陳金玉，張平，孫穎昕，潘敏杰，周珊

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.泌尿外科，江蘇常州 213000）

前列腺癌是一種嚴(yán)重危害男性生命的惡性腫瘤，隨著我國人口老齡化的加劇，前列腺癌患病率逐年上升，已成為我國男性第6 大常見惡性腫瘤[1]。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致前列腺癌患者生命質(zhì)量降低和生存期縮短的主要原因，前列腺特異抗原（prostate specific antigen, PSA）是前列腺癌一種腫瘤標(biāo)志物，但其檢測結(jié)果易受藥物、炎癥及良性前列腺病變影響，不能預(yù)測前列腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，缺乏相關(guān)生物標(biāo)志物[2]。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, LncRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA，可作為癌基因或抑癌基因參與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展[3]。 漿細(xì)胞瘤可變易位基因1（plasmacytoma variant translocation 1, PVT1）和H19 是LncRNA 家族成員。有研究報(bào)道，兩者在胃癌、卵巢癌、肺癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增長、侵襲、遷移和凋亡等密切相關(guān)[4-7]。已有研究報(bào)道LncRNA PVT1、LncRNA H19 在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)[8-9]。但關(guān)于兩者與前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚無研究報(bào)道。本研究就檢測前列腺癌患者血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 表達(dá)，分析兩者與前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月—2018年5月南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院收治的前列腺癌患者169 例作為前列腺癌組?；颊吣挲g42～82 歲，平均（64.57±7.87）歲；病理類型：腺癌141 例，其他類型28 例；根據(jù)李志國等[10]研究的分類標(biāo)準(zhǔn)，以腫瘤直徑3 cm作為分界點(diǎn)：＞3 cm 84例，≤3 cm 85 例；分化程度：低分化36 例，中高分化133 例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期104 例，Ⅲ期65 例；國際泌尿病理學(xué)會(huì)修訂的Gleason 評(píng)分[11]：≥7 分47 例，＜7 分122 例； PSA 為11.89～88.32 ng/ml， 平均49.23（35.64，66.72）ng/ml。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為前列腺癌；②初次確診，未接受任何治療；③TNM 分期Ⅰ～Ⅲ期；④接受根治性或姑息性手術(shù)切除；⑤臨床病理資料完整；⑥患者及家屬均知情研究，可接受隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤者；②嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾病者；③全身感染性疾病者；④血液系統(tǒng)疾病者。另選取同期本院健康體檢者74 例作為對照組。研究者年齡27～85 歲，平均（63.87±8.02）歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

采集前列腺癌組入院次日清晨和對照組體檢時(shí)空腹靜脈血3 ml，以3 000 r/min 離心10 min，取上清液，置入-80℃冰箱冷凍保存。Trizol 試劑提取總RNA，NanoDrop 2000C 超微量分光光度計(jì)驗(yàn)證RNA 濃度和純度（OD260/OD280 為1.8～2.0），TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增。LncRNA PVT1 正向引物：5'-TTGGCACATACAG CCATCAT-3'，反向引物5'-GCAGTAAAAGGGGAAC ACCA-3'，長度分別為18 bp 和20 bp；LncRNA H19正向引物5'-TACAACCACTGCACTACCTG-3'，反向引物5'-TGGAATGCTTGAAGGCTGCT-3'，長度分別為16 bp、19 bp；內(nèi)參GAPDH 正向引物5'-GAAGG TGAAGGTCGGAGTC-3'，反向引物5'-GAAGATGGT GATGGGATTTC-3'，長度分別為20、24 bp。反應(yīng)體系：5.0 μl SYBR Premix Ex Taq，0.2 μl 引物，0.2 μl ROX Reference Dye， 1.0 μl cDNA 模板， 3.4 μl RNase-free ddH2。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s、60℃退火60 s、72℃拉伸60 s，循環(huán)45 次，2-ΔΔCt法計(jì)算血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 相對表達(dá)量。

1.3 隨訪

前列腺癌患者入院后接受根治性或姑息性手術(shù)切除，術(shù)后定期行MRI 或組織病理學(xué)檢查，以電話或門診方式隨訪3年，以出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或末次隨訪為截止期，截止2021年5月。根據(jù)是否復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組，分別有66 例和103 例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較用Z檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；多因素Cox 回歸分析前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響因素；受試者工作特征（receiver operating characteristic curve, ROC）曲線分析血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 表達(dá)對前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值，并繪制曲線下面積（area under the curve, AUC）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 相對表達(dá)量比較

兩組血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），前列腺癌組高于對照組。見表1。

表1 兩組血清LncRNA PVT1、LncRNA H19相對表達(dá)量比較 M（P25,P75）

2.2 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組臨床資料比較

前列腺癌患者術(shù)后隨訪3～36 個(gè)月，中位時(shí)間22 個(gè)月。169 例結(jié)腸癌患者截止末次隨訪術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移66 例，局部復(fù)發(fā)23 例、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移43 例。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者中骨骼轉(zhuǎn)移27 例、肝轉(zhuǎn)移5 例、肺轉(zhuǎn)移5 例、腦轉(zhuǎn)移2 例、其他部位單發(fā)或多發(fā)轉(zhuǎn)移4 例。單因素分析顯示，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組TNM 分期、Gleason 評(píng)分、PSA、LncRNA PVT1、LncRNA H19 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組年齡、病理類型、腫瘤直徑、分化程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組臨床資料比較

2.3 前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的多因素Cox 回歸分析

以隨訪時(shí)間作為時(shí)間變量，TNM 分期（Ⅲ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0）、Gleason 評(píng)分（≥7 分=1，＜7 分=0）、PSA、LncRNA PVT1、LncRNA H19 作為自變量，術(shù)后是否復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移作為因變量（是=1，否=0），進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，結(jié)果顯示，TNM 分期Ⅲ期[=3.722（95% CI：1.416，7.784）]、Gleason 評(píng)分≥7 分[=4.626（95% CI：1.670，9.815）]、LncRNA PVT1 [=1.982（95 CI：1.521，2.584）]、LncRNA H19[=1.868（95% CI：1.327，2.630）]是前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表3。

表3 前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的多因素Cox回歸分析參數(shù)

2.4 血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 表達(dá)單獨(dú)和聯(lián)合預(yù)測前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價(jià)值

ROC 曲線顯示，血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 表達(dá)分別單獨(dú)和聯(lián)合預(yù)測前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC 為0.768 （95% CI： 0.697，0.830）、0.799 （95% CI： 0.730， 0.856）、0.892（95% CI：0.835，0.934），聯(lián)合預(yù)測AUC 大于單獨(dú)預(yù)測。LncRNA PVT1 單獨(dú)檢測的敏感性最高，LncRNA H19 單獨(dú)檢測的特異性最高，聯(lián)合檢測的Youden 指數(shù)最高。見表4和圖1。

圖1 ROC曲線

表4 血清LncRNA PVT1、LncRNA H19表達(dá)單獨(dú)和聯(lián)合預(yù)測前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價(jià)值

3 討論

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，2020年全球前列腺癌發(fā)病106.6 萬例，死亡37.5萬例，在48 個(gè)國家男性腫瘤致死病因中排第1 位[1]。前列腺癌起病隱匿，早期缺乏典型癥狀，隨著病情進(jìn)展，可出現(xiàn)尿頻、尿不盡、尿不出、尿液或精液帶血等癥狀，往往確診時(shí)已達(dá)中晚期，手術(shù)切除是前列腺癌主要治療方式，但大多患者分期較晚，即使經(jīng)過手術(shù)切除，仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，危害其生命安全。目前臨床主要通過臨床隨訪和影像學(xué)依據(jù)評(píng)估前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，Gleason 評(píng)分雖然能較好評(píng)估前列腺癌預(yù)后，但需要通過穿刺或病理檢查進(jìn)行評(píng)價(jià)，因此研究列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物對早期預(yù)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和指導(dǎo)后續(xù)治療具有重要意義。LncRNA 是一類轉(zhuǎn)錄本＞200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，占所有非編碼80%，其調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移[3]。如LncRNA 同源盒A11 反義RNA 能調(diào)節(jié)整合素，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移[12]。

LncRNA PVT1 定位于人染色體8q24.1，進(jìn)化上高度保守，因人染色體8q24 區(qū)是DNA 拷貝數(shù)擴(kuò)增的最高靶點(diǎn)，異常擴(kuò)增往往與腫瘤發(fā)生有關(guān)，因此近年來大量研究報(bào)道了LncRNA PVT1 與腫瘤的關(guān)系。LIU 等[13]研究顯示，LncRNA PVT1 在宮頸癌組織中高表達(dá)，能通過海綿miR-503 靶向ADP 核糖基化因子樣蛋白2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。HU 等[14]研究顯示，LncRNA PVT1 在食管癌組織中高表達(dá)，能通過海綿miR-128 靶向下調(diào)鋅指E盒結(jié)合同源框1 促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌組血清LncRNA PVT1 表達(dá)顯著升高，提示LncRNA PVT1 作為癌基因可能參與前列腺癌的發(fā)生，與既往研究報(bào)道一致[8]。本研究結(jié)果還顯示，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者血清LncRNA PVT1 表達(dá)更高，提示LncRNA PVT1 高表達(dá)可能與前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。通過Cox 回歸也證實(shí)了這一點(diǎn)，血清LncRNA PVT1表達(dá)每升高1 個(gè)單位，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移幾率將增加1.982 倍，其機(jī)制可能與LncRNA PVT1 能通過海綿miR-186-5p 靶向上調(diào)TWIST 家族bHLH 轉(zhuǎn)錄因子1促進(jìn)前列腺癌上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的重要過程，TWIST 家族bHLH 轉(zhuǎn)錄因子1 能通過調(diào)控核因子-κB、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子等多種信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。CHANG 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA PVT1 能通過海綿miR-186-5p 靶向上調(diào)TWIST 家族bHLH 轉(zhuǎn)錄因子1 表達(dá)，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

LncRNA H19 定位于人染色體11p15.5，作為一種印跡基因，其印跡異常參與了多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展。如SUN 等[17]研究顯示，LncRNA H19 在胃癌組織中高表達(dá)，能通過調(diào)節(jié)miR-519d-3p/乳酸脫氫酶A 軸促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、有氧糖酵解和免疫逃逸。LAN 等[18]研究顯示，LncRNA H19 在甲狀腺乳頭狀癌組織中低表達(dá)，能通過抑制腫瘤壞死因子受體2 抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖和遷移。上述研究提示LncRNA H19 在不同腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌組血清LncRNA H19 表達(dá)顯著升高，提示LncRNA H19作為癌基因參與前列腺癌發(fā)生。本研究結(jié)果還顯示，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者血清LncRNA H19 表達(dá)更高，提示LncRNA H19 高表達(dá)可能與前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。通過Cox 回歸分析表明，LncRNA H19 高表達(dá)為術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移獨(dú)立危險(xiǎn)因素，意味著血清LncRNA H19 表達(dá)越高術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移幾率也就越高，與既往研究報(bào)道一致[19]。其機(jī)制可能與LncRNA H19 能靶向miR-130-5p 調(diào)控人類白細(xì)胞抗原G 抑制自然殺傷細(xì)胞作用有關(guān)。自然殺傷細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，其殺傷作用降低是腫瘤免疫逃逸后增殖、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要原因[20]。人類白細(xì)胞抗原G 能結(jié)合自然殺傷細(xì)胞抑制其殺傷作用，有研究報(bào)道LncRNA H19 能靶向miR-130-5p 上調(diào)人類白細(xì)胞抗原G 表達(dá)，抑制自然殺傷細(xì)胞對前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用[21]。

綜上所述，前列腺癌患者血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 高表達(dá)，為術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測指標(biāo)。但本研究樣本量較少，隨訪時(shí)間較短，關(guān)于LncRNA PVT1、LncRNA H19 在前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。