鄧春平，梅雄，王星，劉翠華

·論著·

重組抗VEGF單抗工藝特異性宿主細胞蛋白質(zhì)殘留ELISA檢測方法的建立與驗證

鄧春平，梅雄，王星，劉翠華

519085 廣州，百奧泰生物制藥股份有限公司（鄧春平、梅雄、劉翠華）；63110 St. Louis，ArrayBridge Inc.（王星）

建立重組抗 VEGF 單抗中 CHO 宿主細胞蛋白質(zhì)（HCPs）殘留的 ELISA 檢測方法，并對方法進行驗證。采用空載 CHO 細胞制備工藝特異 HCPs，并進行二維電泳表征；采用二維電泳-Western blot（2D SDS-PAGE/Western blot）法對 6 種抗 CHO HCPs 多克隆抗體（C3、C6、C7、AB000103-A、AB000103-C、3G-0016-AF）識別重組抗 VEGF 單抗工藝特異性 HCPs 的覆蓋率進行測定；選擇覆蓋率最高的多抗作為檢測抗體，建立制品工藝特異性 HCPs ELISA檢測方法，并對方法的線性、基質(zhì)干擾、稀釋線性、靈敏度、精密度和準確性進行驗證；此外對該方法與商業(yè)化通用檢測方法進行了橋接對比研究。制備的工藝特異性 HCPs 蛋白質(zhì)譜分布廣泛；篩選得到覆蓋率為 59% 的 C6 兔抗 CHO HCPs 多抗作為檢測抗體，并建立了夾心 ELISA 檢測法；該方法不受原液基質(zhì)干擾，HCPs 標準品在 3.33 ～ 810 ng/ml 濃度范圍曲線擬合良好，原液在 1 ～ 8 倍范圍內(nèi)有良好的稀釋線性；檢測限 0.075 ng/ml，定量限 20 ng/ml；試驗內(nèi)和試驗間變異系數(shù)均不超過 10%；30、150 及 300 ng/ml 濃度的 HCPs 標準品的回收率分別為 107%、107% 和 95%；工藝特異性 ELISA法測得的結(jié)果顯著高于商業(yè)化通用檢測方法。建立了重組抗 VEGF 單抗工藝特異性 HCPs ELISA 檢測方法，該方法具有良好的檢出率、靈敏度、精密度、準確性和線性，適用于該制品 HCPs 殘留檢測。

重組抗 VEGF 單抗； CHO 細胞； 宿主細胞蛋白質(zhì)； 酶聯(lián)免疫吸附法

宿主細胞蛋白質(zhì)（host cell proteins，HCPs）是由宿主細胞產(chǎn)生或編碼的與預(yù)期目標藥物無關(guān)的蛋白質(zhì)，其組成復雜，主要與宿主表達系統(tǒng)和活性成分的表達方式有關(guān)[1]。由于 HCPs 來源于非人表達系統(tǒng)，其外來或“非自身”的特性決定幾乎任何單個 HCP 都有可能在人體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)[2]。HCPs 在人體內(nèi)的不良反應(yīng)包括：誘導機體產(chǎn)生抗 HCPs 抗體，從而引起過敏反應(yīng)，或發(fā)揮“佐劑效應(yīng)”誘發(fā)機體產(chǎn)生抗藥抗體[3-4]；有些來源于哺乳動物細胞的 HCPs 具有生物學活性，可能在人體內(nèi)發(fā)揮作用（如細胞因子和趨化因子家族）[5]，從而影響藥物的安全性和有效性；HCPs 中的蛋白酶還會影響細胞培養(yǎng)上清中的 HCPs 組成，從而影響后續(xù)純化工藝對 HCPs 的清除[4, 6]；另外 HCPs 的蛋白酶活性會降解藥物蛋白或促進蛋白制劑中的聚山梨酯降解而影響藥物蛋白的穩(wěn)定性[2, 7-8]。鑒于 HCPs 對患者的安全性和產(chǎn)品的有效性的潛在影響，在純化工藝中必須對 HCPs 進行監(jiān)測和控制，有效去除 HCPs，并保持工藝的穩(wěn)健性。

目前 HCPs 分析和檢測的主要方法有一維電泳（1D SDS-PAGE）或二維電泳法（2D SDS-PAGE）、高效液相色譜法、毛細管電泳法、質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等[6, 9-10]。不同的分析方法各有其優(yōu)缺點，其中 ELISA 法因高特異性、高靈敏度、數(shù)據(jù)定量及通量高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于重組生物制品的質(zhì)量控制[1, 9]?？?HCPs 多克隆抗體和 HCPs 標準品是 ELISA 法的關(guān)鍵試劑，該多抗對重組生物制品中 HCPs 的識別能力可直接影響 HCPs 的測定結(jié)果；因此，需對檢測用 HCPs 多抗識別 HCPs 的能力（一般稱為覆蓋率）進行分析[9, 11]；理想的多克隆抗體應(yīng)能識別大部分 HCPs 蛋白[11]。

本研究采用 2D SDS-PAGE/Western blot 法對 6 種抗 CHO HCPs 多抗識別重組抗 VEGF 單抗工藝特異性 HCPs 的覆蓋率進行分析測定，并挑選覆蓋率最高的一種多抗作為檢測用抗體，建立測定該單抗制品中殘留 HCPs 的夾心 ELISA 法，并對方法進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與樣品 CHO-K1 細胞（含空載質(zhì)粒）及重組人抗 VEGF 單抗原液均由百奧泰生物制藥股份有限公司制備和保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 兔抗 CHO HCPs 多抗（編號：C3, C6, C7, AB000103-A, AB000103-C）為美國ArrayBridge 公司專有產(chǎn)品；生物素標記的兔抗 CHO HCPs 多抗（編號：C6-Biotin）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的鏈霉親和素及 TMB 底物溶液購自淄博云橋生物技術(shù)有限公司；山羊抗 CHO HCPs 多抗（編號：3G-0016-AF）和 HCPs ELISA 試劑盒（F550）均購自美國 Cygnus 公司；熒光染料 Sypro Ruby Protein Blot Stain 購自美國 Thermo Scientific公司；IRDye 800CW 標記的驢抗山羊 IgG 復合物和 IRDye 800CW 標記的驢抗兔 IgG 復合物均購自美國 Li-COR 公司；ETTAN IPGphor 3 等電聚焦儀和 ETTAN DALTsix 電泳槽為美國 GE Healthcare 公司產(chǎn)品；ScanMaker i800 掃描儀為上海中晶科技有限公司產(chǎn)品；PROTEAN i12TMIEF Cell 等電聚焦儀、Mini-PROTEAN Tetra System 電泳槽及 ChemiDoc 成像系統(tǒng)購自美國 Bio-Rad 公司；SpectraMax M4 酶標儀為美國 Molecular Device 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 工藝特異性 HCPs 的制備 參照文獻[11-12]，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的 CHO-K1 細胞采用相同的生產(chǎn)培養(yǎng)基模擬重組人抗 VEGF 單抗上游細胞培養(yǎng)工藝制備細胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)超濾濃縮置換緩沖液后獲得上游工藝特異性 HCPs，經(jīng) BCA 法測定蛋白質(zhì)含量后，作為建立 ELISA 法的標準品。

1.2.2 工藝特異性 HCPs 的二維電泳表征 HCPs標準品經(jīng)丙酮沉淀處理后，用 Bradford 法測定蛋白質(zhì)含量。第一維等電聚焦電泳的 HCPs 上樣量 300 μg，采用 17 cm/pH 3 ～ 10 干膠條在 ETTANIPGphor 3 等電聚焦儀上先進行等電聚焦分離；第二維 SDS-PAGE 采用 12.5% 分離膠，在 ETTAN DALTsix 電泳槽上進行分離；銀染法對凝膠進行蛋白質(zhì)染色，而后對凝膠進行掃描與拍照；采用 GE Image Master 2D platinum 5.0 分析軟件對凝膠上的斑點數(shù)目進行分析統(tǒng)計。

1.2.3 HCPs 多抗識別 HCPs 的覆蓋率分析 第一維等電聚焦電泳的 HCPs 標準品上樣量 1 mg，采用 18 cm/pH 3 ～ 10 干膠條在 PROTEAN i12TMIEF Cell 等電聚焦儀上先進行等電聚焦分離；第二維 SDS-PAGE 采用 4% ～ 20% 梯度分離膠，在 Mini-PROTEAN 電泳槽上進行分離；采用熒光染料 Sypro Ruby 對凝膠進行總蛋白質(zhì)染色后，ChemiDoc 成像系統(tǒng)對凝膠進行曝光拍照或?qū)δz進行轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜后，1% 牛血清白蛋白（BSA）于室溫下封閉 2 h；分別加入 5 種兔抗 CHO HCPs 多抗（稀釋終濃度為 2.7 μg/ml）及山羊抗 CHO HCPs 多抗（稀釋終濃度為 0.53 μg/ml），室溫孵育 90 min；洗滌后加入 IRDye 800CW 標記的驢抗兔 IgG 復合物（1:5000 稀釋）或 IRDye 800CW 標記的驢抗山羊 IgG 復合物（1:5000 稀釋），室溫孵育 60 min，洗滌后，采用 Li-Cor Odyssey 紅外熒光成像系統(tǒng)進行曝光拍照；凝膠圖片及 2D SDS-PAGE/Western blot 圖片采用 Bio-Rad PDQuest 雙向電泳圖像分析軟件進行分析，軟件自動識別并統(tǒng)計圖譜上的斑點數(shù)目，計算不同 CHO HCPs 多克隆抗體識別 HCPs 的覆蓋率，選擇覆蓋率最高的多抗作為檢測抗體。

1.2.4 ELISA 方法的建立 以 1.2.3 項篩選得到的兔抗 CHOHCPs 多抗作為包被檢測抗體，以5 μg/ml 包被酶標板，1% BSA 封閉后，以 100 μl/孔加入 HCPs 標準品及待測樣品，室溫反應(yīng) 1.5 h；洗滌 3 次，100 μl/孔加入終濃度為 1.25 μg/ml 的生物素標記的兔抗 CHO HCPs 多抗，室溫反應(yīng)50 min；洗滌 3 次，100 μl/孔加入終濃度為 0.1 μg/ml 的 HRP 標記的鏈霉親和素，室溫反應(yīng) 0.5 h；洗滌 3 次，100 μl/孔加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色液，室溫下孵育 5 min；100 μl/孔加入終止液。酶標儀在 450 nm 處測定吸光度（A）；以不同濃度 HCPs 標準品為橫坐標，A值為縱坐標，采用四參數(shù)擬合方式繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算待測樣品中宿主細胞蛋白含量。

1.2.5 方法學驗證

1.2.5.1 線性與范圍 在用兔抗 CHOHCPs 多抗包被的酶標板中以 100 μl/孔，分別加入 0、3.33、10、30、90、270 和 810 ng/ml的 HCPs 標準品，按 1.2.4 項進行操作并繪制四參數(shù)標準曲線。

1.2.5.2 基質(zhì)干擾 取原液樣品，按 3:1 的比例加入 600 ng/ml HCPs 標準品；以相同比例在原液中加入 0 ng/ml HCPs 標準品的混合溶液作為空白對照，按照 1.2.4 項進行測定，扣除原液基質(zhì)的 HCPs，計算 HCPs 標準品的回收率；回收率若處于 80% ～ 120% 則表明原液基質(zhì)不干擾 HCPs 檢測；否則存在干擾，原液需進行適當稀釋后再進行檢測。

1.2.5.3 樣品稀釋線性 將原液樣品分別稀釋 1、2、4、8 倍后按照 1.2.4 項進行測定，計算4 個稀釋度的 HCPs 檢測結(jié)果；同時計算相鄰兩個稀釋度所測結(jié)果之間的百分比。

1.2.5.5 精密度 同一名分析人員對低、中、高（分別為25、150、600 ng/ml）濃度的 HCPs 標準品，在同一次試驗內(nèi)每個濃度重復測定 3 份，計算CV，即為試驗內(nèi)精密度；兩名分析人員分別對上述 3 個濃度的 HCPs 標準品進行測定，計算CV，即為不同人員試驗之間精密度。

1.2.5.6 準確性 將原液樣品分別與 60、300 和 600 ng/ml HCPs 標準品等體積混合，另設(shè)添加等體積 0 ng/ml HCPs 標準品的原液樣品混合液作為空白對照，重復檢測 3 次，測定混合樣品的 HCPs 含量，扣除空白后，計算 HCPs 標準品的回收率及CV。

1.2.6 工藝特異性和商業(yè)化通用 HCPs ELISA 方法橋接 采用 1.2.4 項建立的工藝特異性 HCPs ELISA 方法和商業(yè)化通用 HCPs ELISA 試劑盒同時對 5 批原液樣品進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 工藝特異性HCPs 的二維電泳表征

二維電泳銀染圖譜顯示，制備的工藝特異性 HCPs 中含有大量蛋白質(zhì)，等電點從 3 ～ 10，分子量從 10 ～ 180 kD 范圍內(nèi)均有分布；經(jīng)分析統(tǒng)計共識別出 863 個蛋白質(zhì)斑點（圖 1），表明制備的工藝特異性 HCPs 蛋白質(zhì)譜廣泛，可用作 HCPs 含量測定標準品。

圖 1 工藝特異性 HCPs 標準品的二維電泳銀染圖

Figure 1 2D SDS-PAGE of process-specific HCPs stained with silver

圖 2 HCPs 標準品的四參數(shù)擬合曲線

Figure 2 Fitting curve of HCPs standard with four parameter logistic model

2.2 HCPs 多抗識別HCPs 的覆蓋率

分析結(jié)果顯示，5 種編號分別為 C3、C6、C9、AB000103-A 和 AB000103-C 的兔抗 CHO HCPs 多抗識別工藝特異性 HCPs 的覆蓋率分別為 24%、59%、57%、32% 和 34%；編號為 3G-0016-AF 的山羊抗 CHO HCPs 多抗覆蓋率則為 28%；其中編號 C6 多抗的覆蓋率最高，接近 60%，故選擇該多抗作為檢測抗體。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性與范圍 HCPs 標準品在 3.33 ～810 ng/ml 范圍與450值的四參數(shù)曲線方程為 y =（0.11 – 7.2）/［1 +（/ 1427^0.991）］+ 7.2，2= 1，具有良好的曲線擬合，見圖 2。

2.3.2 基質(zhì)干擾 HCPs 標準品的理論值為150 ng/ml，實際測定值為 136 ng/ml，回收率 91%，表明原液樣品基質(zhì)對 HCPs 測定沒有干擾。

2.3.3 樣品稀釋線性 原液樣品稀釋 1、2、4、8 倍后測得的 HCPs 結(jié)果如表 1 所示。結(jié)果表明，樣品稀釋 1 ～ 8 倍時，相鄰兩個稀釋度所測結(jié)果之間的百分比在 80% ～ 120% 之間，原液樣品稀釋1 ～ 8 倍存在稀釋線性。

2.3.4 靈敏度 經(jīng)檢測與計算，方法的檢測限為 0.075 ng/ml。10 ng/ml、15 ng/ml 和 20 ng/ml 的 HCPs 標準品和原液樣品混合的加標回收率分別為 16.8%、67.3% 和 74.4%，CV分別為 2.6%、3.2% 和 2.3%，因此該方法的定量限為 20 ng/ml。

2.3.5 精密度 低、中、高三個濃度 HCPs 標準品的試驗內(nèi)CV 分別為 1.1%、9.2% 和 3.8%；試驗間 CV 分別為 5.0%、8.1% 和 3.9%；方法的精密度良好，見表 2。

2.3.6 準確性 低、中、高三個濃度 HCPs 標準品測得的回收率分別為 107%、107% 和 95%；CV 分別為18.4%、10.0% 和 9.4%，見表 3；方法的準確性良好。

表 1 原液稀釋線性

2.4 工藝特異性和商業(yè)化通用 HCPs ELISA 方法橋接

表 4 結(jié)果顯示，工藝特異性 HCPs ELISA 方法測定 5 批原液的 HCPs 殘留結(jié)果在 10 ～ 20 ppm范圍內(nèi)，顯著高于商業(yè)化通用 ELISA 檢測試劑盒測得的結(jié)果（0.8 ～ 1.6 ppm）。

3 討論

由于 HCPs 對重組生物制品的質(zhì)量、療效以及患者安全的潛在影響，同時 HCPs 的監(jiān)測是下游純化工藝開發(fā)的一個重要指標，因此重組生物治療產(chǎn)品中殘留 HCPs 的含量通常被認為是一個關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），一般需要納入生產(chǎn)過程控制及原液批放行檢測[1, 4]。重組生物制品終產(chǎn)品中 HCPs 應(yīng)控制在一個可接受的低水平，一般行業(yè)共識和監(jiān)管部門要求是不超過 100 ppm[1, 4]。HCPs 組成成分復雜和多樣且受到多個因素的影響，比如與宿主表達系統(tǒng)、目標蛋白的表達方式、細胞培養(yǎng)和下游純化工藝等因素有關(guān)[1, 3, 13]，這些都給 HCPs 的檢測和控制帶來重大挑戰(zhàn)。檢測 HCPs 的方法較多，但夾心 ELISA 法因獨特優(yōu)勢，仍然是目前 HCPs 檢測使用最廣泛的方法。大多數(shù)生物制藥公司在產(chǎn)品開發(fā)早期階段通常采用商業(yè)化通用HCPs ELISA 試劑盒對下游純化過程中間產(chǎn)物及原液中的 HCPs 進行檢測和控制，但商業(yè)化 ELISA 試劑盒使用的 HCPs 標準品往往與特定產(chǎn)品的 HCPs 種類存在較大差異，且商業(yè)化 ELISA 試劑盒使用的 HCPs 多抗可能未必適用于特定產(chǎn)品；因此，一般在產(chǎn)品開發(fā)的后期（如 III 期臨床或工藝驗證前）需要開發(fā)產(chǎn)品工藝特異性 ELISA 檢測方法[13]。目前部分已上市重組生物制品的研發(fā)單位通過開發(fā)產(chǎn)品工藝特異性 HCPs ELISA 檢測方法來解決商業(yè)化試劑盒的不足，但產(chǎn)品工藝特異性的檢測方法開發(fā)周期較長、成本高昂，且有研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品工藝特異性 HCPs ELISA 檢測方法也不能保證回收率優(yōu)于商業(yè)化 ELISA 試劑盒[3, 14]。有研究建議，在 HCPs 抗體覆蓋率達到一定水平時，通過開發(fā)產(chǎn)品工藝特異性標準品，建立產(chǎn)品特異性 ELISA 檢測法可能是一種較好的解決方案[3, 9]。無論采用產(chǎn)品工藝特異性 HCPs ELISA檢測方法還是商業(yè)化檢測試劑盒，都需預(yù)先對所使用的 HCPs 抗體識別 HCPs 的能力（覆蓋率）進行分析[11]。

表 2 精密度驗證

表 4 工藝特異性和商業(yè)化 ELISA 方法檢測原液中 HCPs 殘留的結(jié)果（ppm）

研究首先制備了上游工藝特異性 HCPs，經(jīng)二維電泳分析顯示 HCP 蛋白譜分布廣泛；而后采用 2D SDS-PAGE/Western blot 法對 6 種抗 CHO HCPs 多抗識別重組抗VEGF 單抗工藝特異性 HCPs 的覆蓋率進行檢測分析，篩選到覆蓋率達 59% 的 C6 多抗（經(jīng)重復分析覆蓋率為 69%）作為檢測抗體，建立了產(chǎn)品工藝特異性 HCPs 夾心 ELISA 檢測法。驗證結(jié)果顯示，該方法的 LOD 和 LOQ 分別為 0.075和 20 ng/ml；試驗內(nèi)、試驗間精密度及準確性均符合要求；方法的測定范圍為 20 ～ 810 ng/ml；原液基質(zhì)對測定沒有干擾。此外，由于重組抗 VEGF 單抗早期臨床開發(fā)階段采用的是商業(yè)化通用 ELISA 檢測試劑盒，因此采用本研究建立的工藝特異性 HCPs ELISA 檢測法與早期通用檢測方法進行了橋接對比研究，結(jié)果顯示工藝特異性檢測方法獲得的結(jié)果顯著高于通用檢測方法，這也與該通用檢測試劑盒所使用的 HCPs 多抗（編號 3G-0016-PA）覆蓋率低相印證。

本研究成功建立了重組抗 VEGF 單抗殘留 HCPs 的 ELISA 檢測方法，該方法具有良好的檢出率、靈敏度、準確性、精密度和線性，可用于該產(chǎn)品中 HCPs 殘留的檢測。本方法比從頭開發(fā)一個新的產(chǎn)品或工藝特異性 ELISA 檢測方法節(jié)省幾個月的時間，同時又可以提供比較高的抗體覆蓋率以滿足藥物監(jiān)管機構(gòu)的要求。此研究也為其他重組生物制品的殘留 HCPs 檢測方法的開發(fā)提供參考。

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Development and validation of a process-specific ELISA assay for detection of residual host cell proteins in recombinant anti-VEGF monoclonal antibody

DENG Chun-ping, MEI Xiong, WANG Xing, LIU Cui-hua

Bio-Thera Solutions, Ltd., Guangzhou 519085, China (DENG Chun-ping, MEI Xiong, LIU Cui-hua); ArrayBridge Inc., St. Louis, 63110, USA (WANG Xing)

To develop and validate an ELISA assay for testing residual CHO host cell proteins (HCPs) in recombinant anti-VEGF monoclonal antibody.The process-specific HCPs were prepared using mock-transfected null CHO cells and then characterized by 2D-SDS PAGE. The coverage of the process-specific HCPs population of recombinant anti-VEGF monoclonal antibody recognized by six anti-CHO HCPs polyclonal antibodies (C3, C6, C7, AB000103-A, AB000103-C, 3G-0016-AF) was evaluated by two-dimensional electrophoresis coupled with Western blot (2D SDS-PAGE/Western blot). The polyclonal antibody with the highest coverage was chosen as a testing antibody, based on which the process-specific ELISA for the measurement of residual HCPs in products was developed and validated with respect to the linearity, matrix interference, dilution linearity, sensitivity, precision and accuracy. In addition, a bridging comparison study was performed between the established process-specific ELISA and commercial generic detection method.The process-specific HCPs showed a broad spectrum of proteins. Rabbit anti-CHO HCPs polyclonal antibodies (C6) with coverage of 59% was screened as a testing antibody, and a sandwich ELISA was accordingly established. The ELISA method was not interfered by drug substance matrix; the curve of HCPs standard fit well in the range of 3.33 - 810 ng/ml; the drug substance showed a good dilution linearity in the range of 1 - 8. The limit of detection and quantitative of the method was 0.075 ng/ml and 20 ng/ml, respectively, both the CVs in intra- and inter-assays were less than 10%, while the recovery of HCPs standard at 30, 150 and 300 ng/ml was 107%, 107% and 95%, respectively. The results obtained by process-specific ELISA from drug substance were significantly higher than those obtained by commercial generic detection method.A process-specific ELISA method has been successfully established, which shows appropriate coverage, sensitivity, accuracy, precision and linearity, and is suitable for detection of the residual HCPs in recombinant anti-VEGF monoclonal antibody.

recombinant anti-VEGF monoclonal antibody; CHO cells; host cell proteins; ELISA

LIU Cui-hua, Email: chliu@bio-thera.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.06.004

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2013ZX09401001）；廣東省引進創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團隊資助項目（2013Y116）

劉翠華，Email：chliu@bio-thera.com

2021-04-12