張麗芝，李阿妮，張新莊，程新，白貴杰，任克明，鄭明睿，羅樹權(quán)

蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第一研究室甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730046

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）簡稱肺炎球菌，是一種具有莢膜的革蘭陽性菌，主要引起社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎及敗血癥等疾病。目前已有采用肺炎球菌莢膜多糖制備的23 價肺炎球菌莢膜多糖疫苗和13 價肺炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗上市，可有效防御肺炎球菌對成人和嬰幼兒造成的感染。

《中國藥典》三部（2020 版）中對肺炎球菌檢定技術(shù)主要包括培養(yǎng)特性、鏡檢、生化反應(yīng)、玻片凝集反應(yīng)［1］。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ／ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)主要原理是利用基質(zhì)與細菌細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)形成結(jié)晶，激光照射結(jié)晶體，使其快速爆炸性蒸發(fā)，基質(zhì)與標(biāo)本間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使菌體蛋白質(zhì)離子化并帶入氣相介質(zhì)；帶電離子在電場作用下，沿著高真空的飛行管道飛行，質(zhì)荷比越小，到達檢測器所需時間就越短，從而區(qū)分不同的帶電離子，并獲得該細菌的全蛋白組圖譜，如MALDITOF MS 技術(shù)可區(qū)分鑒定肺炎球菌與假性肺炎球菌（如口腔鏈球菌）［2］，該技術(shù)具有高通量、高重現(xiàn)性，快速的特點［3-4］，已在臨床微生物的鑒定中廣泛使用［5-7］。MALDI-TOF MS 技術(shù)還可用于細菌分型及血清學(xué)分型方面，如區(qū)分腸道沙門菌屬主要的血清型等［8］；可用于耐藥株和敏感株的快速鑒定，如區(qū)分鑒別耐萬古霉素腸菌株［9］；可用于細菌進化和相似度的分析［10］。研究表明，MALDI-TOF MS 技術(shù)對曲霉種水平的鑒定準(zhǔn)確率可達95%，對非曲霉絲狀真菌的鑒定準(zhǔn)確率僅為57.7%［11-12］。本研究采用MALDI-TOF MS 技術(shù)對13 價肺炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗生產(chǎn)用菌種進行血清分型，探討該技術(shù)在疫苗生產(chǎn)用菌種質(zhì)量控制中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌種 1 型肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae serotype1，F(xiàn)L1）、FL3、FL4、FL5（批號分別為 FL5-2009、FL5-2010、FL5-2014、FL5-2016、FL5-2019、FL5-202005、FL5-202007）、FL6A、FL6B、FL7F、FL9V、FL14（批號分別為 FL14-0303、FL14-0606）、FL18C、FL19A、FL19F、FL23F 工作菌種保存于 2 ~ 8 ℃，F(xiàn)L5 主代菌種（FL5ZD）保存于-60 ℃以下，均購自中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心，為血清型明確的標(biāo)準(zhǔn)菌株，由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第一研究室制備；FL5丹麥菌種（FLdm2014）及北京兒科醫(yī)院菌種（FLek41 和FLek85）分別由丹麥血清研究所和北京兒科醫(yī)院惠贈。

1.2 主要試劑及儀器 肺炎球菌血清型分型鑒定用血清購自丹麥血清研究所；色譜純甲酸和乙腈購自美國Sigma 公司；無水乙醇購自中國國藥集團化學(xué)試劑公司；哥倫比亞血瓊脂購自廣州迪景生物科技有限公司；HCCA 基質(zhì)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀購自德國Bruker 公司。

1.3 菌種經(jīng)典表型的鑒定 將13 種血清型肺炎球菌菌種（共24 株）分別無菌接種至哥倫比亞血瓊脂平皿，于35 ~ 37 ℃，5% ~ 10% CO2環(huán)境中培養(yǎng)12 ~20 h，觀察細菌培養(yǎng)特性。取肺炎球菌的新鮮培養(yǎng)物，按《中國藥典》三部（2020 版）中規(guī)定的方法分別進行鏡檢、糖發(fā)酵生化反應(yīng)、膽汁溶菌試驗、奧卜托欣試驗、血清凝集反應(yīng)檢測［1］。同時進行莢膜腫脹試驗，取培養(yǎng)皿中菌種的新鮮培養(yǎng)物，用生理鹽水制成菌懸液，A600=0.2~0.5 時，取 5 μL，滴于載玻片上，加入5 μL 相同血清型別的血清抗體；吸取5 μL 美蘭染液進行染色，蓋蓋玻片，置濕盒中30 min，顯微鏡下觀察。

1.4 肺炎球菌的質(zhì)譜鑒定 取肺炎球菌的新鮮培養(yǎng)物，用100 μL 純凈水調(diào)制成4 個麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海偌尤?00 μL 無水乙醇，混勻，制成滅活的菌懸液，-20 ℃保存。取1 μL 菌懸液點靶板上，室溫晾干后，添加1 μL HCCA 基質(zhì)液敷于樣本之上，晾干后，上樣基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀，用MALDI Biotyper 軟件自帶數(shù)據(jù)庫（Compass 2019 版）進行質(zhì)譜鑒定，得分＜1.700 則表示檢測結(jié)果不可信；得分為1.700 ~ 1.799 表示可能鑒定到細菌屬水平；得分為2.000~2.299 表示非常可靠鑒定到細菌屬的水平，可能到細菌種水平；得分為2.300~3.000為高度可能性鑒定到細菌種水平。

1.5 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的建立 取100 μL 上述菌懸液，8 000 × g 離心 2 min，收集菌體，添加 50 μL 70%甲酸，混勻，再添加 50 μL 乙腈，混勻，8 000 × g離心2 min，取1 μL 上清液，點樣于靶板上，每個樣品平行設(shè)4 個點，另于其他孔點樣 1 μL BTS，用于儀器的校準(zhǔn)，于室溫下晾干；添加 1 μL HCCA 基質(zhì)液敷于樣本之上，室溫晾干，插入基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀進行分析。每個樣品孔位采集3 張質(zhì)譜圖，每個樣品共采集12 張譜圖。通過MALDI Biotyper 軟件進行譜圖數(shù)據(jù)庫的建立，再自建24 株肺炎球菌數(shù)據(jù)庫，將自帶庫和自建庫的合并數(shù)據(jù)庫進行搜庫鑒定，并根據(jù)質(zhì)譜圖的相似性進行聚類分析，同時生成聚類分析樹狀圖。

1.6 不同批次FL14 的比較 將批號為FL14-0303、FL14-0606 的2 批FL14 工作菌種按1.3 項方法進行莢膜腫脹試驗，按1.5 項方法建立蛋白指紋譜圖，并進行比較。

1.7 不同來源FL5 菌種的比較 按1.5 項方法建立 FL5 工作菌種（FL-202005）、不同來源 FL5（丹麥菌種FLdm2014 及北京兒科醫(yī)院菌種FLek41 和FLek85）的蛋白指紋圖譜，并進行比較。

1.8 FL5 菌種保存穩(wěn)定性的檢測 按1.5 項方法建立FL5 的主代菌種（FL5ZD）、不同批次的FL5 工作菌種（FL5-2009、FL5-2010、FL5-2014、FL5-2016、FL5-2019、FL5-202005、FL5-202007）、FL5 丹麥菌種（FLdm2014）及北京兒科醫(yī)院菌種（FLek41 和FLek85）的蛋白指紋圖譜，應(yīng)用MALDI Biotyper 軟件進行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 菌種經(jīng)典表型特性 13 種血清型肺炎球菌（24株）的新鮮培養(yǎng)物均為灰白色、表面光滑濕潤的圓形菌落，且具有α-溶血現(xiàn)象；均為革蘭陽性球菌，見圖1；均有莢膜，見圖2；均可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、棉子糖、蜜二糖，不發(fā)酵甘露醇，見圖3；均能被10%脫氧膽酸鈉溶解，見圖4；放入奧卜托欣紙片后均能出現(xiàn)抑菌圈，直徑為14 ~ 16 mm，見圖5；與相應(yīng)的肺炎球菌分型血清均能產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物，見圖6。

圖1 肺炎球菌革蘭染色圖（× 100）Fig.1 Gram staining of Streptococcus pneumoniae（× 100）

圖2 肺炎球菌莢膜腫脹試驗（× 100）Fig.2 Swelling test of Streptococcus pneumonia（× 100）

圖3 肺炎球菌糖發(fā)酵生化反應(yīng)Fig.3 Sugar fermentation test of Streptococcus pneumoniae

圖4 肺炎球菌膽汁溶菌試驗Fig.4 Bile lysis test of Streptococcus pneumoniae

圖5 肺炎球菌奧卜托欣抑菌試驗Fig.5 Obtosin antibacterial test of Streptococcus pneumoniae

圖6 肺炎球菌的血清凝集試驗Fig.6 Slide agglutination test of Streptococcus pneumonia

2.2 肺炎球菌的質(zhì)譜鑒定 13 種血清型肺炎球菌（共24 株）均鑒定為肺炎球菌，其中自帶庫鑒定得分>2.0 能非?？煽胯b定至鏈球菌種水平的有21 株，鑒定至鏈球菌屬水平的為3 株；自帶庫和自建庫合并數(shù)據(jù)庫鑒定13 種血清型肺炎球菌（共24 株）與自建庫錄入時對應(yīng)血清型相符。見表1。不同血清型蛋白指紋譜的質(zhì)譜峰的位移不同或缺失，見圖7。13 種血清型肺炎球菌（共24 株）得出聚類分為3 大類，見圖8。結(jié)果表明，不同血清型肺炎球菌蛋白指紋圖譜雖有差異，但MALDI-TOF MS 技術(shù)仍不能依據(jù)這些質(zhì)譜峰的不同按血清型進行聚類。

圖7 13 種血清型肺炎球菌蛋白指紋圖譜Fig.7 Protein fingerprints of 13 serotypes of Streptococcus pneumonia

圖8 13 種血清型肺炎球菌蛋白指紋譜圖的聚類分析Fig.8 Cluster analysis of protein fingerprints of 13 serotypes of Streptococcus pneumonia

表1 13 個血清型肺炎球菌菌種的鑒定結(jié)果Tab.1 Identification of 13 serotypes of Streptococcus pneumonia strains

2.3 不同批次FL14 的比較 FL14-0606 批肺炎球菌均有明顯莢膜，F(xiàn)L14-0303 批既有莢膜退化菌，也有正常莢膜菌，見圖9，表明兩批FL14 具有不同的莢膜豐度。兩批FL14 的蛋白指紋譜圖基本一致，見圖10，表明不同莢膜豐度的相同血清型肺炎球菌的蛋白指紋圖譜差異較小。

圖9 兩批FL14 的莢膜腫脹試驗（× 100）Fig.9 Capsular swelling test of two FL14 batches（× 100）

圖10 兩批FL14 的蛋白指紋圖譜Fig.10 Protein fingerprints of FL14 of two batches

2.4 不同來源FL5 菌種的比較 FL5 北京兒科醫(yī)院菌種及FL5 工作菌種（FL-202005）質(zhì)譜峰較一致，但FL5 丹麥菌種有多個峰的位移不同，見圖11。表明相同血清型不同來源肺炎球菌的蛋白指紋圖譜不同，MALDI-TOF MS 技術(shù)能夠進行區(qū)分鑒定。

圖11 不同來源FL5 菌種的蛋白指紋圖譜Fig.11 Protein fingerprints of FL5 from different origins

2.5 FL5 菌種保存穩(wěn)定性 與FL5 北京兒科醫(yī)院菌種（FLek41 和 FLek85）比較，F(xiàn)L5 主代菌種及不同批次的 FL5 工作菌種（FL5-2009、FL5-2010、FL5-2014、FL5-2016、FL5-2019、FL5-202005、FL5-202007）為 同一聚類，與丹麥菌種（FLdm2014）為不同聚類，見圖12。表明不同批次的疫苗用FL5 工作菌種的蛋白指紋圖譜基本一致，各批菌種保存穩(wěn)定性良好。

圖12 不同批次FL5 工作菌種的聚類分析圖（× 100）Fig.12 Cluster analysis of working strains of FL5 of different batches（× 100）

3 討 論

目前，《中國藥典 》三部（2020 版）［1］中主要通過經(jīng)典細菌表型鑒定技術(shù)進行肺炎球菌疫苗用菌種檢定，簡便易行，但鑒定結(jié)果多以主觀判斷為主，易產(chǎn)生誤差。本實驗結(jié)果表明，13 型肺炎菌種（24 株）均滿足經(jīng)典細菌表型鑒定的要求，但細菌表型鑒定方法本身分辨率較低，不易于獲得更多菌種的質(zhì)量信息。

MALDI-TOF MS 技術(shù)主要反映微生物核糖體蛋白信息，蛋白是生命活動的主要承擔(dān)者，其差異性主要體現(xiàn)為微生物的表現(xiàn)型［13］。本實驗在經(jīng)典細菌表型鑒定結(jié)果正確的前提下，探討MALDI-TOF MS技術(shù)對疫苗用肺炎菌種質(zhì)量控制中的作用，結(jié)果表明，MALDI-TOF MS 技術(shù)可正確鑒定肺炎球菌的菌種，不同血清型肺炎球菌蛋白指紋圖譜存在差異，聚類分析為3 大類，表明該技術(shù)不能完全依照血清型別的不同進行分類。肺炎球菌主要依據(jù)莢膜多糖的差異分成不同的血清型及血清亞型，MALDI-TOF MS 技術(shù)主要是針對細菌蛋白質(zhì)進行分析，不能檢測莢膜多糖，因此MALDI-TOF MS 技術(shù)能夠檢測肺炎球菌血清型的差異，可能與細菌中血清型差異相關(guān)的管家蛋白不同［14］或與莢膜多糖的合成過程需要莢膜多糖合成酶系統(tǒng)的不同有關(guān)。NAKANO 等［14］采用MALDI-TOF MS 技術(shù)成功鑒別區(qū)分出日本主要流行的10 種肺炎球菌血清型，并認(rèn)為通過收集更多的肺炎菌株及充實每種肺炎血清型的數(shù)據(jù)庫，可能會提高MALDI-TOF MS 技術(shù)對肺炎血清型水平檢定的性能。PINTO 等［15］采用 MALDI-TOF MS 技術(shù)對 416株臨床分離肺炎菌株進行血清型分型鑒定，可快速，高通量鑒定出肺炎球菌，在肺炎球菌血清分型檢測中具有良好的應(yīng)用前景。

莢膜多糖是肺炎球菌的主要毒力因子，也是肺炎球菌多糖疫苗、肺炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗的主要成分。在肺炎球菌的長時間保存中，有時會出現(xiàn)莢膜衰退菌種，表現(xiàn)為莢膜腫脹試驗中存在無莢膜菌，嚴(yán)重影響相應(yīng)疫苗的質(zhì)量，因此篩選莢膜豐度好的菌種是工作菌種質(zhì)控的關(guān)鍵。實驗室一般通過莢膜腫脹試驗檢測肺炎菌種的莢膜豐度，結(jié)果判斷受主觀影響較大，不利于質(zhì)控。本研究采用MALDI-TOF MS 技術(shù)檢測相同血清型不同莢膜豐度肺炎球菌的質(zhì)譜圖，結(jié)果顯示，兩種莢膜豐度肺炎球菌的質(zhì)譜圖無區(qū)別，表明該方法對肺炎球菌莢膜豐度的分辨率較低。

本實驗采用MALDI-TOF MS 技術(shù)對不同來源的FL5 的工作菌種、丹麥菌種、北京兒科醫(yī)院菌種進行檢定，結(jié)果顯示，不同來源FL5 菌種的蛋白指紋圖譜存在有差異，表明不同的環(huán)境選擇壓力會使相同血清型的肺炎菌種產(chǎn)生不同的蛋白表達，該技術(shù)可區(qū)分鑒定不同地域的肺炎球菌菌種。同時，本實驗采用MALDI-TOF-MS 技術(shù)對FL5 主代菌種及不同批次的工作菌種進行聚類分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)L5 主代菌種及多批工作菌種的指紋圖譜基本一致，聚類分析為一類，表明菌種制備的凍干過程并不會對肺炎球菌的核糖體蛋白產(chǎn)生影響。實驗結(jié)果還表明，不同批次的FL5 工作菌種均為一個聚類，表明疫苗用肺炎球菌主代菌種與工作菌種在長時間的低溫保存中的穩(wěn)定性良好。

綜上所述，MALDI-TOF MS 技術(shù)可區(qū)分不同地域來源的相同血清型肺炎球菌，借助蛋白譜聚類分析可判斷菌種核糖體蛋白的一致性，可用于觀察肺炎球菌疫苗用菌種的穩(wěn)定性，提供更多菌種信息，并具有快速、客觀、準(zhǔn)確、高通量、重復(fù)性好等優(yōu)點。因此，MALDI-TOF MS 技術(shù)可作為肺炎血清分型檢定的一種輔助方法，可用于疫苗用工作菌種的質(zhì)量控制，尤其是疫苗的研發(fā)階段，建立工作菌種的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，收集菌種的相關(guān)數(shù)據(jù)，為長期保存的菌種留存蛋白指紋譜信息，為菌種的穩(wěn)定性及質(zhì)量控制提供更多信息及依據(jù)。