沈曉瑩，胡澤斌，張小燕，朱智東，亓垚，陳明敏，楊國翠，劉晶晶，任燕，徐成香，郜恒駿

·論著·

PAPSS1的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床指標(biāo)和預(yù)后的相關(guān)性及對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響

沈曉瑩*，胡澤斌*，張小燕，朱智東，亓垚，陳明敏，楊國翠，劉晶晶，任燕，徐成香，郜恒駿

201203 上海芯超生物科技有限公司（沈曉瑩、張小燕、朱智東、亓垚、陳明敏、楊國翠、劉晶晶、任燕、徐成香、郜恒駿）；100850 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所（胡澤斌）

研究 PAPSS1 表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床指標(biāo)和預(yù)后的相關(guān)性，及其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。采用免疫組化方法檢測(cè) PAPSS1、PDL1 蛋白在腦膠質(zhì)瘤樣本的表達(dá)，并納入 SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中，PAPSS1 和 PDL1 之間及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析采用 Spearman 法；生存期單因素分析采用Kaplan-Meier 法和 log-rank 檢驗(yàn)，將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入 COX 多元回歸生存分析。使用 siRNA 技術(shù)降低 PAPSS1 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)。轉(zhuǎn)染 48 h 后，利用 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖比率，利用 Hochest/PI 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；PAPSS1、PDL1、ki67 和 Bcl2 等基因的表達(dá)變化使用qPCR 檢測(cè)。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 GraphPad 軟件分析。< 0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IHC 數(shù)據(jù)分析顯示，癌組織PAPSS1 漿表達(dá)和患者年齡、病理分級(jí)、復(fù)發(fā)等顯著正相關(guān)，而PAPSS1 核表達(dá)和各臨床指標(biāo)均無關(guān)，PDL1 表達(dá)僅和年齡有關(guān)；PAPSS1 漿表達(dá)和 PDL1 表達(dá)之間也顯著正相關(guān)。生存分析顯示，PAPSS1 漿高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤患者擁有更差的總生存期和無病生存期；PAPSS1 核表達(dá)和 PDL1 表達(dá)都與預(yù)后無關(guān)。當(dāng)使用 siRNA 技術(shù)降低了 PAPSS1 在癌細(xì)胞的表達(dá)時(shí)，細(xì)胞增殖比率出現(xiàn)下降而凋亡率上升，PDL1、ki67 和 Bcl2 等基因的 mRNA 表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn) PAPSS1 漿表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者的年齡、病理分級(jí)、復(fù)發(fā)及更短的預(yù)后顯著相關(guān)；降低 PAPSS1 表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，同時(shí)也下調(diào)了 PDL1、ki67、Bcl2等基因的表達(dá)水平，提示 PAPSS1 與腦膠質(zhì)瘤的個(gè)性化治療相關(guān)，值得進(jìn)一步研究和探討。

PAPSS1； 腦膠質(zhì)瘤； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

大多數(shù)腦腫瘤是起源于膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)瘤，常被診斷為惡性腦腫瘤[1]。根據(jù) WHO 病理分級(jí)系統(tǒng)，膠質(zhì)瘤分為四級(jí)（I ～ IV 級(jí)）[2]。其中，III 級(jí)和 IV 級(jí)是高級(jí)別，預(yù)后差，需要積極的治療[3-5]。膠質(zhì)瘤的確切病因尚不清楚，患者在診斷和積極治療后的平均預(yù)期壽命只有約 14 個(gè)月[6]。因此，非常有必要尋找更有效的分子預(yù)后標(biāo)志物用于腦膠質(zhì)瘤患者的臨床預(yù)測(cè)和治療。

3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸合酶（3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase，PAPSS）是一種能產(chǎn)生硫酸鹽供體3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸鹽（PAPS）的酶[7]。PAPSS 分為兩個(gè)獨(dú)立的亞型：PAPSS1 和 PAPSS2。其中，PAPSS1 的總長(zhǎng)度約為 108 kb，定位于人類染色體 4q24[8]。有限的研究證實(shí)，PAPSS1 參與了乙型肝炎感染過程[9]，并在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染中起著尚未明確的作用[10]；PAPSS1 可能參與了雌激素對(duì)乳腺癌的調(diào)控通路[11]，其過表達(dá)還可能對(duì)肺癌的化療產(chǎn)生抵抗作用[12-13]。2018 年關(guān)于腦膠質(zhì)瘤的文獻(xiàn)顯示，包括 PAPSS1 和 PAPSS2 在內(nèi)的多個(gè)代謝相關(guān)的酶的基因在腦膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)顯著高于瘤旁組織，但該文獻(xiàn)并沒有就 PAPSS1 基因的分子生物學(xué)功能進(jìn)行詳細(xì)研究[14]。另一方面，最近針對(duì)程序性死亡受體蛋白 1（PD-1）及其配體（PDL1）的免疫治療在許多癌癥中取得了突破，但仍然沒有在膠質(zhì)瘤中獲得比較確定的療效，其機(jī)制研究也不甚清晰。

因此，本研究采用免疫組化技術(shù)研究 PAPSS1 和 PDL1 在腦膠質(zhì)瘤樣本的表達(dá)，并分析兩個(gè)抗體之間以及它們和臨床指標(biāo)及患者預(yù)后的相關(guān)性；然后，選擇其中和預(yù)后顯著相關(guān)的基因，采用 siRNA 技術(shù)降低其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，研究其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織芯片 腦膠質(zhì)瘤組織芯片（HBraG180Su02）購自上海芯超生物科技有限公司，包含180 例腦膠質(zhì)瘤樣本。病人的手術(shù)時(shí)間為 2008 年 2 月到 2011 年 10 月，隨訪到 2017 年 7 月，隨訪時(shí)間為 69 ～ 113 個(gè)月，失訪 1 例。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 一抗 PAPSS1（14708-1-AP）購買于 Proteintech 公司；一抗 PDL1（GT2280）購于基因科技股份有限公司；HRP 標(biāo)記的二抗（DM827）和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）購自 DAKO公司；腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U87MG 和 U251MG 購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；10% 胎牛血清和 DMEM 培養(yǎng)液購自 Gibco 公司；轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 和逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScript IV Reverse Transcriptase均購自 Thermo Fisher公司；小干擾RNAsiRNA-PAPSS1（簡(jiǎn)稱 si-PAPSS1）和 siRNA-NC（簡(jiǎn)稱NC）由基因制藥公司合成；檢測(cè)細(xì)胞增殖的 CCK8 試劑盒購自 Vazyme 公司；凋亡染色液 Hochest 和 PI 采購于 Beyotime Biotechnology 公司；Trizol 試劑購自美國 Sigma 公司；qPCR 反應(yīng)試劑 SYBR?預(yù)混料 Ex-Taq? II（Tli RNaseH Plus）購自 Takara 公司；各基因的 qPCR 引物由上海生工合成。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱（HCP-80）購自海爾公司；酶標(biāo)儀（ARM-100）購自 All For Life Science 公司；ACUMEN eX3 掃描儀購自 TTP-LabTech 公司；熒光定量 PCR 儀（LightCycler480）購自羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)（IHC） 組織芯片進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)，再分別加入一抗 PAPSS1（1:1000）和 PDL1（即用型）4 ℃孵育過夜。然后，添加 HRP 標(biāo)記的二抗孵育 20 min，用 PBST 緩沖液沖洗，使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，最后封片并判讀。選擇典型染色視野，分別判讀癌細(xì)胞的平均染色強(qiáng)度和染色百分率。染色強(qiáng)度評(píng)分為：無染色（0 分）、弱染色（1 分）、中等染色（2 分）和強(qiáng)染色（3 分）。染色百分率評(píng)分為：0%（0 分）、1% ～ 20%（1 分）、21% ～ 40%（2 分）、41% ～ 60%（3 分）、61% ～ 80%（4分）、81% ～ 100%（5 分）。染色總分 = 染色強(qiáng)度評(píng)分 × 染色百分率評(píng)分。PAPSS1 的胞漿和胞核染色分別判讀評(píng)分，PDL1 的漿染色和膜染色因無法區(qū)分而一起判讀評(píng)分。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U87MG 和 U251MG 被接種于含有10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液中，在37 ℃的 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。接著，重新調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至100 000/ml，向6 孔板的每孔加入2 ml 細(xì)胞懸浮液，37 ℃培養(yǎng)24 h。隨后去除原培養(yǎng)基，輕柔清洗細(xì)胞，加入轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 和siRNA，37 ℃轉(zhuǎn)染6 h 后更換為含 90% DMEM 和 10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基。

1.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染 24 h 的腫瘤細(xì)胞接種在96 孔板中，每孔加入100 μl 細(xì)胞懸液。培養(yǎng) 24 h 后，每孔加入 10 μl CCK8 于 37 ℃孵育 1.5 h，使用酶標(biāo)儀在 450 nm 測(cè)定吸光度。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式如下：細(xì)胞增殖率 =（實(shí)驗(yàn)組–空白組）/（對(duì)照組–空白組）× 100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染 24 h 的腫瘤細(xì)胞接種在 96 孔板中，每孔加入 100 μl細(xì)胞懸液。培養(yǎng) 24 h 后，每孔加入 100 μl染色液Hochest/PI，37 ℃避光染色 20 min。使用ACUMEN 儀器掃描判讀。

1.2.5 RNA 抽提和熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)（qPCR） 轉(zhuǎn)染 48 h 后的癌細(xì)胞被消化和收集。使用 Trizol 法提取總 RNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄酶 SuperScript IV Reverse Transcriptase 合成 cDNA。采用qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PAPSS1、PDL1、ki67、Bcl2 等基因在各組細(xì)胞的表達(dá)水平，Actin 作為內(nèi)參。qPCR 實(shí)驗(yàn)的每孔反應(yīng)總體積為 50 μl，其中包括 2 μl 0.4 μmol/L 引物混合物、25 μl SYBR 綠色母料混合物、4 μl DNA 模板和 16 μl無 RNase/Dnase 無菌水。qPCR 實(shí)驗(yàn)的程序設(shè)置如下：初始變性為 95 ℃反應(yīng) 30 s；然后，95 ℃反應(yīng) 5 s，60 ℃反應(yīng) 30 s，40 個(gè)循環(huán)，在 60 ℃延伸階段收集熒光數(shù)據(jù)；最后，在 95 ℃下反應(yīng) 5 s，60 ℃反應(yīng)1 min，95 ℃結(jié)束，在 60 ～ 90 ℃階段收集熒光數(shù)據(jù)。用于 qPCR 實(shí)驗(yàn)的基因引物序列見表 1。

表 1 qPCR 實(shí)驗(yàn)的基因引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

排除脫落的組織點(diǎn)，實(shí)際獲得 177 例病人的 IHC 染色數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)被納入SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中，抗體表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性、抗體表達(dá)之間的相關(guān)性分析采用Spearman 法，各指標(biāo)和生存期的單因素分析采用 Kaplan-Meier 法和 log-rank 檢驗(yàn)，將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入 COX 多元回歸生存分析。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和 qPCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都納入 GraphPad 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。< 0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAPSS1 漿表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤病人的年齡、病理分級(jí)、復(fù)發(fā)以及更差的預(yù)后顯著相關(guān)

IHC 染色結(jié)果表明，PAPSS1 在腦膠質(zhì)瘤樣本的胞漿和胞核均有表達(dá)，且所有樣本均顯示出陽性染色，沒有陰性染色病例（圖 1A）；PDL1 主要表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤組織的胞漿和胞膜，但僅有約 21% 的樣本顯示陽性染色，約 79% 的樣本為陰性染色（圖 1B）。

Spearman 相關(guān)性分析顯示：PAPSS1 的漿表達(dá)分別和患者的年齡、病理分級(jí)、復(fù)發(fā)等顯著正相關(guān)（0.259，= 0.001）（= 0.445，= 0.000）（= 0.406，= 0.000），而其核表達(dá)與各臨床指標(biāo)均沒有相關(guān)性（> 0.05）；PDL1 表達(dá)則僅和患者年齡顯著正相關(guān)（= 0.149，= 0.047）（表 2）。分析還發(fā)現(xiàn)，PDL1 在腦膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)與 PAPSS1 漿表達(dá)顯著正相關(guān)（= 0.153，= 0.043），而與 PAPSS1 核表達(dá)無關(guān)（= 0.688）；PAPSS1 的漿表達(dá)與核表達(dá)之間也沒有相關(guān)性（= 0.827）（表 3）。

生存期單因素分析顯示，PAPSS1 漿高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人擁有更短的總生存期和無病生存期（50.0% 比 78.3%，= 0.000）（22.9% 比 61.3%，= 0.000）（圖 2A），而PAPSS1 核表達(dá)（圖 2B）、PDL1 表達(dá)（圖 2C）等均與預(yù)后無關(guān)（> 0.05）。隨后的 COX 多元回歸分析表明 PAPSS1 漿表達(dá)并不是兩種生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（= 0.117，= 0.783），而年齡、病理分級(jí)等指標(biāo)分別是腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（< 0.01）（表 4、表 5）。

2.2 減少 PAPSS1 表達(dá)能顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡

由于 PAPSS1 表達(dá)與病人臨床指標(biāo)及預(yù)后顯著相關(guān)，使用siRNA-PAPSS1（簡(jiǎn)寫 si-PAPSS1）和 siRNA-NC（簡(jiǎn)寫 NC）分別轉(zhuǎn)染了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87MG 和 U251MG。qPCR 檢測(cè)顯示，和對(duì)照組 NC 相比，si-PAPSS1 組的 PAPSS1 的表達(dá)水平出現(xiàn)了顯著減少，分別在細(xì)胞 U87MG 和 U251MG 降低了 84.8% 和 92.5%（= 0.000，= 0.000）（圖 3）。隨后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組細(xì)胞相比較，轉(zhuǎn)染 si-PAPSS1 的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的細(xì)胞增殖顯著降低而細(xì)胞凋亡顯著增加。其中，U87MG 細(xì)胞的增殖率降低 25.4%（= 0.001），凋亡率增加 215.7%（= 0.000）；U251MG 細(xì)胞的增殖率降低 18%（= 0.001），凋亡率增加 85.0%（= 0.000）（圖 4）。

圖 1 PAPSS1（A）、PDL1（B）在腦膠質(zhì)瘤樣本的免疫組化染色圖片

Figure 1 Immunohistochemical staining of PAPSS1(A) and PDL1(B) in glioma samples

表 2 腦膠質(zhì)瘤病人的臨床指標(biāo)和 PAPSS1、PDL1 表達(dá)的相關(guān)性分析

注：*< 0.05，#< 0.01，△< 0.001。

Note:*< 0.05,#< 0.01,△< 0.001.

表3 PAPSS1 和 PDL1 在腦膠質(zhì)瘤樣本表達(dá)的相關(guān)性分析

注：*< 0.05，#< 0.01，△< 0.001。

Note:*< 0.05,#< 0.01,△< 0.001.

2.3 下調(diào) PAPSS1 表達(dá)能減少 PDL1、ki67 和 Bcl2 等基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)水平

利用 qPCR 方法檢測(cè)了 PDL1、促增殖基因ki67 和抗凋亡基因Bcl2 在轉(zhuǎn)染 48 h 后的癌細(xì)胞中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：和對(duì)照組相比，PDL1、ki67 和Bcl2 等基因的 mRNA 表達(dá)水平在兩個(gè)轉(zhuǎn)染 si-PAPSS1 的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中都出現(xiàn)了顯著下調(diào)。其中，PDL1、ki67 和Bcl2 表達(dá)在細(xì)胞U87MG 分別降低了 43.6%（< 0.001）、20.1%（= 0.002）、32.0%（= 0.001），在細(xì)胞 U251MG 分別降低了 27.4%（< 0.001）、29.9%（< 0.001）、24.4%（= 0.030）（圖 3）。

Figure 2 Kaplan-Meier and log-rank methods were used to analyze the correlation between protein expression and the prognosis of glioma patients (A: Glioma patients with high PAPSS1 expression in cytoplasm had significantly shorter overall survival and disease-free survival; B: There was no correlation ship between the nucleus expression of PAPSS1 and the overall survival, as well as disease-free survival of glioma; C: Expression of PDL1 was also uncorrelated with the overall survival and disease-free survival of glioma patients)

表 4 總生存期的 COX 多元回歸分析

注：#< 0.01，△< 0.001。

Note:#< 0.01,△< 0.001.

表 5 無病生存期的 COX 多元回歸分析

注：△< 0.001。

Note:△< 0.001.

圖 3 qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用 si-PAPSS1 轉(zhuǎn)染技術(shù)在減少 PAPSS1（A）在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)的同時(shí)，也能顯著降低 PDL1（B）、ki67（C）、Bcl2（D）的表達(dá)水平（*P < 0.05，#P < 0.01，△P < 0.001）

Figure 3 The qPCR results showed that PAPSS1 (A) expression was reduced by si-PAPSS1 transfection in glioma cells meanwhile the expression of PDL1 (B), ki67 (C) and Bcl2 (D) were also decreased significantly (*< 0.05,#< 0.01,△< 0.001)

3 討論

腦膠質(zhì)瘤組織芯片的 IHC 實(shí)驗(yàn)顯示，PAPSS1 蛋白同時(shí)表達(dá)在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，這與Xu 等[11]關(guān)于乳腺癌的報(bào)道相一致。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，PAPSS1 漿表達(dá)和腦膠質(zhì)瘤病人的年齡、病理分級(jí)、復(fù)發(fā)等顯著正相關(guān)，且漿高表達(dá)的病人擁有顯著更短的總生存期和無病生存期；而核表達(dá)卻與各臨床指標(biāo)及預(yù)后都不相關(guān)。由此我們推測(cè)，PAPSS1 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的不同表達(dá)定位可能發(fā)揮不同的作用，其漿表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，而核表達(dá)則可能與腫瘤無關(guān)。類似的，關(guān)于卵巢癌的文獻(xiàn)也顯示，PAPSS1 高表達(dá)的卵巢癌病人擁有更差的無病生存期[13]。而關(guān)于肺癌的預(yù)后分析則顯示了更加復(fù)雜的結(jié)論，即：在不區(qū)分治療情況時(shí)，PAPSS1 高表達(dá)的肺癌病人擁有更長(zhǎng)的總生存期；但是，當(dāng)只分析接受化療的肺癌病例時(shí)，PAPSS1 高表達(dá)的病人卻顯示了更差的預(yù)后。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PAPSS1 高表達(dá)能導(dǎo)致肺癌對(duì)于順鉑耐藥，并可能因此降低了化療病人的預(yù)后[12-13]。

圖 4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)（A：減少 PAPSS1 表達(dá)能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖；B：降低 PAPSS1 表達(dá)能顯著促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡；#P < 0.01，△P < 0.001）

Figure 4 Cell proliferation experiment and apoptosis experiment (A: Reducing the expression of PAPSS1 could significantly inhibit the proliferation of glioma cells; B: Down regulation of PAPSS1 could also significantly promote the apoptosis of glioma cell;#< 0.01,△< 0.001)

關(guān)于 PDL1 的 IHC 染色結(jié)果顯示，PDL1 同時(shí)表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤組織的胞漿和胞膜，但僅有約 21% 的病例顯示陽性，約 79% 的病例為陰性。事實(shí)上，前期的文獻(xiàn)顯示不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)到的 PDL1 在腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)水平差異巨大[15-17]，這可能與使用的抗體及樣本的不同、實(shí)驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)差異等有關(guān)。同樣的，研究 PDL1 表達(dá)和膠質(zhì)瘤預(yù)后的文獻(xiàn)也非常多，但結(jié)論各不相同。其中的部分文獻(xiàn)證實(shí) PDL1 的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)。例如，根據(jù) TCGA（The Cancer Genome Atlas）和 CGGA（Chinese Glioma Genome Atlas）這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的 mRNA 數(shù)據(jù)的 Meta 分析發(fā)現(xiàn)，在分別涉及 976 名和 1052 名膠質(zhì)瘤患者的兩項(xiàng)研究中，PDL1 mRNA 高表達(dá)病人的總生存率均顯著更短[18-19]。同時(shí)，多篇基于IHC 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的研究也得到了與上述文獻(xiàn)類似的結(jié)論[20-23]。然而，另有研究報(bào)道認(rèn)為PDL1 表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后無關(guān)。例如，基于 TCGA 數(shù)據(jù)庫的 IHC 數(shù)據(jù)分析認(rèn)為 PDL1 表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者的總生存期之間沒有顯著相關(guān)性[24-25]。而我們關(guān)于 PDL1 的 IHC 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析顯示：PDL1 表達(dá)只和患者的年齡顯著正相關(guān)，而和總生存期及無病生存期均沒有相關(guān)性。有趣的是，Spearman 分析顯示，PDL1 表達(dá)和 PAPSS1 漿表達(dá)顯著正相關(guān)，而與 PAPSS1 核表達(dá)無關(guān)。我們猜測(cè)，PDL1 可能參與了 PAPSS1 的促癌過程。

采用 siRNA 技術(shù)沉默了 PAPSS1 基因的部分表達(dá)，使其在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87MG 和 U251MG 的抑制效率分別達(dá)到了84.8% 和 92.5%。隨后的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，PAPSS1 基因的下調(diào)顯著抑制了 2 個(gè)腫瘤細(xì)胞的增殖而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。同時(shí)，qPCR 實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，si-PAPSS1 轉(zhuǎn)染在下調(diào) PAPSS1 表達(dá)的同時(shí)，也顯著減少了 PDL1、促增殖基因 ki67 和抗凋亡基因Bcl2 等的表達(dá)，這也提示了 PAPSS1 的促癌作用。前期關(guān)于乳腺癌的文獻(xiàn)[11]也報(bào)道了 PAPSS1 表達(dá)和增殖凋亡信號(hào)通路基因的表達(dá)存在一定相關(guān)性——在添加雌激素時(shí)，SULT1E1 和（或）PAPSS1 的過度表達(dá)能阻斷雌激素對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的促增殖作用，并促進(jìn) H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；上述抑癌功能可能通過下調(diào) C-myc、Cyclin D1、Bcl2 等基因來完成。

總之，我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn) PAPSS1 漿表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤病人的年齡、病理分級(jí)、復(fù)發(fā)和預(yù)后等指標(biāo)都顯著相關(guān)，降低 PAPSS1 的表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡，還能顯著降低ki67、Bcl2等基因的表達(dá)水平。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)了 PAPSS1 對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的促癌功能。另外，我們還發(fā)現(xiàn) PAPSS1 表達(dá)與 PDL1 表達(dá)顯著相關(guān)，降低癌細(xì)胞的PAPSS1 表達(dá)水平也會(huì)抑制 PDL1 的表達(dá)，這其中的機(jī)制可能關(guān)系到病人的個(gè)性化治療，值得我們進(jìn)一步研究和探討。

志謝 感謝實(shí)驗(yàn)室工作人員對(duì)本研究實(shí)驗(yàn)過程的支持和協(xié)助；感謝綜合管理部對(duì)本研究所用試劑耗材的采購和管理；最后，感謝國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和國家科技重大專項(xiàng)對(duì)本文的經(jīng)費(fèi)支持。

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The correlation between PAPSS1 expression and the clinical indicators as well as the prognosis of glioma patients and its effect on cell proliferation and apoptosis

SHEN Xiao-ying, HU Ze-bin, ZHANG Xiao-yan, ZHU Zhi-dong, QI Yao, CHEN Ming-min, YANG Guo-cui, LIU Jing-jing,REN Yan, XU Cheng-xiang, GAO Heng-jun

Shanghai Outdo Biotech CO., LTD., Shanghai 201203, China (SHEN Xiao-ying, ZHANG Xiao-yan, ZHU Zhi-dong, QI Yao, CHEN Ming-min, YANG Guo-cui, LIU Jing-jing, REN Yan, XU Cheng-xiang, GAO Heng-jun); Institute of In-vitro Diagnostic Reagents in National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100850, China (HU Ze-bin)

To investigate the correlation between PAPSS1 expression and the clinical indicators as well as the prognosis of glioma patients, and its effect on cell proliferation and apoptosis.IHC was used to detect the protein expression of PAPSS1 and PDL1 in glioma samples, then the staining scores were analyzed by SPSS software. Spearman method was used to analyze the correlation between PAPSS1 and PDL1, so did the relationship between the protein expression and clinical indicators. Kaplan-Meier and log-rank test were used to analyze the univariate survival, then the statistically significant variables were all included in COX multiple regression survival analysis. After that, siRNA technology was used to reduce the expression of PAPSS1 in glioma cells. After transfection for 48 hours, the cell proliferation was detected by MTT assay, the apoptosis rate was examined by Hochest/PI assay, and the expression of PAPSS1,PDL1, ki67 and Bcl2 were all detected by qPCR technology. These experimental data were analyzed by GraphPad software.< 0.05 was statistically significant.The data from IHC analysis showed that the cytoplasmic expression of PAPSS1 in cancer tissues was positively correlated with age, pathological grade and recurrence, while the nuclear expression was not related to any clinical index and PDL1 expression was only related to age. The results from survival analysis showed that glioma patients with high cytoplasmic PAPSS1 had worse overall survival and disease-free survival; while the nuclear expression of PAPSS1 was not associated with the prognosis and so was PDL1. Subsequently, siRNA reduced the expression of PAPSS1 in glioma cells, then decreased cell proliferation rate but increased the apoptosis rate. At the same time, the mRNA expression level of PDL1, ki67 and Bcl2 were all significantly down regulated.PAPSS1 expression in cytoplasm is significantly correlated with age, pathological grade, recurrence and shorter prognosis of glioma patients. Reducing PAPSS1 expression could inhibit tumor cell proliferation and promote cell apoptosis, meanwhile significantly down regulate PDL1, ki67 and Bcl2. These results demonstrated that PAPSS1 could promote glioma. It was worth noting that the cytoplasmic expression of PAPSS1 was also positively correlated with the expression of PDL1 in glioma sample and reducing PAPSS1 in tumor cell could also inhibit PDL1, all of which might be related to the personalized treatment of glioma and was worthy of further study.

PAPSS1; brain glioma; cell proliferation; cell apoptosis

GAO Heng-jun, Email: hengjun_gao@shbiochip.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.06.005

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFC0908403、2018YFC1200503、2017YFC0908303）；國家科技重大專項(xiàng)（2018ZX10302207-003-005）

郜恒駿，Email：hengjun_gao@shbiochip.com

2021-04-16

*同為第一作者