禹蕾，張彩霞，白雁飛

（1.蘭州市婦幼保健院產(chǎn)科，甘肅蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，甘肅蘭州 730000；3.蘭州市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，甘肅蘭州 730046）

子癇前期是發(fā)生于妊娠20 周以后的胎盤(pán)源性妊娠期并發(fā)癥，以高血壓、蛋白尿及全身系統(tǒng)性紊亂等為主要表現(xiàn)，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦與圍產(chǎn)兒不良結(jié)局甚至死亡的重要原因之一[1]。氧化應(yīng)激是子癇前期從基本的病理改變發(fā)展到器官損害的重要環(huán)節(jié)。子癇前期胎盤(pán)局部氧化應(yīng)激水平顯著升高，同時(shí)伴隨線粒體功能損害作為氧化應(yīng)激的源頭廣受關(guān)注[2]。

有關(guān)維生素C、維生素E 等治療子癇前期孕產(chǎn)婦的報(bào)道指出，傳統(tǒng)抗氧化劑有一定治療效果，但應(yīng)用時(shí)機(jī)受限，且可能增加胎膜早破的風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，探究更為安全、有效的抗氧化劑至關(guān)重要。線粒體輔酶Q（mitoquinone Q, MitoQ）是一種高效的線粒體靶向抗氧化劑，已證實(shí)可改善睪丸損傷大鼠睪丸的氧化應(yīng)激，改善睪丸組織的微觀結(jié)構(gòu)和精子形態(tài)，但目前關(guān)于其對(duì)子癇前期治療作用的研究尚少[4]。本研究通過(guò)復(fù)制子癇前期大鼠模型，采用MitoQ 干預(yù)，觀察其對(duì)子癇前期血壓及胎盤(pán)線粒體功能的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成熟期SPF 級(jí)SD 雄性大鼠40 只，8 周齡，體質(zhì)量290～310 g；成熟期未孕SPF 級(jí)SD 雌性大鼠80 只，8 周齡，體質(zhì)量230～250 g，購(gòu)自北京唯尚立德生物科技有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（甘）2019-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0009]。

1.2 主要試劑及儀器

MitoQ 購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express 公司，鴉膽苦醇（Brusatol）購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，亞硝基左旋精氨酸甲酯（L arginine methyl ester,L-NAME）購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，細(xì)胞線粒體分離試劑盒購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter 公司，活性氧類(lèi)（reactive oxygen species, ROS）試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde, MDA）試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司，兔抗大鼠核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）、抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response elements,ARE）、還原型輔酶Ⅰ醌類(lèi)氧化還原酶（NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1, NQO1）一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。

Medlab 無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)購(gòu)自南京卡爾文生物科技有限公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司，JEM-1011 電子透射顯微鏡購(gòu)自日本電子株式會(huì)社，2088 型超薄切片機(jī)購(gòu)自瑞典LKB 公司。

1.3 方法

1.3.1 子癇前期大鼠模型的復(fù)制及分組按照雌雄比例2∶1 在每天下午4:30 左右合籠，次日早上8:00收集陰道分泌物鏡檢，如觀察到陰栓脫落計(jì)為妊娠期第0 天。從50 只孕鼠中隨機(jī)抽取10 只設(shè)為對(duì)照組，其余40 只從妊娠第7 天開(kāi)始皮下注射LNAME 100 mg/kg 復(fù)制子癇前期大鼠模型；對(duì)照組注射等量生理鹽水，1 次/d，至第13 天。模型復(fù)制成功標(biāo)準(zhǔn)：收縮壓上升＞30 mmHg，且＞115 mmHg[5]。模型復(fù)制成功30 只，隨機(jī)分為子癇前期組、MitoQ組、MitoQ+Brusatol 組，每組10 只。

1.3.2 干預(yù)方式妊娠第14 天MitoQ 組腹腔注射MitoQ 3.5 mg/kg，MitoQ+Brusatol 組腹腔注射MitoQ 3.5 mg/kg，灌胃Brusatol 1 mg/kg，對(duì)照組、子癇前期組腹腔注射、灌胃等體積生理鹽水，1 次/d，干預(yù)至妊娠第19 天。

1.3.3 收縮壓檢測(cè)調(diào)整預(yù)熱箱至36℃，妊娠第15 天、17 天、19 天將孕鼠放入，15 min 后固定器固定，安靜后采用無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)測(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓，測(cè)量3 次取平均值[6]。

1.3.4 取材方式收縮壓檢測(cè)完成后剖宮取胎盤(pán)，清除血跡，分成2 份，一份用于分離線粒體進(jìn)行功能檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察，一份保存于-80℃冰箱用于Western blotting 檢測(cè)[7]。

1.3.5 線粒體提取配置線粒體提取液（Tris-HCL 20 mmol/L、EDTA 2 mmol/L、蔗糖250 mmol/L）。取胎盤(pán)組織250 mg，浸于線粒體提取液中，充分剪碎后勻漿，轉(zhuǎn)移勻漿液至2 ml 離心管中，離心取上清液，沉積再次浸于線粒體提取液中，再次離心取上清液，將2 次上清液混合，離心后去上清液，沉淀中加入提取物2 ml，離心后去上清液，沉淀中加入100 μl提取液，離心去上清液，沉淀中加入線粒體保存液200 μl，冷凍保存[8]。

1.3.6 紫外比色法檢測(cè)線粒體膜通透性改變?nèi)【€粒體懸浮液，加入反應(yīng)介質(zhì)，25℃孵育5 min，加入激發(fā)劑Ca2+0.3 mmol/L，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定540 nm 處的吸光度值，以吸光度值表示線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（permeability transition pore, PT）開(kāi)放活性[9]。

1.3.7 檢測(cè)線粒體ROS、MDA含量取15 μl 線粒體懸浮液，加入24 孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入DCFHDA（調(diào)整終濃度至10 mmol/L），37℃條件下避光孵育25 min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、吸收520 nm 波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度[10]?？捡R斯亮藍(lán)法檢測(cè)線粒體蛋白濃度，ROS 生成量以每毫克蛋白具有的熒光強(qiáng)度表示；以硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA 含量，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.8 透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)取線粒體懸浮液，離心去除上清液，加入2.5%戊二醛、1%鋨酸，35℃固定沉淀60 min，乙醇及環(huán)氧丙烷梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片機(jī)切片（厚度50～70 nm），醋酸鈾、檸檬酸鉛依次染色，在電子透射顯微鏡下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)[11]。

1.3.9 Western blotting 檢測(cè)胎盤(pán)組織Nrf2、ARE、NQO1 蛋白取冷凍保存的胎盤(pán)組織，充分研磨后加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min，離心取上清液，BCA 法定量蛋白，取待測(cè)樣本與上樣緩沖液的混合物沸水浴5 min，恒定電壓下進(jìn)行凝膠電泳，分離膠電以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，加入封閉液于室溫下封閉1 h，加入1∶400 稀釋的兔抗大鼠Nrf2、ARE、NQO1 一抗，4℃搖床孵育過(guò)夜，充分洗滌后加入1∶2 000 稀釋的山羊抗兔二抗，室溫孵育2 h[12]。采用化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影，Nrf2、ARE、NQO1 蛋白相對(duì)表達(dá)量以其灰度值/內(nèi)參GAPDH 灰度值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠收縮壓的變化

對(duì)照組、子癇前期組、MitoQ 組、MitoQ+Brusatol 組大鼠妊娠第15 天、17 天、19 天的收縮壓比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)收縮壓無(wú)差異（F=0.045，P=0.963）；②各組收縮壓有差異（F=15.111，P=0.000）；③各組收縮壓變化趨勢(shì)有差異（F=16.889，P=0.000）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠妊娠后不同時(shí)間點(diǎn)的收縮壓比較（n=10，mmHg，±s）

表1 各組大鼠妊娠后不同時(shí)間點(diǎn)的收縮壓比較（n=10，mmHg，±s）

組別對(duì)照組子癇前期組MitoQ組MitoQ+Brusatol組第15天101.21±9.33 133.56±12.57 112.96±11.38 120.63±10.65第17天99.74±10.24 136.98±15.52 110.27±10.75 121.52±11.87第19天100.29±10.63 139.70±14.50 111.50±12.94 122.32±12.35

2.2 胎盤(pán)線粒體功能

各組PT 活性、ROS、MDA 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示：子癇前期組高于對(duì)照組和MitoQ 組（P＜0.05）；MitoQ+Brusatol 組高于MitoQ 組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠胎盤(pán)線粒體功能比較 （n=10，±s）

表2 各組大鼠胎盤(pán)線粒體功能比較 （n=10，±s）

組別PT活性對(duì)照組子癇前期組MitoQ組MitoQ+Brusatol組F 值P 值0.03±0.01 0.09±0.02 0.05±0.03 0.07±0.03 11.594 0.000 ROS（熒光強(qiáng)度/mg）20.64±3.65 39.54±4.33 27.31±3.95 34.63±4.21 42.034 0.000 MDA（nmol/mg）39.56±4.91 116.87±21.24 71.75±9.36 95.42±10.02 66.287 0.000

2.3 線粒體超微結(jié)構(gòu)

對(duì)照組胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞線粒體數(shù)量豐富，排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰；子癇前期組線粒體基質(zhì)腫脹呈球形，嵴斷裂或消失；MitoQ 組、MitoQ+Brusatol 組線粒體基質(zhì)腫脹較子癇前期組改善，數(shù)量增加，嵴排列較為整齊，其中MitoQ 組改善效果優(yōu)于MitoQ+Brusatol 組。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 （透射電鏡×20 000）

2.4 各組大鼠胎盤(pán)組織Nrf2、ARE、NQO1 蛋白相對(duì)表達(dá)量

各組胎盤(pán)組織Nrf2、ARE、NQO1 蛋白表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示：子癇前期組低于對(duì)照組和MitoQ 組（P＜0.05）；MitoQ+Brusatol 組低于MitoQ 組（P＜0.05）。見(jiàn)表3和圖2。

表3 各組大鼠胎盤(pán)組織Nrf2、ARE、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

表3 各組大鼠胎盤(pán)組織Nrf2、ARE、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

組別對(duì)照組子癇前期組MitoQ組MitoQ+Brusatol組F 值P 值Nrf2 0.85±0.08 0.19±0.03 0.71±0.07 0.32±0.04 283.937 0.000 ARE 0.67±0.07 0.12±0.03 0.46±0.07 0.31±0.05 164.242 0.000 NQO1 0.73±0.07 0.29±0.03 0.50±0.06 0.41±0.04 125.909 0.000

圖2 各組大鼠胎盤(pán)組織Nrf2、ARE、NQO1蛋白的表達(dá)

3 討論

子癇前期是一種妊娠期常見(jiàn)的多器官紊亂綜合征，目前其發(fā)病機(jī)制尚無(wú)明確定論，通常認(rèn)為與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力減弱，影響胎盤(pán)血管重構(gòu)，螺旋動(dòng)脈重鑄不足及胎盤(pán)淺著床，從而導(dǎo)致胎盤(pán)血液供應(yīng)不足、反復(fù)缺血再灌注損傷，引發(fā)氧化應(yīng)激，激活滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡程序，導(dǎo)致全身病理改變有關(guān)[13]。線粒體作為組織細(xì)胞呼吸器，是聯(lián)系氧自由基、鈣超載及細(xì)胞凋亡的紐帶，其功能障礙及氧化應(yīng)激損傷在子癇前期發(fā)病中起到重要作用。

PT 是橫跨在線粒體內(nèi)膜與外膜間的非選擇性通道，其活性增強(qiáng)將減少ATP 合成，導(dǎo)致Ca2+外流、線粒體內(nèi)膜電位喪失、增加細(xì)胞中活性氧，最終啟動(dòng)凋亡程序。線粒體PT 開(kāi)放已被證實(shí)是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的直接原因[14]。本研究結(jié)果顯示，子癇前期組妊娠第15 天、17 天、19 天收縮壓、PT活性、ROS、MDA 含量高于對(duì)照組，經(jīng)MitoQ 干預(yù)后均降低，提示MitoQ 可降低子癇前期大鼠血壓，改善線粒體功能。

ROS 主要生成于線粒體，因線粒體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)抗氧化劑難以進(jìn)入其內(nèi)部發(fā)揮作用，抗氧化效果并不理想。因此，人們逐漸將注意力轉(zhuǎn)向線粒體靶向抗氧化劑的研究。

MitoQ 是三苯基磷與內(nèi)源性抗氧化劑輔酶Q10共價(jià)結(jié)合獲取的線粒體靶向特性抗氧化劑，對(duì)膿毒癥、神經(jīng)退行性疾病等線粒體功能障礙、抗氧化系統(tǒng)失衡相關(guān)性疾病的防治效果較好[15-16]。YANG 等[17]研究MitoQ 在妊娠晚期預(yù)防子癇前期的效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，妊娠晚期給藥可有效減輕子癇前期病情，本研究結(jié)果與其具有相似性，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)MitoQ 應(yīng)用于妊娠早期不僅導(dǎo)致血壓升高、胎兒生長(zhǎng)受限，且導(dǎo)致基帶和迷路帶滋養(yǎng)細(xì)胞比例降低，增加胎盤(pán)受損及罹患胎盤(pán)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。由此可見(jiàn)，MitoQ 在子癇前期防治中的使用時(shí)機(jī)仍有待深入探索。

Nrf2 是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激、啟動(dòng)細(xì)胞自我保護(hù)的重要轉(zhuǎn)錄因子。在正常狀態(tài)下，Nrf2 通常與其抑制蛋白Keap1 在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷時(shí)，Nrf2 與Keap1 解離，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與ARE 結(jié)合后激活其下游抗氧化應(yīng)激因子NQO1 的轉(zhuǎn)錄。CALDEIRA-DIAS 等[18]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改變抗氧化防御相關(guān)基因Nrf2、ARE的活性，可有效延遲子癇前期癥狀出現(xiàn)的時(shí)間，提示Nrf2/ARE 通路可能是治療該病的靶向通路之一。本研究結(jié)果顯示，子癇前期組胎盤(pán)組織Nrf2、ARE、NQO1 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，采用MitoQ 干預(yù)后均升高，在MitoQ 基礎(chǔ)上進(jìn)一步增用Nrf2/ARE 通路抑制劑Brusatol，發(fā)現(xiàn)MitoQ 對(duì)子癇前期的治療作用減弱，提示MitoQ 的治療作用可能通過(guò)調(diào)控Nrf2/ARE 通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，高效抗氧化劑MitoQ 可降低子癇前期大鼠血壓，改善胎盤(pán)線粒體功能及結(jié)構(gòu)，其治療作用可能通過(guò)調(diào)控Nrf2/ARE 通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。