何維，楊雨欣，李怡宏，李曉茜，李星星，侍媛媛，孫紅敏，王麗，解云英，洪斌

·論著·

微生物來(lái)源的PCSK9轉(zhuǎn)錄抑制劑的發(fā)現(xiàn)及活性研究

何維*，楊雨欣*，李怡宏，李曉茜，李星星，侍媛媛，孫紅敏，王麗，解云英，洪斌

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所衛(wèi)健委抗生素生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（何維、楊雨欣、李怡宏、李星星、侍媛媛、孫紅敏、王麗、洪斌），醫(yī)科院藥物合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（李怡宏、李曉茜、李星星、侍媛媛、孫紅敏、解云英、洪斌）

擬通過(guò)篩選尋找具有 PCSK9 表達(dá)抑制活性的菌株發(fā)酵液及其活性組分，通過(guò)對(duì)其活性進(jìn)行初步研究，以期獲得能夠用于治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的先導(dǎo)化合物或藥物候選物。利用前期工作構(gòu)建的 PCSK9 轉(zhuǎn)錄抑制劑高通量篩選模型對(duì)國(guó)家新藥（微生物）篩選中心發(fā)酵液樣品庫(kù)進(jìn)行篩選，對(duì)陽(yáng)性發(fā)酵液進(jìn)行分離提取以獲得具有 PCSK9 表達(dá)抑制活性的小分子化合物，利用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)化合物對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞攝取 LDL-C 情況的變化。獲得陽(yáng)性菌株 I03A-00300 及其活性組分殺粉蝶菌素 A1。殺粉蝶菌素 A1在低濃度時(shí)即可顯著抑制 HepG2 細(xì)胞中 PCSK9 的表達(dá)，進(jìn)而增加LDLR 的表達(dá)。還可以促進(jìn) LDLR 介導(dǎo)的肝細(xì)胞對(duì) LDL-C 的攝取功能增加約一倍。殺粉蝶菌素 A1 作為 PCSK9 抑制劑，在細(xì)胞水平證實(shí)可上調(diào) PCSK9 調(diào)控的下游基因 LDLR 的表達(dá)及其介導(dǎo)的 LDL 膽固醇的攝取作用，證明該化合物有望發(fā)展為新型抗動(dòng)脈粥樣硬化先導(dǎo)化合物。

動(dòng)脈粥樣硬化； PCSK9； 高通量篩選； 低密度脂蛋白膽固醇； 殺粉蝶菌素 A1

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是全世界人類健康的主要威脅之一，其中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾?。╝therosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素之一[1]。因此，降低 LDL-C 的水平對(duì)于治療心血管疾病具有重要意義。PCSK9 是 2003 年被發(fā)現(xiàn)并被證明為心血管疾病的第三個(gè)易感基因[2-3]，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟 LDLR 的降解來(lái)調(diào)控 LDL-C 的水平，抑制 PCSK9 可以有效地降低 LDL-C 的水平[4-5]。目前已成功上市的 PCSK9 抑制劑是兩種單克隆抗體，分別是 alirocumab（Praluent?）和 evolocumab（Repatha?），臨床數(shù)據(jù)表明這兩個(gè)單克隆抗體均可以有效地降低心血管疾病的發(fā)生率[6]。除此之外，Alnylam/The Medicines Company 研發(fā)的干擾肝臟中 PCSK9 合成的 siRNA 藥物 inclisiran（Leqvio?）于 2020 年 12 月在歐盟獲得批準(zhǔn)[7]。雖然 PCSK9 單克隆抗體或 siRNA 藥物具有良好的療效，但是也存在著價(jià)格昂貴、儲(chǔ)存運(yùn)輸不便、給藥方式限制等問(wèn)題。小分子藥物具有易合成、價(jià)格低、給藥方式便捷等優(yōu)勢(shì)，因此尋找 PCSK9 小分子抑制劑成為研究熱點(diǎn)。

微生物是天然產(chǎn)物的重要來(lái)源。在這些天然產(chǎn)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多具有藥物活性的小分子化合物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自從 1928 年青霉素發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們已經(jīng)鑒定出了超過(guò) 2.3 萬(wàn)個(gè)微生物來(lái)源的天然產(chǎn)物，其中大部分是由細(xì)菌特別是放線菌產(chǎn)生的[8]。同樣，治療心血管疾病的他汀類藥物也是發(fā)現(xiàn)于真菌[9]。近年來(lái)很多國(guó)家和研究機(jī)構(gòu)開(kāi)始建立微生物粗提品庫(kù)，并利用新型篩選模型對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模篩選，以期發(fā)現(xiàn)具有新活性、新結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物。與化合物庫(kù)及其他篩選文庫(kù)相比，微生物粗提品庫(kù)的生產(chǎn)成本較低，并且富含多種天然產(chǎn)物，為新結(jié)構(gòu)、新活性天然產(chǎn)物藥物的發(fā)現(xiàn)提供了更大的可能性。本研究所國(guó)家新藥（微生物）篩選發(fā)酵液粗提品庫(kù)，目前已擁有 76 000 個(gè)菌株的發(fā)酵液粗提品樣品，且樣品來(lái)源廣泛，為大規(guī)模篩選提供了保障。

本研究利用本課題組前期成功構(gòu)建的 PCSK9 轉(zhuǎn)錄抑制劑的高通量篩選模型對(duì)本所國(guó)家新藥（微生物）篩選中心發(fā)酵液粗提品庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，以期獲得可以抑制 PCSK9 表達(dá)的發(fā)酵液樣品，對(duì)相應(yīng)菌株進(jìn)行重新發(fā)酵及活性確證后找到活性較好且可穩(wěn)定培養(yǎng)與發(fā)酵的陽(yáng)性菌株，對(duì)其發(fā)酵液以活性為導(dǎo)向，進(jìn)行一系列的分離提取、結(jié)構(gòu)鑒定，最終找到具有 PCSK9 表達(dá)抑制活性的小分子化合物殺粉蝶菌素 A1，其在細(xì)胞水平顯著影響 PCSK9 基因的表達(dá)及其介導(dǎo)的功能，有望發(fā)展為治療抗動(dòng)脈粥樣硬化的先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 重組報(bào)告基因質(zhì)粒 pGL4-PCSK9-D1/D2/D3/D4/D5/D6/D7 及人肝癌細(xì)胞 HepG2、pGL4-PCSK9-P HepG2 細(xì)胞株均為本室保存[10]；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25% 胰酶均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；MTT 溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；螢火蟲(chóng)熒光素酶試劑盒購(gòu)自美國(guó) Promega 公司；10 × 蛋白電泳轉(zhuǎn)移緩沖液、10 × 封閉-洗滌緩沖液（TBST）購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型 HRP 底物（ECL 發(fā)光液）購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司；人血漿低密度脂蛋白（DiI-LDL）DiI-labeled 購(gòu)自 ADI Alpha Diagnostic International 公司。

1.1.2 儀器 EPS 301 電泳儀為美國(guó) Amersham Biosciences 公司產(chǎn)品；Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó) Bio-Rad 公司產(chǎn)品；VICTOR X5 多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀為美國(guó) PerkinElmer 公司產(chǎn)品；HERAcell 150 CO2培養(yǎng)箱為美國(guó) Thermo Scientific 公司產(chǎn)品；CKX41 倒置顯微鏡為日本 Olympus 公司產(chǎn)品；NovoCyte 流式細(xì)胞儀為美國(guó) ACEA Biosciences 公司產(chǎn)品；LC-20AD 高效液相色譜儀為日本 Shimadzu 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液樣品的篩選 將國(guó)家新藥（微生物）篩選中心發(fā)酵液樣品用 100% DMSO 稀釋 5 倍作為待篩樣品。篩選使用 96 孔板，PCSK9 表達(dá)抑制劑篩選模型細(xì)胞（pGL4-PCSK9-P HepG2 細(xì)胞）密度為 6 × 106個(gè)/ml，每孔 100 μl 鋪板，培養(yǎng) 24 h 后替換為無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔 200 μl，每孔加入待測(cè)樣品 1 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后進(jìn)行細(xì)胞熒光素酶活性檢測(cè)。

1.2.2 化合物分離純化和鑒定 將菌株 I03A-00300 的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基 ISP2（酵母浸粉 0.4%，麥芽浸粉 1%，葡萄糖 0.4%，瓊脂 1.5%，去離子水 1000 ml）中得種子培養(yǎng)物，以 5% ～ 10% 接種量轉(zhuǎn)接于 A1 發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖 0.5%，麥芽膏 1%，棉籽餅粉 1%，可溶性淀粉 2%，酵母膏 0.5%，K2HPO40.05%，CaCO30.3%，NaCl 0.1%，自來(lái)水 1000 ml）28 ℃、220 r/min，培養(yǎng) 5 d，獲得菌株發(fā)酵液樣品。將發(fā)酵液離心后得到上清液和菌絲體部分，上清液上大孔樹(shù)脂柱，依次用去離子水、30% 丙酮、100% 丙酮洗脫得 P1 組分；菌體部分使用丙酮萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，粗品復(fù)溶于 90% 甲醇水溶液中，用石油醚進(jìn)行萃取，保留石油醚部分，真空濃縮后得菌絲體提取物 P2。合并 P1 和 P2 部分，復(fù)溶于 80% 甲醇水溶液中，采用半制備 HPLC 純化各組分，按峰收集制備，真空濃縮干燥得不同組分后溶于氘代 DMSO 制成為待檢測(cè)樣品。經(jīng)高分辨質(zhì)譜（HRESI-MS）及核磁共振（NMR）分析，確證化合物結(jié)構(gòu)。

1.2.3 化合物毒性實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG2 細(xì)胞，經(jīng)漂洗、消化吹打成單細(xì)胞懸液后按照 5 × 105個(gè)/ml 密度接種 96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后加入無(wú)血清 MEM 培養(yǎng)基倍比稀釋后的待測(cè)樣品，并設(shè)置空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；每孔加入 10 μl 的 0.5% MTT 溶液，MTT 的終濃度為 0.5 mg/ml，繼續(xù)孵育 4 h，PBS 漂洗后每孔加入 100 μl 的 DMSO，確定結(jié)晶物都已溶解后，在570 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（加藥組光吸收值/對(duì)照組光吸收值）× 100%。

1.2.4 蛋白免疫印跡 將 HepG2 細(xì)胞接種于12 孔板中培養(yǎng) 24 h，加入含待測(cè)化合物的無(wú)血清 MEM 培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；用 RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，裂解后的蛋白樣品用 10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離電泳（PAGE），然后電印跡在 0.45 μm PVDF 膜上，PVDF 膜與抗 PCSK9、LDLR 或 GAPDH 的一抗 4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 沖洗后，與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）結(jié)合的二抗在室溫下孵育 1 h，加入 HRP 底物發(fā)光液 ECL 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù) 將 HepG2 細(xì)胞以 8 ×105個(gè)/ml 的密度接種于 12 孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜；移除舊培養(yǎng)基，加入含待測(cè)化合物的無(wú)血清 MEM 培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的 2 μg/ml DiI-LDL，避光孵育 4 h，移去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的 PBS 漂洗后，加入胰酶消化并加入含血清的培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，1000 r/min 離心 3 min，用 PBS 重懸細(xì)胞并經(jīng) 300 目網(wǎng)篩過(guò)濾，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞按 3 × 104個(gè)/孔接種于 96 孔板中，放入培養(yǎng)箱中。過(guò)夜后按照每孔 100 ng 質(zhì)粒加入 5 μl opti-MEM 培養(yǎng)基及 0.2 μl 的 P3000 試劑中，同時(shí)用 5 μl opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋 0.3 μl 轉(zhuǎn)染試劑 lipo 3000，然后將兩種混合液混勻后室溫孵育 10 ～ 15 min。吸除板中的舊培養(yǎng)基，每孔加入 100 μl 轉(zhuǎn)染混合溶液。孵育 6 h 后，加入不同濃度的殺粉蝶菌素 A1 后放入培養(yǎng)箱中，24 h 后測(cè)定熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PCSK9 基因表達(dá)抑制劑殺粉蝶菌素 A1 的發(fā)現(xiàn)及初步評(píng)價(jià)

本工作對(duì)國(guó)家新藥（微生物）篩選中心發(fā)酵液粗提品庫(kù)共計(jì) 12 560 樣次的發(fā)酵液粗提品進(jìn)行初步篩選，使用螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)，以抑制率 > 50% 設(shè)置為初篩陽(yáng)性。篩選結(jié)果如圖 1A 所示，初篩共獲得 350 個(gè)陽(yáng)性發(fā)酵液樣品，陽(yáng)性率為 2.8%，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性發(fā)酵液進(jìn)行重新檢測(cè)、稀釋、相應(yīng)菌株重新發(fā)酵再檢測(cè)后，最終獲得 6 株活性較好且可以重復(fù)的陽(yáng)性菌株。我們對(duì)其中活性最好的 I03A-00300 在 PCSK9 表達(dá)抑制劑篩選模型上進(jìn)行了進(jìn)一步量效分析，結(jié)果如圖 1B 所示，其發(fā)酵液可顯著下調(diào) PCSK9 的表達(dá)活性。以 PCSK9 基因表達(dá)抑制活性為導(dǎo)向，對(duì)菌株 I03A-00300 進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵與分離提取及結(jié)構(gòu)鑒定，最終確定活性菌株 I03A-00300 的發(fā)酵液中具有 PCSK9 表達(dá)抑制活性的小分子化合物殺粉蝶菌素 A1（圖 1C）。

Figure 1 Discovery of strains with PCSK9 inhibitory activity and the isolation, extraction and identification of active components [A: Screening results of crude extracts from fermentation broth by PCSK9 transcriptional inhibitor screening assay; B: The dose-effect of positive fermentation broth I03A-00300 on the PCSK9 transcriptional inhibitor screening assay; C: HPLC chromatogram of fermentation broth I03A-00300 and effects of each component on the protein levels of PCSK9 and LDLR in HepG2 cells (F4 was confirmed to be piericidin A1 by structural identification) ]

對(duì)活性組分殺粉蝶菌素 A1 的量效關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)，將殺粉蝶菌素 A1 以 10 倍比梯度稀釋后作用于 PCSK9 表達(dá)抑制劑篩選模型上，熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，殺粉蝶菌素 A1 可劑量依賴地抑制 PCSK9 轉(zhuǎn)錄活性，量效關(guān)系曲線如圖 2A 所示，經(jīng)計(jì)算其 IC50為 2.98 nmol/L。為檢測(cè)化合物的細(xì)胞毒性，利用 MTT 法檢測(cè)殺粉蝶菌素 A1 在不同濃度下對(duì) HepG2 細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，在濃度 0 ～ 40 μg/ml（0 ～ 100 μmol/L）之間時(shí)，細(xì)胞存活率均為對(duì)照組的 90% 以上，即對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)存活幾乎沒(méi)有影響（圖2B）。

2.2 化合物殺粉蝶菌素 A1 對(duì) HepG2 細(xì)胞中 PCSK9 及 LDLR 蛋白水平的影響

利用 PCSK9 轉(zhuǎn)錄抑制劑高通量篩選模型獲得的微生物來(lái)源的活性化合物殺粉蝶菌素 A1，前期結(jié)果表明可劑量依賴性地抑制 PCSK9 啟動(dòng)子活性，因此為了進(jìn)一步驗(yàn)證其是否影響 PCSK9 基因的表達(dá)，我們檢測(cè)了 HepG2 細(xì)胞中 PCSK9 的蛋白的表達(dá)水平。首先將不同濃度的殺粉蝶菌素 A1 與 HepG2 細(xì)胞共同孵育 24 h，隨后提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行 Western blot 實(shí)驗(yàn)分析。結(jié)果顯示，殺粉蝶菌素 A1 可以顯著抑制 HepG2 細(xì)胞中 PCSK9 蛋白表達(dá)（圖 3A）。

PCSK9 可以與肝細(xì)胞表面的 LDLR 中表皮生長(zhǎng)因子 A（EGF-A）樣結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合并形成 PCSK9/LDLR 復(fù)合物，介導(dǎo)其進(jìn)入溶酶體降解，導(dǎo)致細(xì)胞表面的 LDLR 減少，進(jìn)而減少 LDL-C 的攝取[4]。因此我們進(jìn)而檢測(cè)了殺粉蝶菌素 A1 對(duì) HepG2 細(xì)胞中 LDLR 蛋白水平的影響。結(jié)果顯示，殺粉蝶菌素 A1 可以顯著上調(diào) LDLR 蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴性（圖 3B）。

2.3 化合物殺粉蝶菌素 A1 對(duì) HepG2 細(xì)胞攝取 LDL-C 的影響

LDL-C 是一種運(yùn)載膽固醇進(jìn)入外周組織細(xì)胞的脂蛋白顆粒，當(dāng) LDL-C 過(guò)量時(shí)，它攜帶的膽固醇便積存在動(dòng)脈壁上，促使動(dòng)脈粥樣硬化的產(chǎn)生和發(fā)展。LDLR 可以與 LDL-C結(jié)合，介導(dǎo) LDL 被細(xì)胞內(nèi)吞，循環(huán)中 70% 的 LDL 在肝臟被攝取并代謝掉。

DiI 全稱為1,1'-雙十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽，是最常用的細(xì)胞膜熒光探針之一，進(jìn)入細(xì)胞膜后可以側(cè)向擴(kuò)散逐漸使整個(gè)細(xì)胞膜被染色，當(dāng)與細(xì)胞膜結(jié)合后其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，被激發(fā)后可以發(fā)出橙紅色的熒光。熒光標(biāo)記的人源低密度脂蛋白（human DiI-LDL）是標(biāo)記熒光探針 DiI 的 LDL，可用來(lái)評(píng)估細(xì)胞 LDLR 攝取LDL-C 的能力。因此我們利用 DiI-LDL 檢測(cè)殺粉蝶菌素 A1對(duì)HepG2 細(xì)胞攝取 LDL-C 的影響，驗(yàn)證其對(duì) LDLR 介導(dǎo)的肝細(xì)胞攝取 LDL-C 功能的影響。將不同濃度的殺粉蝶菌素 A1 作用 HepG2 細(xì)胞 24 h 后，加入 DiI-LDL 孵育 4 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)攝取情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度的殺粉蝶菌素 A1 可以不同程度地增加 HepG2 細(xì)胞攝取 LDL 的能力，當(dāng)殺粉蝶菌素 A1 作用濃度為 1 μmol/L時(shí)，肝細(xì)胞 HepG2 對(duì) DiI-LDL 攝取能力為對(duì)照的 2.1 倍（圖 4）。

圖 2 化合物殺粉蝶菌素 A1 的初步活性驗(yàn)證（A：在 PCSK9 表達(dá)抑制劑篩選模型上的量效關(guān)系曲線；B：在 HepG2 細(xì)胞上的細(xì)胞毒性檢測(cè)）

Figure 2 Preliminary evaluation of piericidin A1 (A: The dose-effective curve of piericidin A1 on the PCSK9 transcriptional inhibitor screening assay; B: Effects of piericidin A1 on cell proliferation and cytotoxicity)

圖 3 化合物殺粉蝶菌素 A1 對(duì) HepG2 細(xì)胞 PCSK9（A）及 LDLR（B）蛋白水平的影響

Figure 3 Effects of piericidin A1 on PCSK9 (A) and LDLR (B) protein levels in HepG2 cells

圖 4 化合物殺粉蝶菌素A1 對(duì)HepG2 細(xì)胞攝取DiI-LDL 的影響

Figure 4 Effects of the piericidin A1 on DiI-LDL uptake in HepG2 cells

2.4 殺粉蝶菌素 A1通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子 HNF1α 和 HINFP 調(diào)節(jié) PCSK9 的表達(dá)

為了研究殺粉蝶菌素 A1 介導(dǎo) PCSK9 轉(zhuǎn)錄抑制的機(jī)制，我們采用前期構(gòu)建的含有人 PCSK9 基因不同缺失啟動(dòng)子區(qū)（D1 ～ D7，圖 5A）的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞，進(jìn)而加入殺粉蝶菌素 A1 共孵育后檢測(cè)熒光素酶活性，以分析其對(duì)不同區(qū)段 PCSK9 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示，D1 ～ D5 的熒光素酶活性在殺粉蝶菌素 A1 作用后顯著降低，在缺失–392 ～–351 bp 之間的序列后，該抑制作用被抵消，說(shuō)明該段區(qū)域均對(duì)殺粉蝶菌素 A1 介導(dǎo)的 PCSK9 轉(zhuǎn)錄抑制活性發(fā)揮了重要調(diào)控作用（D5 vs. D6，圖 5B）。而以該段序列為結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子主要包括 HNF1α、HINFP。綜上結(jié)果表明殺粉蝶菌素 A1可能通過(guò)作用于HNF1α、HINFP 等轉(zhuǎn)錄因子，從而介導(dǎo)了 PCSK9 的表達(dá)下調(diào)以及隨后 LDLR 表達(dá)的上調(diào)、肝細(xì)胞對(duì) LDL-C 攝取的增加。

3 討論

由于 PCSK9 蛋白表面沒(méi)有天然的結(jié)合口袋，PCSK9 和 LDLR 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（EGFA 結(jié)構(gòu)域）均由平坦、無(wú)特征的表面組成，在大的表面積上表現(xiàn)出疏水相互作用，小分子很難與其結(jié)合[11]，因此開(kāi)發(fā)抑制 PCSK9 與 LDLR 相互作用的小分子藥物非常困難[12]。近年來(lái)，有更多的研究轉(zhuǎn)向 PCSK9基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)途徑的小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)上。一些天然產(chǎn)物，如小檗堿（berberine，BBR）[13]、丹參酮 IIA[14]等已被發(fā)現(xiàn)可降低 PCSK9 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，但由于它們廣泛的調(diào)節(jié)作用，尚未開(kāi)發(fā)為 PCSK9 抑制劑。Pfizer 公司通過(guò)高通量篩選找到了 R-IMPP，其可以靶向人 80S 核糖體，進(jìn)而抑制 PCSK9 蛋白合成[15]，但由于它的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不盡人意，已停止開(kāi)發(fā)。除此之外，近年有研究通過(guò)尋找對(duì) PCSK9 有高度親和力的小分子，制備與其配合使用的異雙功能分子，作為 PCSK9 的高親和力配體，與多種泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）募集元件連接，從而促進(jìn) PCSK9 的降解[16]。本工作利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的 PCSK9 轉(zhuǎn)錄抑制劑篩選細(xì)胞模型，以期篩選到作用于 PCSK9 轉(zhuǎn)錄水平的小分子抑制劑。

圖 5 殺粉蝶菌素A1 可能通過(guò)HNF1α 和HINFP 下調(diào) PCSK9的轉(zhuǎn)錄活性（A：含有全長(zhǎng)或不同缺失的人 PCSK9 啟動(dòng)子重組熒光素酶報(bào)告基因的構(gòu)建示意圖，ATG 起始密碼子前的核苷酸指定為 +1，-1 是 PCSK9 啟動(dòng)子插入片段的3' 末端；B：殺粉蝶菌素A1 對(duì)轉(zhuǎn)染含有不同區(qū)段缺失啟動(dòng)子 D1 ～ D7 的 PCSK9 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 HepG2 細(xì)胞熒光素酶活性的影響；與溶劑對(duì)照相比，*P < 0.05，與 D5 相比#P < 0.05，n = 3）

Figure 5 Piericidin A1 may downregulates PCSK9 transcriptional expression through HNF1α and HINFP (A: The schematic diagram of the recombinant luciferase reporter constructs containing full-length or different truncated human PCSK9 promoter region. Position +1 was designated as the nucleotide preceding the ATG start codon. Position -1 was the 3' end of PCSK9 promoter inserts; B: Effects of piericidin A1 on the luciferase activity of D1-D7 in HepG2 cells.*< 0.05 vs. vehicle in the corresponding group,#< 0.05 vs. D5, n = 3)

目前使用較廣泛的高通量篩選形式主要建立在分子水平或細(xì)胞水平的篩選模型，以微孔板形式為載體對(duì)樣品庫(kù)進(jìn)行高效篩選。本工作中采用的 PCSK9 表達(dá)抑制劑篩選模型是以細(xì)胞為載體，在 96 孔板上對(duì)微生物發(fā)酵液粗提品庫(kù)進(jìn)行高通量篩選。相較基于分子水平的篩選，細(xì)胞水平的篩選更接近體內(nèi)的生理生化過(guò)程，獲得的陽(yáng)性樣品活性更準(zhǔn)確真實(shí)，且便于后續(xù)對(duì)樣品的生物活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

殺粉蝶菌素 A 是 1963 年被 Takahashi 及其同事首次從土壤來(lái)源鏈霉菌 Streptomyces mobaraensis 中分離得到的具有殺蟲(chóng)活性的新化合物[17]。其整體結(jié)構(gòu)類似輔酶 Q，可作為輔酶 Q 拮抗劑，是線粒體傳遞鏈中特異和強(qiáng)效的 NADH-泛醌氧化還原酶（complex I）抑制劑[18]。除了最初發(fā)現(xiàn)的殺蟲(chóng)活性，研究還發(fā)現(xiàn)殺粉蝶菌素 A1 具有抗菌活性及抗腫瘤活性[19-22]，而殺粉蝶菌素 A1 在膽固醇代謝中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本工作利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的 PCSK9 轉(zhuǎn)錄抑制劑篩選模型對(duì)發(fā)酵液粗提品庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得了具有 PCSK9 表達(dá)抑制活性的陽(yáng)性發(fā)酵液樣品及其活性組分殺粉蝶菌素 A1；經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)粉蝶菌素 A1 在納摩爾濃度時(shí)即可顯著抑制 HepG2 細(xì)胞中 PCSK9 的表達(dá)，增加 LDLR 的表達(dá)，還可以促進(jìn) LDLR 介導(dǎo)的肝細(xì)胞對(duì) LDL-C 的攝取功能；初步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)該化合物可能通過(guò)作用于 HNF1α、HINFP 等轉(zhuǎn)錄因子從而調(diào)控 PCSK9 轉(zhuǎn)錄活性。綜上結(jié)果證明粉蝶菌素 A1 有望發(fā)展為新型抗動(dòng)脈粥樣硬化先導(dǎo)化合物。

[1] Bulbulia R, Armitage J. LDL cholesterol targets-how low to go? Curr Opin Lipidol, 2012, 23(4):265-270.

[2] Seidah NG, Benjannet S, Wickham L, et al. The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC-1): Liver regeneration and neuronal differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(3):928-933.

[3] Timms KM, Wagner S, Samuels ME, et al. A mutation in PCSK9 causing autosomal-dominant hypercholesterolemia in a Utah pedigree. Human Genetics, 2004, 114(4):349-353.

[4] Zhang DW, Lagace TA, Garuti R, et al. Binding of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 to epidermal growth factor-like repeat A of low density lipoprotein receptor decreases receptor recycling and increases degradation. J Biol Chem, 2007, 282(25): 18602-18612.

[5] Benjannet S, Rhainds D, Essalmani R, et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: Zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. J Biol Chem, 2004, 279(47):48865-48875.

[6] Mullard A. Nine paths to PCSK9 inhibition. Nat Rev Drug Discov, 2017, 16(5):299-301.

[7] Lamb YN. Inclisiran: first approval. Drugs, 2021, 81(3):389-395.

[8] Bérdy J. Thoughts and facts about antibiotics: Where we are now and where we are heading. J Antibiot (Tokyo), 2012, 65(8):385-395.

[9] Endo A, Kuroda M, Tanzawa K. Competitive inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase by ML-236A and ML-236B fungal metabolites, having hypocholesterolemic activity. 1976. Atheroscler Suppl, 2004, 5(3):39-42.

[10] Wang X, Chen X, Zhang X, et al. A small-molecule inhibitor of PCSK9 transcription ameliorates atherosclerosis through the modulation of FoxO1/3 and HNF1α. EBioMedicine, 2020, 52:102650.

[11] Lo Surdo P, Bottomley MJ, Calzetta A, et al. Mechanistic implications for LDL receptor degradation from the PCSK9/LDLR structure at neutral pH. EMBO Rep, 2011, 12(12):1300-1305.

[12] Pettersen D, Fjellstr?m O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorg Med Chem Lett, 2018, 28(7): 1155-1160.

[13] Cameron J, Ranheim T, Kulseth MA, et al. Berberine decreases PCSK9 expression in HepG2 cells. Atherosclerosis, 2008, 201(2):266-273.

[14] Chen HC, Chen PY, Wu MJ, et al. Tanshinone IIA modulates low density lipoprotein uptake via down-regulation of PCSK9 gene expression in HepG2 cells. PLoS One, 2016, 11(9):e0162414.

[15] Petersen DN, Hawkins J, Ruangsiriluk W, et al. A Small-molecule anti-secretagogue of PCSK9 targets the 80S ribosome to inhibit PCSK9 protein translation. Cell Chem Biol, 2016, 23(11):1362-1371.

[16] Petrilli WL, Adam GC, Erdmann RS, et al. From screening to targeted degradation: strategies for the discovery and optimization of small molecule ligands for PCSK9. Cell Chem Biol, 2020, 27(1):32-40, e3.

[17] Tamura S, Takahashi N, Miyamoto S, et al. Isolation and physiological activities of piericidin a, A natural insecticide produced by streptomyces. Agric Biol Chem, 1963, 27(8):576-582.

[18] Hall C, Wu M, Crane FL, et al. Piericidin A: a new inhibitor of mitochondrial electron transport. Biochem Biophys Res Commun, 1966, 25(4):373-377.

[19] Muhayimana S, Zhang X, Xu J, et al. Cytotoxic selectivity and apoptosis induction of piericidin A contributes potentially to its insecticidal effect against Mythimna separata (Lepidoptera: Noctuidae) larvae. Pestic Biochem Physiol, 2019, 157:19-25.

[20] Morgan JM, Duncan MC, Johnson KS, et al. Piericidin A1 blocks yersinia ysc type III secretion system needle assembly. mSphere, 2017, 2(1):e00030-17.

[21] Zhou X, Liang Z, Li K, et al. Exploring the natural piericidins as anti-renal cell carcinoma agents targeting peroxiredoxin 1. J Med Chem, 2019, 62(15):7058-7069.

[22] Zhou X, Fenical W. The unique chemistry and biology of the piericidins. J Antibiot (Tokyo), 2016, 69(8):582-593.

Discovery and activity of transcriptional inhibitors of PCSK9 derived from microorganism

HE Wei, YANG Yu-xin, LI Yi-hong, LI Xiao-qian, LI Xing-xing, SHI Yuan-yuan, SUN Hong-min, WANG Li, XIE Yun-ying,HONG Bin

NHC Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics (HE Wei, YANG Yu-xin, LI Yi-hong, LI Xing-xing, SHI Yuan-yuan, SUN Hong-min, WANG Li, HONG Bin), CAMS Key Laboratory of Synthetic Biology for Drug Innovation (LI Yi-hong, LI Xiao-qian, LI Xing-xing, SHI Yuan-yuan, SUN Hong-min, XIE Yun-ying, HONG Bin), Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

We aimed to obtain active fermentation broth of strains and its active components targeting PCSK9 transcriptional activity through screening. The active compounds are potential to be developed to leading compounds or drug candidates that can be used for the treatment or prevention of atherosclerosis.The constructed high-throughput drug screening assay targeting PCSK9 transcriptional expression was applied to screen fermentation broth samples from the national new drug (microorganism) screening laboratory. The positive fermentation broth was isolated and extracted to obtain small molecular compounds with PCSK9 transcriptional inhibitory activity. Western blot was used to detect the effects of the active compounds on PCSK9 and LDLR expression, and flow cytometry was used to evaluate the changes on LDL-C uptake by HepG2 cells.The positive strain I03A-00300 and its active component, piericidin A1 were obtained. Piericidin A1 significantly inhibited the expression of PCSK9, followed by increased LDLR protein level and enhanced LDLR-mediated uptake of LDL-C in HepG2 cells at a relatively lower concentration.As PCSK9 inhibitor, piericidin A1 up-regulates the expression of downstream gene LDLR and LDLR-mediated LDL cholesterol uptake by targeting PCSK9 transcription at the cellular level. This proves that piericidin A1 is expected to be developed as a new lead compound for anti-atherosclerosis.

atherosclerosis; PCSK9; high-throughput screening; LDL-C; piericidin A1

WANG Li, Email: wangli_imb@163.com; HONG Bin, Email: binhong69@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.06.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81473214）

王麗，Email：wangli_imb@163.com；洪斌，Email：binhong69@hotmail.com

2021-04-15

*同為第一作者