張勇 夏悅明 賴曉蘭 閔松林 雷文俤

(寧德市醫(yī)院 1.普外二科；2.血液科；3.急診科，福建 寧德 352100)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是世界上第三大常見(jiàn)的胃腸道癌癥類型，其發(fā)病率和死亡率均較高。近年來(lái)，每年約有180萬(wàn)新病例被診斷為CRC，占所有癌癥發(fā)病率的約10%，且每年有80萬(wàn)的病例死于CRC[1-2]。各種環(huán)境因素和不良生活方式均會(huì)導(dǎo)致CRC的發(fā)生，例如吸煙、酒精攝入等。傳統(tǒng)上CRC的療法包括腹腔鏡切除手術(shù)、放療和化療，但治療后仍然會(huì)出現(xiàn)副作用，甚至癌癥復(fù)發(fā)，因此迫切需要探究CRC新的治療策略。結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞(colorectal cancer stem cells，CRC-CSCs)與其他腫瘤干細(xì)胞一樣，具有自我更新和無(wú)限增殖的能力，可介導(dǎo)CRC腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。目前研究表明，CRC治療后復(fù)發(fā)的主要原因可能是CRC-CSCs無(wú)法根除[3]，因此，靶向抑制CRC-CSCs的惡性生物學(xué)行為可能是CRC治療的重要策略?；罨D(zhuǎn)錄因子3(Activating transcription factor 3, ATF3)是具有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于ATF/CREB家族的成員，可在多種條件下調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[4]。研究表明，ATF3在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥大以及多種癌癥發(fā)病機(jī)制中均發(fā)揮重要作用，且已發(fā)現(xiàn)ATF3與CRC惡性演進(jìn)相關(guān)[5-7]。因此，本研究以分選CD133+表達(dá)的CRC-CSCs為對(duì)象，探究靶向敲減ATF3對(duì)CRC-CSCs自我更新、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116購(gòu)自中國(guó)上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫(kù)，胰蛋白酶、胎牛血清、牛血清白蛋白、雙抗、McCoy’s 5a培養(yǎng)基以及DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，TRIzol試劑、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，CCK-8試劑盒和ELISA試劑盒購(gòu)自凱基生物公司，免疫熒光染色試劑盒購(gòu)自博士德生物公司，結(jié)晶紫染液、BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自碧云天公司，抗體CD133、E-cadherin、Vimentin、Fas、FasL購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔購(gòu)自昊鑫生物公司，sh-ATF3慢病毒載體由上海生工生物公司設(shè)計(jì)構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 HCT116細(xì)胞的培養(yǎng) 取HCT116細(xì)胞復(fù)蘇，添加含10%胎牛血清與1%雙抗(青霉素與鏈霉素)的McCoy’s 5a培養(yǎng)基，置于37℃、CO2恒溫孵育箱進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，采用胰蛋白酶進(jìn)行消化，并以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)分選CRC-CSCs細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，加入含20%胎牛血清與 0.4%牛血清白蛋白的PBS封閉液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，置于4℃下作用 2 h，離心收集細(xì)胞，加入50 μL封閉液重懸細(xì)胞，然后分別加入5 μL CD133-PE，在4℃下避光孵育30 min，離心收集細(xì)胞，再使用1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，加入磁珠4℃下避光孵育15 min，采用終濃度為2 μg/mL的嘌呤霉素室溫處理10 min 以去除空白死細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，通過(guò)流式細(xì)胞儀分選獲得CD133+表達(dá)的CRC-CSCs細(xì)胞。在分選獲得的CRC-CSCs細(xì)胞中加入含5 mg/mL胰島素、0.4% BSA、2% B27、10 ng/mL FGF、10 ng/mL EGF 的無(wú)血清DMEM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染CRC-CSCs細(xì)胞 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CRC-CSCs細(xì)胞，置于37℃、CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)消化，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/mL，取100 μL接種于24孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)設(shè)置分組包括對(duì)照組、sh-NC組、sh-ATF3組，其中sh-ATF3組轉(zhuǎn)染sh-ATF3慢病毒載體，sh-NC組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照慢病毒載體，對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)。以感染復(fù)數(shù)為20的比例加入慢病毒，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)12 h，收集兩組細(xì)胞，培養(yǎng)于新鮮DMEM/F12培養(yǎng)液中，采用0.5 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行篩選，每隔1天換液1次，持續(xù)2周。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)敲減效率 收集轉(zhuǎn)染后的3組CRC-CSCs細(xì)胞，加入TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的總RNA純度與濃度。根據(jù)PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平，步驟按照SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行，以β-actin作為內(nèi)參基因。擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min，循環(huán)1次；95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s，此步驟一共循環(huán)42次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)基因引物，具體序列如下：ATF3上游引物5′-GACAAGGGAGACCTGGAGAA-3′，下游引物5′-GAGAAGGACAAGAAAGCCACA-3′；β-actin上游引物5′-ATGGTGGGAATGGGTCAGA AG-3′，下游引物5′-TCTCCATGTCGTCCCAGTTG。

1.2.5 CCK-8檢測(cè)CRC-CSCs細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染后的3組CRC-CSCs細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/mL，取100 μL接種于96孔板中，置于37℃、CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔加入10 μL 的CCK-8試劑液，繼續(xù)置于恒溫孵育箱中孵育1 h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度(A)值。

1.2.6 CRC-CSCs細(xì)胞成球能力檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染后的3組CRC-CSCs細(xì)胞，進(jìn)行消化、離心，加入含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基并吹打分散為單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞濃度以1×103個(gè)/孔的密度接種在96孔板，放置于37℃、CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)，1周后于倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)每視野下形成的細(xì)胞球，以>50 μm作為一個(gè)細(xì)胞球。

1.2.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRC-CSCs細(xì)胞克隆形成能力 收集轉(zhuǎn)染后的3組CRC-CSCs細(xì)胞，離心并吹打分散為單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×103個(gè)接種到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，接種時(shí)輕晃培養(yǎng)皿使細(xì)胞分散均勻，置于37℃、CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)，14 d后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞集落，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定菌落，0.5%結(jié)晶紫染液染色15 min，流水沖洗干凈，干燥后置于光鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)目，將≥50個(gè)細(xì)胞聚集作為1個(gè)細(xì)胞菌落。

1.2.8 免疫熒光染色檢測(cè)E-cadherin、Vimentin表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的3組CRC-CSCs細(xì)胞，PBS洗滌后，加入 4%多聚甲醛室溫固定10 min，自來(lái)水沖洗干凈，滴加 0.5% TritonX-100 透膜處理15 min，加入10%山羊血清室溫下封閉2 h后，接著加入E-cadherin(1∶100)、Vimentin(1∶100)一抗工作液，4℃下孵育過(guò)夜；次日，棄去一抗液，PBS洗滌后加入熒光二抗工作液(1∶500)，暗室室溫孵育1 h，洗去未結(jié)合二抗，滴加 DAPI 室溫染色 10 min，PBS再次洗滌后封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.9 Western Blot檢測(cè)E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平 取轉(zhuǎn)染后的3組CRC-CSCs細(xì)胞，分別用PBS洗滌后，添加新鮮配制的RIPA裂解溶液，冰上靜置裂解20 min后，離心收集各組上清液，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。配制12%SDS-PAGE凝膠，分別取50 μg的各組蛋白樣品上樣，經(jīng)過(guò)電泳分離蛋白質(zhì)。并電轉(zhuǎn)至PVDF膜(4℃，300 mA恒流1.5 h)，接著置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，TBST洗膜，將膜與E-cadherin(1∶1000)、Vimentin(1∶1000)、Fas(1∶1000)、FasL(1∶1000)一抗工作液共同置于4℃下孵育過(guò)夜；次日，洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(1∶5000)二抗工作液，37℃孵育1 h，TBST再次洗膜，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像后，Quantity One軟件分析各條帶的灰度值，并以GAPDH條帶灰度值作為參照。

1.2.10 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌的TGF-β1、VEGF、IL-6、IL-10水平 收集培養(yǎng)48 h后的3組CRC-CSCs細(xì)胞培養(yǎng)液上清，采用ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TGF-β1、VEGF、IL-6以及IL-10的含量，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔的A值。

2 結(jié)果

2.1 CRC-CSCs細(xì)胞鑒定 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選CRC-CSCs細(xì)胞，CD133+CRC-CSCs細(xì)胞在分選前占23%，而分選后CD133+CRC-CSCs細(xì)胞達(dá)到了93%，見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分選CD133+CRC-CSCs細(xì)胞

2.2 轉(zhuǎn)染后各組CRC-CSCs細(xì)胞中ATF3 mRNA表達(dá)比較 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，sh-ATF3組CRC-CSCs細(xì)胞中ATF3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，而sh-NC組與對(duì)照組的ATF3 mRNA相對(duì)表達(dá)量之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖2A。表明在CRC-CSCs細(xì)胞中敲減ATF3成功。

2.3 敲減ATF3對(duì)CRC-CSCs細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組比較，sh-ATF3組ATE3 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，sh-NC組和對(duì)照組比較ATE3mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CCK-8檢測(cè)各組CRC-CSCs細(xì)胞活性結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，sh-ATF3組CRC-CSCs細(xì)胞在48 h和72 h活性均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而在不同時(shí)刻，sh-NC組與對(duì)照組活性比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2B。

圖2 各組CRC-CSCs細(xì)胞中ATF3 mRNA表達(dá)及活性比較

2.4 敲減ATF3對(duì)CRC-CSCs細(xì)胞成球能力的影響 成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、sh-NC組和sh-ATF3組CRC-CSCs細(xì)胞的成球個(gè)數(shù)分別為(87.56±5.89)、(84.70±5.06)、(20.12±1.58)。與對(duì)照組比較，sh-ATF3組細(xì)胞球體積明顯縮小，成球個(gè)數(shù)也顯著減少(P<0.01)；sh-NC組和對(duì)照組比較細(xì)胞球體積無(wú)明顯變化，成球個(gè)數(shù)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。表明敲減ATF3能抑制結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞球的形成。

圖3 各組CRC-CSCs細(xì)胞成球能力檢測(cè)

2.5 敲減ATF3對(duì)CRC-CSCs細(xì)胞克隆形成能力的影響 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、sh-NC組和sh-ATF3組CRC-CSCs細(xì)胞克隆形成數(shù)量分別為(87.56±5.89)、(84.70±5.06)、(20.12±1.58)個(gè)，sh-ATF3組CRC-CSCs細(xì)胞克隆形成數(shù)量較對(duì)照組減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而sh-NC組細(xì)胞克隆形成數(shù)量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組CRC-CSCs細(xì)胞克隆形成能力

2.6 敲減ATF3對(duì)CRC-CSCs細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和sh-ATF3組CRC-CSCs細(xì)胞中E-cadherin熒光染色較弱，E-cadherin蛋白表達(dá)少，而Vimentin熒光染色較強(qiáng)，蛋白表達(dá)相對(duì)較多；sh-ATF3組CRC-CSCs細(xì)胞中E-cadherin熒光染色明顯增強(qiáng)，Vimentin熒光染色強(qiáng)度明顯減弱，表明E-cadherin蛋白表達(dá)增加、Vimentin蛋白表達(dá)下降，見(jiàn)圖5。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，sh-ATF3組CRC-CSCs細(xì)胞中E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量較高，Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； sh-NC組與對(duì)照組比較，細(xì)胞中E-cadherin與Vimentin蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖6。

圖5 免疫熒光染色檢測(cè)各組CRC-CSCs細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin表達(dá)

圖6 Western Blot檢測(cè)各組CRC-CSCs細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)量

2.7 敲減ATF3對(duì)CRC-CSCs細(xì)胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-6及IL-10的影響 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，sh-ATF3組CRC-CSCs細(xì)胞上清液中TGF-β1、VEGF、IL-10的含量均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而IL-6含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；sh-NC組與對(duì)照組比較，各組細(xì)胞上清液中TGF-β1、VEGF、IL-6、IL-10的含量之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，sh-ATF3組CRC-CSCs細(xì)胞中Fas蛋白相對(duì)表達(dá)量較高，F(xiàn)asL蛋白相對(duì)表達(dá)量較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，sh-NC組和對(duì)照組比較，細(xì)胞中Fas和FasL蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖7。

表1 各組CRC-CSCs細(xì)胞分泌TGF-β1、VEGF、IL-6、IL-10的含量比較

圖7 Western Blot檢測(cè)各組CRC-CSCs細(xì)胞中Fas、FasL蛋白表達(dá)量

3 討論

CRC是全球常見(jiàn)的癌癥類型之一，給患者和社會(huì)均帶來(lái)了巨大負(fù)擔(dān)。常規(guī)化學(xué)療法常運(yùn)用于CRC患者的臨床治療中，但是，除了具有潛在不良反應(yīng)外，化療藥物還會(huì)誘導(dǎo)毒性產(chǎn)生限制化療效果。CRC-CSCs細(xì)胞具有多向分化潛能和自我更新能力，致瘤性較高。此外，CRC-CSCs細(xì)胞在表型和分子結(jié)構(gòu)上均與腫瘤內(nèi)的其他細(xì)胞不同，其對(duì)化學(xué)藥物和放射療法都具有抵抗力，常規(guī)化療藥物只能消除腫瘤細(xì)胞，但對(duì)CSCs細(xì)胞的影響并不大，這在很大程度上導(dǎo)致了CRC患者治療后的復(fù)發(fā)[3,8-9]。因此，確定新穎而特異的方法來(lái)靶向根除CRC-CSCs細(xì)胞，對(duì)于CRC患者的來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。

腫瘤是由多種具有異質(zhì)性的細(xì)胞組成的復(fù)合物，可以輕松適應(yīng)其環(huán)境并逃脫機(jī)體的免疫系統(tǒng)。腫瘤微環(huán)境在決定各種癌癥的進(jìn)展和反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，其可誘導(dǎo)非CSC向CSC的轉(zhuǎn)化，此過(guò)程受許多因素的影響。而在多項(xiàng)研究中已將腫瘤微環(huán)境的改變與不同癌癥干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)聯(lián)系起來(lái)[10]。CRC-CSCs細(xì)胞可以使用不同的細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行識(shí)別，如CD133、CD24、CD44、CD29和ALDH1等[11]。其中，CD133是一種跨膜蛋白，被認(rèn)為是許多類型腫瘤中癌癥干細(xì)胞的標(biāo)志物。研究表明，CD133+的CRC細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療具有抗性，且CD133高表達(dá)是CRC預(yù)后不良的一項(xiàng)重要標(biāo)志[12-14]。目前，通過(guò)靶向腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)記物來(lái)消除CRC-CSCs細(xì)胞已成為CRC治療的新靶點(diǎn)。此外，靶向CRC-CSCs細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路也是一種抑制CRC-CSCs細(xì)胞的方法，例如Valverde等[15]通過(guò)COX-2抑制劑靶向CRC-CSCs細(xì)胞中對(duì)于維持細(xì)胞更新能力起重要作用的WNT/β-catenin信號(hào)途徑后發(fā)現(xiàn)，CRC-CSCs細(xì)胞生長(zhǎng)受到了明顯的抑制。Network等[16]研究表明了BMI1在CRC細(xì)胞中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，能夠誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，敲低BMI1可抑制癌癥干細(xì)胞的自我更新能力。

ATF3是一種適應(yīng)性基因，可對(duì)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的變化做出反應(yīng)并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期與凋亡，現(xiàn)已證明ATF3參與了癌癥的易感性，其表達(dá)變化可引起相關(guān)信號(hào)途徑發(fā)生改變，從而影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[5,17]。據(jù)報(bào)道，在乳腺癌中ATF3能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，與癌癥轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此可被用作乳腺癌死亡相關(guān)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[18]。本研究結(jié)果顯示，在分選的CRC-CSCs細(xì)胞中敲減ATF3表達(dá)后，細(xì)胞活性下降，細(xì)胞的成球個(gè)數(shù)與菌落克隆形成數(shù)目也均下降，同時(shí)，細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)較高而Vimentin蛋白表達(dá)較低，由此說(shuō)明敲減ATF3可能抑制了CRC-CSCs細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

腫瘤免疫逃逸與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，通過(guò)分泌免疫抑制分子來(lái)抑制免疫功能，從而發(fā)揮免疫監(jiān)視逃避的作用，這也是CRC發(fā)展的一項(xiàng)重要機(jī)制[19]。研究表明，CRC-CSCs細(xì)胞可能參與了免疫逃逸和免疫抑制，這有助于維持腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制的清除作用[20]。因此，靶向CRC-CSCs已被證明是克服免疫抑制作用的一種潛在方法。本研究結(jié)果顯示，在敲減ATF3的CRC-CSCs細(xì)胞上清液中免疫抑制因子TGF-β1、VEGF、IL-10的含量均明顯下降。TGF-β1作為腫瘤細(xì)胞分泌的優(yōu)勢(shì)免疫抑制分子，與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及分化等密切相關(guān)，VEGF參與調(diào)控腫瘤血管的生成與增生，IL-10在免疫反應(yīng)和炎癥中起多方向作用，由活化的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞所產(chǎn)生[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)在敲減ATF3后可上調(diào)CRC-CSCs細(xì)胞中Fas蛋白表達(dá)，并且抑制FasL蛋白表達(dá)。而免疫保護(hù)作用由Fas/FasL介導(dǎo)，F(xiàn)asL誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡是Fas介導(dǎo)的凋亡過(guò)程相關(guān)因子，其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以與配體FasL結(jié)合，并且傳遞死亡信號(hào)至胞質(zhì)區(qū)。當(dāng)FasL與Fas結(jié)合后，可形成能夠?qū)⒌蛲鲂盘?hào)傳遞至caspase 8的活性三聚體，從而激活一系列酶聯(lián)反應(yīng)，最終破壞腫瘤細(xì)胞[23]。

綜上所述，本研究表明敲減ATF3可抑制結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞自我更新、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，下調(diào)相關(guān)免疫抑制因子的表達(dá)，其機(jī)制可能與調(diào)控Fas/FasL途徑相關(guān)，這為CRC的診療提供一定的理論依據(jù)。盡管目前靶向腫瘤干細(xì)胞的研究發(fā)展趨勢(shì)迅速，但仍然存在許多丞待解決的問(wèn)題，了解相關(guān)分子信號(hào)傳導(dǎo)途徑維持并調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞的作用可能是改善癌癥治療的主要手段。此外，在了解腫瘤干細(xì)胞分子和基因特征后，進(jìn)一步考慮研究以檢測(cè)和靶向其他關(guān)鍵失調(diào)的途徑，從而尋找腫瘤干細(xì)胞自我更新的新治療靶標(biāo)，可為闡明根除大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞提供有效途徑。

4 結(jié)論

敲減ATF3可抑制結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞自我更新與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，下調(diào)免疫抑制因子TGF-β1、VEGF、IL-10表達(dá)，并且上調(diào)Fas蛋白，下調(diào)FasL蛋白的表達(dá)。