馬偉，武建英，鐘浩，朱吉海，楊佳，王永宏

（青海大學(xué)附屬醫(yī)院心臟血管外科，青海西寧 810000）

肝移植仍存在急慢性排斥反應(yīng)嚴(yán)重、肝臟功能恢復(fù)慢、并發(fā)癥多、生存率低等問(wèn)題，其中供肝缺血再灌注（ischemia-reperfusion, IR）損傷是影響療效和預(yù)后的重要原因，進(jìn)一步發(fā)展可引起多器官組織損傷。供肝IR 損傷的病理機(jī)制包括肝細(xì)胞功能直接損傷和免疫介導(dǎo)反應(yīng)發(fā)生改變，可表現(xiàn)為HMGB1、ATP 等相關(guān)損傷分子和炎癥因子大量表達(dá)[1]。目前常采用缺血預(yù)處理和缺血后處理減輕IR 損傷，通過(guò)灌注減輕體內(nèi)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕肝組織灌注缺血和損傷。但這類方法存在技術(shù)難點(diǎn)大、應(yīng)用范圍小等缺點(diǎn)，近年來(lái)認(rèn)為通過(guò)病理機(jī)制靶點(diǎn)干預(yù)可從根本上有效阻止IR 損傷信號(hào)通路，且該方法普及性較高[2-3]。Toll 樣受體（Toll like receptors, TLRs）是介導(dǎo)固有免疫最重要的特異性受體之一，其中Toll 樣受體4（Toll like receptors 4, TLR4）具有識(shí)別內(nèi)外源性損傷分子模式的功能，可誘導(dǎo)趨化因子和炎癥因子的表達(dá)和炎癥介導(dǎo)反應(yīng)，可能在心臟死亡器官捐獻(xiàn)供肝IR 損傷中發(fā)揮重要作用。有研究指出，TLR4 特異性抑制劑TAK242 可阻斷TLR4 胞內(nèi)信號(hào)傳遞，從而改善組織損傷[4]。綜合考慮IR 損傷重要信號(hào)通路HMGB1/TLR4 可能受TLR4 抑制劑的影響而發(fā)揮保護(hù)或損傷作用，故可能為提高心臟死亡器官捐獻(xiàn)供肝成功率提供解決辦法。因此本研究復(fù)制大鼠模型明確TLR4 特異性抑制劑調(diào)控HMGB1/TLR4 信號(hào)通路對(duì)心臟死亡器官捐獻(xiàn)大鼠供肝IR 損傷的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只8 周齡Balb/c 雄性大鼠購(gòu)自上海南方模式生物科技股份有限公司，體重292～341 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2019-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2019-0003，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)審批號(hào)：IACUC20190308。在室溫21～26℃、濕度45%～50%、12 h 明/12 h 暗條件下，適應(yīng)性飼養(yǎng)4 周。

1.2 模型的復(fù)制與分組

常規(guī)全面檢查，將可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的合格大鼠分為4 組，每組10 只，分為4 組。①對(duì)照組：術(shù)前30 min 經(jīng)腹腔注射二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）無(wú)菌生理鹽水；②對(duì)照抑制組：術(shù)前30 min經(jīng)腹腔注射含TAK242 的DMSO 無(wú)菌生理鹽水；③模型組：術(shù)前30 min 經(jīng)腹腔注射DMSO 無(wú)菌生理鹽水；④模型抑制組：術(shù)前30 min 經(jīng)腹腔注射含TLR4 抑制劑的DMSO 無(wú)菌生理鹽水。過(guò)程中模型組和模型抑制組各死亡2 只大鼠，死亡大鼠用無(wú)差異的存活大鼠補(bǔ)充，保證每組各有6 只大鼠；復(fù)制腦死亡器官捐獻(xiàn)模型：嚴(yán)格禁食12 h，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，劑量為30 mg/kg；模型組、模型抑制組剪開(kāi)膈肌停跳心臟，對(duì)照組、對(duì)照抑制組不剪開(kāi)膈肌，30 min 后將肝臟及周?chē)芎徒M織等暴露，分離腹下腔靜脈和主動(dòng)脈，剪斷胸腔段下腔靜脈，并且用一次性靜脈輸液針穿刺腹主動(dòng)脈，4℃肝素林格液40 ml 緩慢灌注肝臟至肝臟呈淡黃色且不再變色，取下肝臟置于4℃保存液中并從門(mén)靜脈灌注4℃保存液5 ml。

1.3 標(biāo)本收集

肝臟置于4℃保存液中24 h 后進(jìn)行1 h 常溫?cái)y氧灌注，通過(guò)計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)壓力，灌注液為200 ml緩沖溶液，灌注壓力約8 mmHg，流量為1 ml/（g·min），溫度37℃，5%二氧化碳和95%氧氣混合氣體1 L/min，灌注液和氣體通過(guò)氧合膜氧合后灌入肝臟，將聚乙烯導(dǎo)管輕輕抬高到脫離液面，從中采集5 min、30 min、60 min 時(shí)的灌注液，一部分置于-80℃冰箱，一部分浸泡于4%多聚甲醛。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

商陸皂苷甲（純度＞98%，編號(hào)65497-07-6）、IL-12 p35 抗體購(gòu)自日本TaKaRa 公司，蘇木精-伊紅染色試劑盒、PBS 緩沖液、RIPA 蛋白裂解液購(gòu)自成都中仕石化有限公司，蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒、購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司，HMGB1 一抗、TLR4 一抗、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1 β, IL-1β）一抗、IL-6 一抗、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase 2, COX2）一抗、肌動(dòng)蛋白（βactin）一抗、山羊抗兔/抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，TUNEL 試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，人抗大鼠IgG 二抗購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司。熒光顯微鏡購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.5 方法

1.5.1 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色將置于4%多聚甲醛中的組織制成切片，依次脫蠟、水化、蘇木精染色、伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察HE 染色結(jié)果，參考Suzuki 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]判斷肝組織損傷程度。

1.5.2 Western blotting檢測(cè)肝細(xì)胞中HMGB1/TLR4及下游炎癥因子相對(duì)表達(dá)量將置于-80℃冰箱中的組織加入85℃、200～300 μl RIPA蛋白裂解，依次煮沸、超聲、離心，取上清液50 μg 行SDS-PAGE 電泳后封閉1 h；孵育HMGB1一抗、TLR4一抗、IL-1β一抗、IL-6一抗、COX2一抗、β-actin一抗過(guò)夜；加入羊抗兔/抗鼠二抗，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，觀察雜交信號(hào)；重復(fù)10 次后采用Image J 軟件比較各組細(xì)胞和組織HMGB1、TLR4 及下游炎癥因子IL-1β、IL-6、COX2、β-actin的灰度值比值。

1.5.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)將置于4%多聚甲醛中的組織制成切片，按照TUNEL 試劑盒說(shuō)明書(shū)方法原位檢測(cè)凋亡細(xì)胞，陰性對(duì)照不加末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，以核陽(yáng)性（細(xì)胞核呈黃褐色）為判定標(biāo)準(zhǔn)，熒光顯微鏡下觀察凋亡指數(shù)并按標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/（凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)）。

1.5.4 TLR4 與HMGB1 的共表達(dá)關(guān)系①Western blotting 檢測(cè)：取置于-80℃冰箱中的組織，按1.5.2中的操作方法比較各組細(xì)胞和組織HMGB1 與βactin灰度值比值。②免疫熒光：將置于4%多聚甲醛中的肝組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟、梯度酒精水化、去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，磷酸緩沖液反復(fù)漂洗，加入牛血清封閉液封閉，2 h 后依次滴加一抗（1∶500）、二抗（1∶100），孵育2 h，用0.01 mmol/L 磷酸緩沖液漂洗5 min/次，共3 次，干片，甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察圖像特點(diǎn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織損傷程度比較

HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)基本正常，無(wú)明顯空泡和壞死；對(duì)照抑制組肝組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)基本正常；模型組肝細(xì)胞核溶解、無(wú)正常肝結(jié)構(gòu)且部分出現(xiàn)腫脹，可見(jiàn)明顯空泡和壞死，肝竇有大量淤血；模型抑制組大部分肝組織、形態(tài)正常，無(wú)明顯壞死區(qū)域，散在一定數(shù)量的壞死肝細(xì)胞、小空泡和少量淤血（見(jiàn)圖1）。

圖1 各組大鼠肝組織損傷程度 （HE染色×200）

根據(jù)組織病理染色圖，采用Suzuki 評(píng)估大鼠肝組織損傷得分，對(duì)照組、對(duì)照抑制組、模型組、模型抑制組Suzuki 評(píng)分分別為（0.90±0.17） 分、（0.82±0.14）分、（2.79±0.40）分和（1.74±0.28）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=70.530，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：對(duì)照組與對(duì)照抑制組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.457）；模型組、模型抑制組高于對(duì)照組（P=0.000）；模型組高于模型抑制組（P=0.000）。

2.2 各組大鼠肝細(xì)胞中HMGB1/TLR4及下游炎癥因子相對(duì)表達(dá)量比較

與對(duì)照組比較，模型組HMGB1、TLR4、IL-1β、IL-6 蛋白條帶信號(hào)增強(qiáng)（見(jiàn)圖2）。對(duì)照組、對(duì)照抑制組、模型組、模型抑制組HMGB1、TLR4、IL-1β、IL-6 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：對(duì)照組與對(duì)照抑制組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組、模型抑制組高于對(duì)照組（P＜0.05）；模型組高于模型抑制組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

圖2 肝細(xì)胞中HMGB1/TLR4及下游炎癥因子的表達(dá)

表1 各組大鼠肝細(xì)胞中HMGB1/TLR4及下游炎癥因子相對(duì)表達(dá)量比較 （n=6，±s）

表1 各組大鼠肝細(xì)胞中HMGB1/TLR4及下游炎癥因子相對(duì)表達(dá)量比較 （n=6，±s）

組別對(duì)照組對(duì)照抑制組模型組模型抑制組F 值P值HMGB1 0.52±0.10 0.55±0.12 1.15±0.15 0.88±0.13 62.302 0.000 TLR4 0.98±0.18 1.06±0.20 3.54±0.21 2.47±0.25 79.524 0.000 IL-1β 0.13±0.03 0.12±0.03 0.35±0.04 0.20±0.05 80.115 0.000 IL-6 0.16±0.04 0.16±0.03 0.55±0.09 0.26±0.05 77.148 0.000

2.3 各組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率比較

對(duì)照組、對(duì)照抑制組凋亡細(xì)胞較少，分布較散亂，模型組、模型抑制組凋亡細(xì)胞較多，分布較密集（見(jiàn)圖3）。對(duì)照組、對(duì)照抑制組、模型組、模型抑制組細(xì)胞凋亡率分別為（2.30±0.33）%、（2.19±0.27）%、（20.22±1.39）%和（6.25±0.62）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=696.819，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：對(duì)照組與對(duì)照抑制組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.336）；模型組、模型抑制組高于對(duì)照組（P=0.000）；模型組高于模型抑制組（P=0.000）。

圖3 各組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡情況 （×200）

2.4 TLR4與HMGB1的共表達(dá)關(guān)系

與對(duì)照組比較，對(duì)照抑制組蛋白條帶信號(hào)無(wú)變化；與模型組比較，模型抑制組蛋白條帶信號(hào)減弱（見(jiàn)圖4）。對(duì)照組、對(duì)照抑制組、模型組、模型抑制組HMGB1 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（1.15±0.18）、（1.09±0.17）、（1.67±0.24）、（1.38±0.22），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.947，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：對(duì)照組與對(duì)照抑制組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組高于對(duì)照組（P＜0.05）；模型組高于模型抑制組（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠肝組織中HMGB1蛋白的表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)的TLR4 大鼠肝細(xì)胞內(nèi)（模型組），HMGB1 免疫活性顯著增加，且主要位于細(xì)胞漿內(nèi)；但在過(guò)表達(dá)的TLR4 的正常大鼠肝細(xì)胞內(nèi)（對(duì)照組），HMGB1 的免疫活性無(wú)顯著變化（見(jiàn)圖5）。

圖5 對(duì)照組和模型組大鼠肝組織中HMGB1的表達(dá) （免疫熒光×400）

3 討論

IR 損傷機(jī)制較復(fù)雜且存在爭(zhēng)議，臨床認(rèn)為IR損傷的主要病理機(jī)制為再灌注誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及血管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等通透性改變。隨著心臟死亡器官捐獻(xiàn)移植患者增多，經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間熱缺血損傷的肝臟對(duì)IR 損傷更為敏感。供肝IR 損傷可加重移植肝的損傷，且目前缺乏減輕心臟死亡器官捐獻(xiàn)供肝IR 損傷的方法。肝臟質(zhì)量的提高已成為臨床亟待解決問(wèn)題之一。有學(xué)者對(duì)肝IR 損傷進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)固有免疫在IR 損傷中的作用，指出TLR4可能作為IR 損傷治療的重要靶點(diǎn)[6]。李瑩瑩等[7]采用TLR4抑制劑治療IR損傷小鼠，病理結(jié)果顯示治療后小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，僅見(jiàn)少量壞死和空泡水腫。IR 損傷過(guò)程可抑制細(xì)胞代謝水平，但肝竇內(nèi)皮細(xì)胞仍持續(xù)受到損傷，可表現(xiàn)為肝竇內(nèi)皮細(xì)胞腫脹[8]；另線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步發(fā)展引起肝細(xì)胞壞死[9]。本研究中，模型組大鼠肝細(xì)胞組織發(fā)生明顯壞死，見(jiàn)大量淤血和空泡水腫，與對(duì)照組大鼠比較，肝臟損傷評(píng)分顯著升高，符合既往報(bào)道。而TLR4 抑制劑處理后，可減弱該損傷，明顯改善肝結(jié)構(gòu)和功能，提示TLR4 抑制劑可能保護(hù)供肝IR損傷。

TLR4 是定位在細(xì)胞膜的跨膜蛋白，是固有免疫中重要信號(hào)介導(dǎo)分子，可活化機(jī)體內(nèi)無(wú)菌炎癥進(jìn)而引起固有免疫受損，直接加重肝IR 損傷。李樹(shù)志等[10]的研究結(jié)果表明，TLR4 參與的免疫反應(yīng)機(jī)制為DAMPs 結(jié)合于PRR，刺激炎癥反應(yīng)，同時(shí)炎癥反應(yīng)加重引起肝細(xì)胞進(jìn)一步損傷。嚴(yán)一核等[11]的研究指出，肝IR 損傷中HMGB1 是TLR4 的關(guān)鍵配體，細(xì)胞損傷后，HMGB1 主動(dòng)釋放調(diào)控基因。本研究中模型組大鼠HMGB1、TLR4 及TLR4 下游炎癥因子IL-1β、IL-6、COX2 蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組大鼠，說(shuō)明TLR4 識(shí)別并激活了HMGB1 的表達(dá)，通過(guò)釋放大量炎癥因子來(lái)?yè)p害肝細(xì)胞。HMGB1 與TLR4 結(jié)合可激活多種信號(hào)分子IRAK1、IRAK1 磷酸化，促進(jìn)NF-κB 的轉(zhuǎn)位[12-13]。IL-1β 是固有免疫中重要的早期反應(yīng)細(xì)胞因子。紀(jì)曉方等[14]指出肝損傷小鼠模型肝臟中IL-1β 呈高表達(dá)，顯著高于健康小鼠，提示IL-1β 是肝IR 損傷的危險(xiǎn)因子。IL-6 可與受體IL-6R 結(jié)合形成復(fù)合物，通過(guò)膜蛋白信號(hào)通路發(fā)揮炎癥介導(dǎo)作用。李紅霞等[15]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)IL-6 的肝臟移植大鼠肝臟損傷減??；同時(shí)，臨床發(fā)現(xiàn)肝損傷患者IL-6 水平顯著升高。黎真真等[16]發(fā)現(xiàn)異丙酚可通過(guò)下調(diào)心肌組織中TLR4、HMGB1 表達(dá)來(lái)減輕大鼠MIRI 介導(dǎo)的心肌組織損傷及炎癥反應(yīng)。本研究中模型抑制組大鼠較模型組大鼠HMGB1、TLR4 及TLR4 下游炎癥因子IL-1β、IL-6 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降，提示TLR4 抑制劑阻斷了TLR4 活化激活通路，抑制了炎癥因子的釋放。本研究結(jié)果基本符合既往報(bào)道，TLR4 抑制劑可通過(guò)抑制HMGB1 激活來(lái)下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而減輕供肝IR 損傷。在熱缺血階段，肝細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p害，可表現(xiàn)為大量肝細(xì)胞凋亡，本研究中模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡率最高可達(dá)22%。而過(guò)表達(dá)TLR4 抑制劑后，TLR4 對(duì)肝IR 損傷受到影響，肝組織細(xì)胞凋亡率顯著降低，進(jìn)一步說(shuō)明特異性TLR4 抑制劑對(duì)肝IR 損傷的保護(hù)作用。免疫熒光和Western blotting 檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了TLR4 與HMGB1 的共表達(dá)作用，在IR 損傷大鼠中，過(guò)表達(dá)TLR4 可顯著升高HMGB1，而TLR4 抑制物可逆轉(zhuǎn)TLR4 過(guò)表達(dá)對(duì)HMGB1 的促進(jìn)作用。

綜上所述，TLR4 特異性抑制劑可顯著下調(diào)HMGB1/TLR4 信號(hào)通路及相關(guān)信號(hào)分子，減輕心臟死亡器官捐獻(xiàn)大鼠肝臟氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，對(duì)供肝IR 損傷具有保護(hù)作用。本研究不足之處在于采用體外灌注系統(tǒng)來(lái)評(píng)估肝臟情況，可能存在一定誤差，需要在臨床工作中加以關(guān)注并進(jìn)一步分析。