3 討論

胞內(nèi)NOD樣受體是炎癥小體復(fù)合物的主要組成部分，主要作用為保護(hù)機(jī)體免受外來(lái)微生物病原的侵害［23］。本研究對(duì)半滑舌鰨中NOD樣受體家族中的CsNLR-C6和CsNLR-C7進(jìn)行了克隆和表達(dá)分析。通過(guò)功能域預(yù)測(cè)，這兩個(gè)蛋白都含有NOD樣受體家族保守的NACHT結(jié)構(gòu)域，并含有4～5個(gè)包含配體結(jié)合位點(diǎn)的LRR結(jié)構(gòu)域。CsNLR-C6與CsNLR-C7包含不同數(shù)量的LRR結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明它們可能結(jié)合不同類(lèi)型的病原體。此外，與其他NOD亞家族不同的是，CsNLR-C6和CsNLR-C7還具有C端的FISNA結(jié)構(gòu)域和N端的B30.2結(jié)構(gòu)域。FISNA結(jié)構(gòu)域?yàn)轸~(yú)類(lèi)特有的NACHT類(lèi)子結(jié)構(gòu)域，但其功能還不清楚［24］。三分模體包含蛋白和含熱蛋白結(jié)構(gòu)域分子中的B30.2結(jié)構(gòu)域已被證實(shí)可與配體結(jié)合，從而調(diào)控先天免疫反應(yīng)［25-26］。鮸中18個(gè)含B30.2結(jié)構(gòu)域的NLR-C亞家族基因可識(shí)別病原體入侵，并在抗病毒免疫應(yīng)答過(guò)程中起到重要作用［8］。因此，半滑舌鰨可能通過(guò)NLR-C的FISNA、NACHT、LRR和B30.2結(jié)構(gòu)域的協(xié)同工作，識(shí)別病原體并啟動(dòng)相關(guān)的免疫信號(hào)通路。

在系統(tǒng)進(jìn)化分析中，CsNLR-C6、CsNLR-C7與其他魚(yú)類(lèi)的NLR-C蛋白聚類(lèi)。相比其他NOD亞家族，NLR-C與NOD3的進(jìn)化關(guān)系較近，這與斑馬魚(yú)、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）NLR-C的進(jìn)化分析結(jié)果一致［3，23］，說(shuō)明NLR-C與NOD3有最近的共同祖先（most recent common ancestor）。

NOD樣受體家族基因廣泛分布在哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)的各個(gè)組織中。作為NOD樣受體家族成員，CsNLR-C6和CsNLR-C7在半滑舌鰨的各個(gè)組織中均有表達(dá)，但CsNLR-C6在鰓、腸、皮膚、脾中有較高表達(dá)，而CsNLR-C7在鰓、頭腎、肝中有較高表達(dá)。鰓、腸、皮膚是黏膜相關(guān)淋巴組織，具有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，是魚(yú)體抵御病原微生物的有效防線［27］。頭腎、脾臟、肝都是參與魚(yú)類(lèi)先天免疫的重要器官：頭腎承擔(dān)了造血和內(nèi)分泌的功能；脾臟具有造血和免疫功能，在體液免疫和炎癥反應(yīng)中起到重要作用；肝幫助魚(yú)體抵御外源異物侵害［28-29］。兩個(gè)基因在這些組織高表達(dá)，表明了它們具有重要的免疫功能，但不同的組織表達(dá)模式說(shuō)明CsNLR-C6和CsNLR-C7可能在半滑舌鰨免疫應(yīng)答中起到不同的作用。大菱鲆的兩個(gè)NLR-C基因在不同的組織中也表現(xiàn)出不同的表達(dá)水平，NLR-C3a在鰓和頭腎中高表達(dá)，而NLR-C3b在血液、脾和頭腎中表達(dá)量較高［9］。此外，NLR-C基因在不同魚(yú)類(lèi)中的組織表達(dá)模式不盡相同。牙鲆的NLR-C基因在腎、鰓和血液中高表達(dá)［7］；鯉（Cyprinus carpio）的NLR-C基因在血液、脾和鰓中高表達(dá)［30］；斑馬魚(yú)的NLR-C基因在肝、腸和脾中高表達(dá)［3］。這些研究結(jié)果表明，NLR-C基因表達(dá)在不同種屬的魚(yú)類(lèi)中具有一定的組織特異性。

目前已有研究表明，魚(yú)類(lèi)NLR-C基因?qū)?xì)菌感染具有快速響應(yīng)模式。在哈維氏弧菌感染的紅鰭東方鲀頭腎組織中，NLR-C10和NLR-C12的表達(dá)量分別在感染后4 h和12 h顯著升高［23］。鰻弧菌感染鯉的腸、皮膚、肝、脾和頭腎組織中，NLR-C基因的表達(dá)量在3～6 h內(nèi)均有顯著升高［30］。在鰻弧菌感染的鮸脾臟組織中，NLR-C39和NLR-C40的表達(dá)量呈現(xiàn)不同應(yīng)答模式：NLRC39的表達(dá)量在感染后24 h顯著降低，隨后在48 h內(nèi)恢復(fù)并顯著升高；而NLR-C40的表達(dá)量則在感染后顯著升高，在24 h達(dá)到峰值［8］。本研究檢測(cè)了半滑舌鰨鰓、腸、腎、脾、肝組織中CsNLR-C6和CsNLR-C7在哈維氏弧菌感染后的表達(dá)量變化。結(jié)果表明，兩個(gè)基因在不同組織中呈現(xiàn)出對(duì)哈維氏弧菌感染不同的響應(yīng)模式。在腸和脾中，兩個(gè)基因的表達(dá)量都在感染后48 h內(nèi)顯著升高，表明CsNLR-C6和CsNLR-C7都參與了半滑舌鰨抗哈維氏弧菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)。在腎臟中，CsNLR-C6基因響應(yīng)更快，在感染后12 h內(nèi)其表達(dá)量就顯著升高，并持續(xù)升高，在感染后24 h至96 h內(nèi)一直保持在較高的水平，說(shuō)明腎臟一直處于哈維氏弧菌感染的應(yīng)答狀態(tài)；在肝中，CsNLRC7則表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的響應(yīng)，其表達(dá)量在感染后48 h內(nèi)顯著升高。而在鰓中，兩個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)相反，CsNLR-C6隨著哈維氏弧菌侵染表達(dá)逐漸升高，而CsNLR-C7隨哈維氏弧菌感染表達(dá)降低，并一直處于較低水平，說(shuō)明兩個(gè)基因?qū)τ邛w中免疫反應(yīng)的應(yīng)答模式不同。在哈維氏弧菌感染的半滑舌鰨腎臟中，CsNOD1、CsNOD2和CsNOD3、CsNOD4也呈現(xiàn)出相反的應(yīng)答模式［16］。

本研究克隆了半滑舌鰨CsNLR-C6和CsNLRC7的ORF，分析其結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化地位，并對(duì)其組織表達(dá)模式和感染哈維氏弧菌后在不同組織中的應(yīng)答模式進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，CsNLRC6和CsNLR-C7基因均參與了半滑舌鰨抗哈維氏弧菌的免疫反應(yīng)，這為今后魚(yú)類(lèi)特有的NLR-C基因家族在魚(yú)類(lèi)先天免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。