劉東梅，楊雯娜，肖雪莉，呂玉婷，高晶晶，趙一歡，楊淼，劉晨鳴，劉曉凡

蘭州生物制品研究所有限責任公司質(zhì)量保證部，甘肅蘭州730046

統(tǒng)計過程控制限度是指示符合法規(guī)及注冊要求的工藝操作范圍與異常工藝操作范圍的界限，通過歷史操作數(shù)據(jù)計算獲得，用于監(jiān)測工藝的穩(wěn)定性，若超出統(tǒng)計控制范圍，則提示工藝性能漂移，與數(shù)值波動大小有關(guān)?？焖侔l(fā)現(xiàn)偏離正常工藝操作范圍有助于及時進行回顧，定期回顧能夠加深對工藝的理解，并改進工藝。產(chǎn)品質(zhì)量質(zhì)控相關(guān)的質(zhì)量標準、質(zhì)量內(nèi)控放行標準、趨勢范圍、警戒限、行動限等均屬于統(tǒng)計控制限［1-3］。在疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量管理過程中，為確保產(chǎn)品安全有效及生產(chǎn)過程穩(wěn)定受控，各類控制限的制定成為全面質(zhì)量控制的重要因素?！端幤飞a(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010 年修訂）》（簡稱《規(guī)范》）及其附錄1 中規(guī)定，物料、中間產(chǎn)品、待包裝產(chǎn)品和成品必須按照質(zhì)量標準進行檢查和檢驗，應(yīng)制定適當?shù)膽腋×Ｗ雍臀⑸锉O(jiān)測警戒限和糾偏限［3］；《藥品GMP指南：質(zhì)量控制實驗室與物料系統(tǒng)》中表明，制藥企業(yè)用閾值法計算行動限和警戒限是一種常用方法，但《規(guī)范》中對計算產(chǎn)品質(zhì)量標準及其他控制限度的統(tǒng)計學方法并未具體規(guī)定［4-5］。人用藥品技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)理事會（International Conference on Harmonization，ICH）要求，質(zhì)量標準需結(jié)合生產(chǎn)工藝、中間品的穩(wěn)定性、臨床研究分析方法等因素進行建立，必要時還應(yīng)對定量的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，詳盡敘述分析方法及其依據(jù)原理［6-7］。美國注射劑協(xié)會（Parenteral Drug Association，PDA）第 59 號技術(shù)報告表明，統(tǒng)計方法為持續(xù)生產(chǎn)符合預(yù)定質(zhì)量標準的產(chǎn)品提供了客觀證據(jù)，也可對工藝進行持續(xù)改進和開發(fā)，但文件中提供的過程控制統(tǒng)計方法不適用于非正態(tài)分布，非參數(shù)工具不在文件的討論范圍內(nèi)［1-2］。

生物制品生產(chǎn)階段需進行病毒滴度、活菌數(shù)、多糖分子大小等指標的檢測，檢測方法涉及動物檢測，精度差異較大，易受主觀因素影響。每種統(tǒng)計分析方法均具有自身的特點和局限，需滿足一定的假設(shè)前提，在計算統(tǒng)計過程控制限時，應(yīng)避免隨意引用統(tǒng)計數(shù)字及套用各類公式［8-10］。本研究以A 群C 群腦膜炎球菌多糖疫苗成品各質(zhì)量屬性的檢測結(jié)果及其生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的各數(shù)值型質(zhì)量指標為例，對質(zhì)量屬性的檢定結(jié)果按其分布類型進行分類統(tǒng)計分析，以期為疫苗生產(chǎn)中質(zhì)量屬性控制限的制定方法提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 2019 年生產(chǎn)的182 批A 群C 群腦膜炎球菌多糖疫苗（每批包含2 個亞批）的關(guān)鍵質(zhì)量屬性的檢測結(jié)果由蘭州生物制品研究所有限責任公司提供，包括多糖含量（A 群多糖磷含量、C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量）及水分指標。

1.2 統(tǒng)計學分析方法 個體分布識別提供14 種分布及Johnson 變換和Box-Cox 變換，用于尋找最佳的分布方式擬合數(shù)據(jù)及確定變換對數(shù)據(jù)擬合至正態(tài)分布是否有效，計算出每個分布和變換的Anderson-Darling 統(tǒng)計量及P 值，其過程中使用的似然比檢驗用以確定所選分布中添加一個額外參數(shù)對顯著改善分布擬合的影響。

應(yīng)用Minitab 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件，采用分布識別、正態(tài)概率檢驗、閾值法等統(tǒng)計分析方法對2019 年生產(chǎn)的A 群C 群腦膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量（A群多糖磷含量、C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量）及水分的質(zhì)量屬性控制限的制定方法進行分類匯總，每個質(zhì)量屬性選擇擬合度最高的4 個不同分布的概率圖作為結(jié)果，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 A 群多糖磷含量

2.1.1 擬合優(yōu)度檢驗 結(jié)合輸出的P 和概率圖，當選擇分布為正態(tài)分布、Box-Cox 變換、對數(shù)正態(tài)、3 參數(shù)Weibull 時，差異無統(tǒng)計學意義（AD 分別為0.573、0.666、0.666、0.589，P 分別為 0.136、0.081、0.081、0.094），見表1；這些點均在擬合分布線附近分布，數(shù)據(jù)擬合良好，見圖1。選擇P 最大（0.136）的正態(tài)分布為其最優(yōu)擬合分布。

圖1 A 群多糖磷含量的概率圖Fig.1 Probability plot of phosphorus content in group A polysaccharide

表1 A 群多糖磷含量的擬合優(yōu)度檢驗及分布參數(shù)的極大似然估計Tab.1 Goodness of fit test of polysaccharide phosphorus content in group A and maximum likelihood estimation of distribution parameters

2.1.2 控制限制定 A 群多糖磷含量服從正態(tài)分布。單值圖及移動極差圖中均有檢測結(jié)果違反判異準則1，即均有1 個點距離中心線超過3.00 個標準差，該點檢測結(jié)果為 4.77 μg ／ 劑，在標準范圍內(nèi)（3.75 ~ 4.88 μg ／ 劑），見圖 2。根據(jù)判穩(wěn)準則（連續(xù)100 個點至多2 個點落在控制界限外）和判異準則，當前生產(chǎn)過程處于穩(wěn)定狀態(tài)。A 群多糖磷含量的工藝過程能力指數(shù)Cpk = 1.20，當前過程能力一般，可能與檢測結(jié)果（4.77 μg ／ 劑）接近標準上限有關(guān)，見圖3。因此A 群多糖磷含量的控制限應(yīng)該在 μ ± 2σ（3.991，4.596）基礎(chǔ)上適當延長作為其警戒限，在 μ ± 3σ（3.840，4.748）基礎(chǔ)上適當延長作為其行動限。

圖2 A 群多糖磷含量控制圖Fig.2 I-MR control chart of phosphorus content in group A polysaccharide

圖3 A 群多糖磷含量工藝能力指數(shù)報告Fig.3 Process capability index report of phosphorus content in group A polysaccharide

在疫苗的各階段生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的質(zhì)量屬性，若其結(jié)果服從正態(tài)分布，可按上述方法計算其警戒限和行動限等各控制限。

2.2 C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量

2.2.1 擬合優(yōu)度檢驗 當選擇分布為正態(tài)分布時，差異有統(tǒng)計學意義（AD = 0.866，P = 0.026），當選擇的變換為 Box-Cox 變換、3 參數(shù) Weibull、Johnson變換時，差異無統(tǒng)計學意義（AD 分別為0.703、0.621、0.462，P 分別為 0.066、0.067 和 0.257），見表 2；選擇P 最大（0.257）的Johnson 變換為其最優(yōu)的擬合變換，見圖4。Johnson 變換函數(shù)為：-0.607 114 +1.792 75 × Ln［（X - 34.520 6）／（51.199 7 - X）］。

圖4 C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量的概率圖Fig.4 Probability plot of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide

表2 C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量擬合優(yōu)度檢驗及分布參數(shù)的極大似然估計Tab.2 Goodness of fit test of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide and maximum likelihood estimation of distribution parameters

2.2.2 控制限制定 C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量的檢測結(jié)果按Johnson 變換時，差異無統(tǒng)計學意義（AD = 0.462，P = 0.257），數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布。單值圖及移動極差圖中均有檢測結(jié)果違反判異準則1，即均有1 個點距離中心線超過3.00 個標準差，該點檢測結(jié)果為 39.1 μg ／ 劑，在標準范圍內(nèi)（37.5 ~ 48.8 μg ／ 劑），見圖 5。根據(jù)判穩(wěn)準則和判異準則，當前生產(chǎn)過程處于穩(wěn)定狀態(tài)，見圖6。C 群多糖含量N-乙酰神經(jīng)氨酸的標準范圍經(jīng)Johnson變換函數(shù)變換后，其上下限變?yōu)椋?1.79，0.78），工藝過程能力指數(shù)Cpk = 0.37，工藝能力指數(shù)較低，這可能與個別批次接近標準下限有關(guān)，但從整體來看，C群多糖含量N-乙酰神經(jīng)氨酸工藝能力保持相對穩(wěn)定，過程處于穩(wěn)定狀態(tài)，見圖7?；谝陨蟽牲c，C 群多糖含量N-乙酰神經(jīng)氨酸含量經(jīng)Johnson變換后的數(shù)據(jù)應(yīng)該在 μ ± 2σ（-1.445，1.431）基礎(chǔ)上適當延長作為其警戒限，μ ± 3σ（-2.164，2.150）適當延長作為其行動限。

圖5 C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸的Johnson 變換Fig.5 Johnson transformation of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide

圖6 C 群多糖含量N-乙酰神經(jīng)氨酸的控制圖Fig.6 I-MR control chart of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide

圖7 C 群多糖含量N-乙酰神經(jīng)氨酸的工藝能力指數(shù)報告Fig.7 A report on the process capability index of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide

在疫苗的各階段生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的質(zhì)量屬性，若其結(jié)果服從非正態(tài)分布，可通過其分布擬合的情況計算其概率函數(shù)，再根據(jù)其分布規(guī)律制定相應(yīng)的警戒限或行動限，最常見的變換有Johnson 轉(zhuǎn)換和Box-Cox 變換。

2.3 水分 水分檢測結(jié)果經(jīng)分布擬合及數(shù)據(jù)變換差異有統(tǒng)計學意義（AD=3.444~125.048，P 均 <0.05），數(shù)據(jù)不能擬合任何一種分布，且不能執(zhí)行Johnson 變換和Box-Cox 變換，見表3。選取P 最大的水分概率圖（見圖8），數(shù)據(jù)點并未沿著擬合分布線附近分布，離開直線，表明擬合是不可接受的。不考慮分布擬合情況，可使用公差限制法，即根據(jù)公差范圍的95%或99%作為警戒限和行動限，當前水分的質(zhì)量標準為< 3%，其警戒限可制定為<2.85%，行動限可制定為<2.97%。

圖8 水分的概率圖Fig.8 Probability plot of moisture

表3 水分擬合優(yōu)度檢驗及分布參數(shù)的極大似然估計Tab.3 Test of moisture goodness of fit and maximum likelihood estimation of distribution parameters

在疫苗的各階段生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的質(zhì)量屬性，若其結(jié)果數(shù)據(jù)不能擬合任何分布時，可采用公差限制法或閾值法制定其控制限。

3 討 論

統(tǒng)計方法在制藥行業(yè)中具有重要作用，可確保持續(xù)生產(chǎn)符合預(yù)定質(zhì)量標準。目前，ICH、PDA、歐洲聯(lián)盟（European Union，EU）已有針對生物制藥行業(yè)統(tǒng)計分析方法的指南，國際標準化組織（International Organization for Standardization，ISO）也建立了一些通用的統(tǒng)計學分析方法指南，旨在幫助生產(chǎn)公司識別和正確使用統(tǒng)計學分析方法。合理的統(tǒng)計學分析方法可用于提高決策質(zhì)量，是達到預(yù)期結(jié)果的一種手段。任何有意義的統(tǒng)計分析均有前提，首先，數(shù)據(jù)完整性應(yīng)有保證，檢測方法應(yīng)可靠，分析方法獲得合理的驗證如分析方法應(yīng)有充分的準確性、精密度、重復(fù)性、專屬性、檢測限及定量限［11］；其次，使用統(tǒng)計學工具需要滿足一定的假設(shè)前提，如滿足一定的統(tǒng)計分布特征（通常是正態(tài)）和取樣的代表性［12-13］，否則用正確的公式計算出來的數(shù)字缺乏說服力。

本研究采用分布識別、正態(tài)概率檢驗及閾值法等統(tǒng)計學分析方法，以質(zhì)量一致性良好的A 群C 群腦膜炎球菌多糖疫苗成品各質(zhì)量屬性的檢測為例［14］，討論不同分布狀態(tài)下質(zhì)量屬性檢定結(jié)果制定控制限的方法，在疫苗各階段生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的質(zhì)量屬性，若服從正態(tài)分布，均可按照A 群多糖磷含量計算控制限的方法計算其警戒限和行動限等各類控制限，用以監(jiān)控日常的生產(chǎn)是否處于穩(wěn)定受控狀態(tài)；對于服從非正態(tài)分布的質(zhì)量屬性，要通過其分布擬合的情況計算其概率函數(shù)，再根據(jù)其分布規(guī)律制定相應(yīng)的警戒限或行動限，包括最常見的變換有Johnson 轉(zhuǎn)換和Box-Cox 變換。對于不能擬合任何分布的質(zhì)量屬性，可利用閾值法或公差限制的方法制定其控制限度，閾值法是制藥企業(yè)環(huán)境監(jiān)測中規(guī)定行動限和警戒限常用的一個方法［3］，行動值的規(guī)定應(yīng)符合GMP 的規(guī)定。無論使用哪種統(tǒng)計分析方法制定質(zhì)量屬性的控制限，當限度確立后，應(yīng)定期進行產(chǎn)品質(zhì)量回顧分析，以確認工藝穩(wěn)定可靠及現(xiàn)行質(zhì)量標準的適用性，及時發(fā)現(xiàn)不良趨勢，若歷史數(shù)據(jù)表明檢測結(jié)果有異常趨勢，則限度也應(yīng)當進行相應(yīng)調(diào)整以反映實際情況。使用合理的統(tǒng)計分析方法制定控制限后，其控制限的延長需結(jié)合《中國藥典》三部（2020 版）［15］、注冊標準及實際生產(chǎn)情況而決定。

采用科學規(guī)范的統(tǒng)計學分析方法制定疫苗生產(chǎn)過程中各類質(zhì)量屬性的控制限才具有合理性，才能對生產(chǎn)產(chǎn)生良好的指導(dǎo)意義。目前，本公司已按照本研究的方法制定了不同質(zhì)量屬性的控制限度，并才能對各批次產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性檢驗結(jié)果進行動態(tài)I-MR 控制圖趨勢分析，以期及時發(fā)現(xiàn)過程中的異常情況并積極采取相應(yīng)的預(yù)防措施，確保上市產(chǎn)品安全有效。