包 錟，劉一萌，來琦芳，么宗利，周 凱，高鵬程

（1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，鹽堿水域漁業(yè)工程技術研究中心，上海 200090）

我國約有4.6×105km2的低洼鹽堿水域和約占全國湖泊面積55%的咸水湖泊［1］，近年來利用鹽堿水開展水產(chǎn)養(yǎng)殖逐漸增多。貝類以攝食水中的藻類和有機碎屑為主［2-5］，在鹽堿水域混養(yǎng)貝類對鹽堿水的利用具有積極意義。鹽度是鹽堿生境中最主要的脅迫因子，也是水生動物面臨最常見最主要的環(huán)境因子之一，在鹽堿水環(huán)境生活的貝類會受到鹽度帶來的脅迫。

雙殼貝類在受到脅迫時會將殼緊閉以盡量減少機體與外界環(huán)境中的離子交換，這種保護機制在砂海螂（Mya arenaria）、淺溝蛤（Scrobicularia plana）、紫貽貝（Mytilus edulis）、鳥蛤（Cardium edule）、硬殼蛤（Mercenaria mercenaria）、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）、泥蚶（Tegillarca granosa）、魁蚶（Anadara broughtonii）、毛 蚶（Scapharca subcrenata）等雙殼貝類中均有發(fā)現(xiàn)［6-9］。由于雙殼貝類閉殼可以存活很長時間，且很難觀察其生存情況，因此急性毒性實驗無法快速判定雙殼貝類對脅迫的耐受能力，如何選擇快速有效的實驗方法科學評價其對脅迫的耐受性能，需要進行相關探究。

攝食率（ingestion rate）可以反映濾食性貝類生理活動情況，常作為貝類受到脅迫時生物能量方面的重要參數(shù)［10］；鹽度變化伴隨著Na＋、K＋、Mg2＋和Ca2＋等陽離子和Cl-、、和等陰離子的濃度變化，鰓作為主要離子和滲透調節(jié)器官，鰓ATP酶在受到鹽度脅迫時發(fā)揮著重要作用。Na＋／K＋-ATP酶，又稱鈉鉀泵（sodium-potassium pump），正常狀態(tài)下與質膜內側Na＋、Mg2＋結合后被激活，使ATP分解，每分解1個ATP分子運進3個Na＋和2個K＋［11-12］。有研究表明，鹽度發(fā)生變化時巖扇貝（Crassadoma gigantea）、泥蚶、魁蚶、文蛤（Meretrix meretrix）、青蛤（Cyclina sinensis）等雙殼貝類鰓Na＋／K＋-ATP酶均有顯著變化［8-9，13-15］。Ca2＋-ATP酶，又稱鈣泵（calcium pump），受到鹽度脅迫時能將Ca2＋從細胞質基質中逆濃度梯度運送到細胞外或者內質網(wǎng)腔，使細胞質基質中Ca2＋濃度保持在低水平，這一過程與肌肉放松有關［12］。EKA等［16］認為，Mg2＋-ATP酶的底物是MgATP，游離ATP和Mg2＋是具有雙重作用的酶修飾劑，Mg2＋-ATP酶每分解1個ATP轉運1個Mg2＋。許多研究證明，鹽度變化與水生動物Na＋／K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP酶以及Mg2＋-ATP酶的活力變化具有相關性［17-20］。

河蜆（Corbicula fluminea）是一種常見的淡水廣鹽性雙殼貝類，隸屬于軟體動物門（Mollusca），瓣 鰓 綱（Lamellibranchia），真 鰓 瓣 目（Eulamellibranchia），蜆科（Corbiculidae），蜆屬，在淡水、湖泊、河口潮間帶等水域有廣泛分布，對鹽度變化有較強的適應能力。本文以河蜆為實驗對象，模擬不同鹽度脅迫，觀察河蜆攝食率、鰓Na＋／K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP酶和Mg2＋-ATP酶的活力變化，評估河蜆的耐鹽性能，篩選適宜評價貝類耐鹽性能的指示指標，探索雙殼貝類脅迫耐受性能評價方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其暫養(yǎng)

實驗用河蜆采自江蘇東臺河道（120°33′E、33°26′N），使用500 L聚乙烯塑料桶進行暫養(yǎng)1個月以上，持續(xù)充氣，每天更換經(jīng)曝氣24 h的過濾自來水，換水量為三分之一，水溫（20.5±0.2）℃，pH（8.06±0.07），溶氧（6.65±0.34）mg·L-1，每天上午和下午各投喂一次球等鞭金藻（Isochrysis galbana）、叉鞭金藻（Dicrateriasp.）和角毛藻（Chaetocerossp.）按1∶1∶1富集后的混合物。挑選殼長（3.44±0.35）cm、殼寬（2.75±0.13）cm、殼高（1.80±0.12）cm的個體用于后續(xù)實驗。

1.2 攝食率實驗

1.2.1 鹽度設置

實驗設置8個鹽度梯度，分別為鹽度3、5、8、10、13、15、20和25，以淡水為對照組，另外本實驗還設置了無貝對照組，以消除藻類繁殖和沉降對藻類計數(shù)的影響。實驗用淡水為經(jīng)凈水器（開能，AC／KDF-150 C型）過濾的自來水，鹽度實驗用水由海水素（青島海科通用海水素有限公司）和過濾自來水配制而成。每個處理組設置3個平行。

1.2.2 實驗管理

實驗在聚乙烯塑料箱（37.5 cm×27.5 cm×14.0 cm）中進行，實驗水體為10 L，每個處理組投放河蜆3個。河蜆在實驗水體中穩(wěn)定3 h后開始實驗。每個處理組投喂混合藻類（球等鞭金藻、叉鞭金藻和角毛藻），水體藻類濃度為（3.5±0.3）×104個·mL-1，實驗持續(xù)24 h，每小時用吸管隨機取樣5 mL后用魯戈氏液固定，光鏡下用血球計數(shù)板對藻類計數(shù)，重復3次。實驗結束后將河蜆軟體部取出并在60℃烘箱中烘干至恒重（精確到0.001 g）（表1）。

表1 攝食率各組河蜆軟體平均干重Tab.1 Average dry weight of Corbicula fluminea in each ingestion rate test group

1.2.3 攝食率計算

藻類濃度變化系數(shù)（S）根據(jù)下式計算：

式（1）中：t為實驗時間（h），Cc0為無貝組水體中藻類的初始濃度（個·mL-1），Cct為t小時后無貝組水體中藻類濃度（個·mL-1）。

河蜆攝食率（R）根據(jù)下式計算：

式（2）中：R為攝食率（個·h-1），V為實驗水體量（L），N為實驗貝個數(shù)，Ce0為實驗水體中藻類的初始濃度（個·mL-1），Cet為t小時后實驗水體藻類濃度（個·mL-1），S為無貝組藻類濃度變化系數(shù)，由式（1）計算所得。

為消除河蜆個體質量對攝食率的影響，將獲得的數(shù)據(jù)通過下式轉換為1 g標準下的攝食率（Rs）：

式（3）中：Rs為1 g標準下的值［個·（g·h）-1］；W為軟體干重（g）；b為重量指數(shù)，參照呂昊澤等［21］的研究，取0.62；R為攝食率（個·h-1），由式（2）計算所得。

1.3 酶活實驗

1.3.1 鹽度設置

參照河蜆攝食率結果，選取3個鹽度梯度，分別為5（S5）、15（S15）和25（S25）。設置淡水為對照組（control），實驗用水同1.2.1。每個處理組設置3個平行。

1.3.2 實驗管理

實驗在聚乙烯塑料箱中進行，實驗水體為10 L，每個梯度設置3個重復，每個處理組投放河蜆10個。實驗期間每天投喂混合藻類2次，水體藻類濃度為（3.5±0.3）×104個·mL-1，并在投喂后3 h進行換水，換水量為三分之一，持續(xù)脅迫7 d。每天隨機選取各鹽度組中3個河蜆個體，參照林崗等［22］實驗方法采集新鮮鰓組織樣品制成2%組織勻漿，-80℃保存，待測。ATP酶活力單位定義：每小時每毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個ATP酶活力單位，即μmolPi／mgprot／hour（U·mgprot-1）。具體操作參照南京建成生物工程研究所的考馬斯亮藍試劑盒（A045-2）和ATP酶試劑盒（A016-1）說明書。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用統(tǒng)計軟件SPSS 20進行統(tǒng)計分析，用one-way ANOVA進行單因素方差分析，若差異顯著，用Tukey檢驗進行多重比較，分析顯著性水平為P＜0.05，極顯著性水平為P＜0.01。所得數(shù)據(jù)以3個平行組數(shù)據(jù)的平均值±標準差表示，并使用Origin9制圖。

2 結果與分析

2.1 鹽度脅迫對河蜆攝食率的影響

如圖1所示，河蜆攝食率隨鹽度的升高而下降。多重比較后發(fā)現(xiàn)，鹽度3組攝食率與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），鹽度5、15和25組河蜆攝食率均有極顯著降低（P＜0.01）。分別為2.11×108個·（g·h）-1、1.09×108個·（g·h）-1和7.68×107個·（g·h）-1。

圖1 鹽度脅迫下河蜆攝食率的變化Fig.1 Changes of ingestion rate of Corbicula fluminea under salinity stress

2.2 鹽度脅迫下河蜆鰓Na＋／K＋-ATP酶活力變化

與對照組相比，不同鹽度脅迫下鹽度5和15組Na＋／K＋-ATP酶活力變化趨勢相似，1 d時酶活力極顯著降低（P＜0.01），之后逐步上升至4 d達到最高（P＜0.01），分別為8.53 U·mgprot-1和7.30 U·mgprot-1。從5 d開始，酶活力恢復到初始值附近，并保持穩(wěn)定（P＞0.05）；鹽度25組雖然在1 d時酶活力也極顯著降低（P＜0.01），之后均與各組相比無顯著差異（P＞0.05），7 d時出現(xiàn)大量死亡，存活率僅19%（圖2），存活的河蜆酶活力基本穩(wěn)定在初始值附近（圖3），其余各組在各時間點內均沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

圖2 鹽度脅迫下河蜆的存活率Fig.2 Survival rate of Corbicula fluminea under salinity stress

圖3 鹽度脅迫下河蜆鰓Na＋／K＋-ATP酶的活力變化Fig.3 Changes of Na＋／K＋-ATPase activity in gill of Corbicula fluminea under salinity stress

2.3 鹽度脅迫下河蜆鰓Ca2＋-ATP酶活力變化

與對照組相比，不同鹽度脅迫下鹽度5和15組Ca2＋-ATP酶活力變化趨勢相似，2 d時酶活力極顯 著 降 低（P＜0.01），分 別 為3.04 U·mgprot-1和3.28 U·mgprot-1，之后逐步上升，4 d時達到峰值，分別為6.26 U·mgprot-1和6.66 U·mgprot-1，7 d時恢復到初始值附近（P＞0.05）；鹽度25組除1 d、2 d和5 d時極顯著降低（P＜0.01），其余時間點酶活力均在初始值附近（P＞0.05）（圖4）。

圖4 鹽度脅迫下河蜆鰓Ca2＋-ATP酶的活力變化Fig.4 Changes of Ca2＋-ATPase activity in gill of Corbicula fluminea under salinity stress

2.4 鹽度脅迫下河蜆鰓Mg2＋-ATP酶活力變化

與對照組相比，不同鹽度脅迫下鹽度5和15組Mg2＋-ATP酶活力變化趨勢相似，1 d時酶活力極顯 著 降 低（P＜0.01），分 別 為5.07 U·mgprot-1和4.55 U·mgprot-1，4 d時極顯著升高并達到峰值（P＜0.01），分別為9.91 U·mgprot-1和8.64 U·mgprot-1，從5 d開始，酶活力恢復到初始值附近，并保持穩(wěn)定（P＞0.05）；鹽度25組除1 d和3 d時極顯著降低（P＜0.01），其余時間點酶活力均穩(wěn)定在初始值附近（P＞0.05）（圖5）。

圖5 鹽度脅迫下河蜆鰓Mg2＋-ATP酶的活力變化Fig.5 Changes of Mg2＋-ATPase activity in gill of Corbicula fluminea under salinity stress

3 討論

3.1 鹽度脅迫對河蜆攝食率的影響

本實驗結果表明，河蜆攝食率與鹽度呈負相關。河蜆在進行鹽度脅迫時，攝食率在鹽度5、15和25出現(xiàn)了相較于上一鹽度極顯著下降的現(xiàn)象。鹽度5組攝食率相較于對照組下降了18%，推測鹽度5對河蜆產(chǎn)生了脅迫；鹽度15組河蜆攝食率相較于對照組下降了58%，背角無齒蚌（Anodonta woodiana）［23］在鹽度10脅迫下攝食率下降約50%，并開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，雖然河蜆鹽度15脅迫7 d未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，但鹽度25脅迫下河蜆攝食率極低，7 d后出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，推測鹽度25已超出河蜆耐鹽極限，河蜆耐鹽臨界值在鹽度15附近。鹽度脅迫下由于貝類閉殼，導致攝食率下降，當攝食率下降超過50%時，提示著該鹽度已超出貝類鹽度耐受范圍。另外，海水貝類文蛤和青蛤［24］在經(jīng)過鹽度5急性脅迫后攝食率相較于鹽度15和20組也嚴重下降，因此攝食率是可以作為比較快速地體現(xiàn)雙殼貝類耐鹽性能的生理指標，攝食率下降比例與耐鹽范圍有一定相關性。

3.2 鹽度脅迫對河蜆鰓ATP酶的影響

本實驗中，鰓Na＋／K＋-ATP酶活力升高后恢復至正常水平，推測部分水生動物在高鹽脅迫后，可以通過Na＋／K＋-ATP酶活力在4 d左右時升高，積極進行離子調節(jié)，以此建立一種勢能儲備，供細胞其他耗能過程利用［12］。泥蚶［9］在鹽度4脅迫、魁蚶稚貝［8］在鹽度15脅迫時同樣出現(xiàn)4 d升高、5 d恢復的現(xiàn)象；青鳉（Oryzias latipes）和凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）［25-26］在鹽度脅迫下鰓Na＋／K＋-ATP酶活力也出現(xiàn)相似的現(xiàn)象。推測水生生物鹽度脅迫后可能有4 d的適應調節(jié)期，貝類鰓Na＋／K＋-ATP酶活力在4 d內無顯著上調趨勢時，預示著該鹽度已超出貝類鹽度耐受范圍。

鰓Ca2＋-ATP酶與Mg2＋-ATP酶活力變化趨勢與Na＋／K＋-ATP酶活力變化趨勢類似。推測4 d左右時其將大量細胞質基質中Ca2＋轉運到肌質網(wǎng)腔中儲存起來，抑制肌細胞收縮［12］，這可能與貝類在受脅迫時的閉殼有關，Ca2＋-ATP酶活力的上升促進開殼正常濾水攝食。由于貝類的閉殼行為受肌肉收縮這一耗能過程控制，且貝類行為可能與水中Mg2＋濃度有關［27-28］，推測Ca2＋-ATP酶與Mg2＋-ATP酶活力的變化與閉殼之間可能存在相關性。

受到鹽度脅迫時，河蜆首先閉殼應對脅迫，導致攝食率隨之下降［29］。在鹽度脅迫耐受范圍內，通過Na＋／K＋-ATP酶活升高進行離子調節(jié)，同時激活Ca2＋-ATP酶與Mg2＋-ATP酶來解除閉殼狀態(tài)，促進貝類的正常生理活動；如果超出鹽度耐受范圍，ATP酶活力在4 d內不會上升進行適應調節(jié)，河蜆始終處于閉殼狀態(tài)，攝食率處于極低水平，最終導致死亡。因此鰓Na＋／K＋-ATP酶亦可作為雙殼貝類耐鹽性能的指示指標。