張隆業(yè) 劉維萍 張彥芬 郭永力 管仁蘋 邵雪 王兆宇 李燦

(1.秦皇島市第一醫(yī)院腎臟內(nèi)科，河北 秦皇島 066000；2.秦皇島市第一醫(yī)院藥學(xué)部，河北 秦皇島 066000；3.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，吉林 延吉 133000)

他克莫司(tacrolimus, TAC)是一種廣泛使用的維持性免疫抑制劑，但長期使用會引起相當(dāng)大的腎毒性[1-4]。TAC造成不可逆的腎損傷與小動脈透明變性和增厚，血管收縮和缺血，間質(zhì)纖維化，細(xì)胞凋亡和萎縮[5-6]。TAC誘導(dǎo)的腎毒性的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，其分子機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎性介質(zhì)等多種因素直接相關(guān)，往往各種機(jī)制間相互刺激相互協(xié)調(diào)，共同導(dǎo)致了腎毒性的發(fā)生[7-9]。胰激肽原酶(pancreatic kallikrein，PK)屬于激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)類物質(zhì)，在人體多個部位具有較強(qiáng)的表達(dá)能力，與血管中的活性物質(zhì)相遇后會產(chǎn)生作用效應(yīng)，對腎臟功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。臨床中使用的胰激肽原酶對慢性腎臟病具有良好的治療效果，對糖尿病腎病、藥物相關(guān)腎損傷以及腎病綜合征均有保護(hù)作用。但對TAC誘導(dǎo)的腎損傷無明確作用，分子機(jī)制也無具體研究[10-11]。本課題通過對TAC誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞來研究PK對其保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HK-2細(xì)胞使用培養(yǎng)基DMEM/F12加入10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗(P-S)青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL，培養(yǎng)條件37℃、5%CO2。從液氮中取出HK-2的凍存細(xì)胞，迅速放置于37℃水浴箱中復(fù)蘇細(xì)胞；離心管中準(zhǔn)備適量培養(yǎng)液(8～10 mL)，將HK-2細(xì)胞液移入離心管中；1000 rpm離心3 min，棄去上清，加入適量培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，在細(xì)胞呈單層生長達(dá)80%時則進(jìn)行傳代。收集對數(shù)生長期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對其進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算好鋪板時每孔所需的細(xì)胞個數(shù)，用適當(dāng)量的培養(yǎng)基液體加入，繼續(xù)培養(yǎng)。將各組細(xì)胞按照1×104/孔的標(biāo)準(zhǔn)，在一致培養(yǎng)條件下，在96孔板上進(jìn)行細(xì)胞接種。并在24小時內(nèi)分別使用對應(yīng)藥物，然后將HK-2細(xì)胞劃分為對照(CON)、TAC(50 μg/mL)、PK(6 pg/mL)、TAC+PK(6 pg/mL+50 μg/mL)組，第二天進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 HK-2細(xì)胞活力檢測 每個孔中加入的CCK-8溶液劑量為10 μL，相同條件孵育3 h，在450 nm吸光度條件測OD值。

1.3 HK-2活性氧檢測 將各組細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板，在溫濕度為37℃、5%CO2的環(huán)境下進(jìn)行時長24 h的培養(yǎng)將10 μmol/L DCFH-DA染料滴注在6孔板細(xì)胞中，靜待孵育30 min(溫度為37℃)；采用PBS對細(xì)胞進(jìn)行清潔處理，滴注0.25%胰酶消化，在離心機(jī)上進(jìn)行3次重懸；采用PBS再次清洗細(xì)胞，過濾廢棄液體。采用流式細(xì)胞儀觀察1 mL PBS稀釋細(xì)胞顆粒團(tuán)活力。

1.4 免疫印跡法檢測 采用免疫印跡法檢測4組細(xì)胞，LC3B、Bcline、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 四組HK-2細(xì)胞活力比較 與CON組比較，發(fā)現(xiàn)TAC組的細(xì)胞活力快速下降(P<0.05)；TAC+PK組細(xì)胞活力較高，且顯著大于TAC組(P<0.05)，見圖1。

圖1 四組HK-2細(xì)胞活力測定

2.2 四組HK-2細(xì)胞的ROS比較 在細(xì)胞ROS表達(dá)能力的檢測方面，將二氯二氫熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)熒光檢測法與流式細(xì)胞法進(jìn)行組合使用。TAC組的細(xì)胞ROS表達(dá)能力要顯著優(yōu)于CON組、TAC+PK組 (P<0.05)，見圖2、3。

圖2 四組的細(xì)胞ROS數(shù)量對比分析

圖3 四組HK-2的ROS生成量

2.3 四組HK-2細(xì)胞蛋白水平比較 與CON組相比，TAC組LC3B-Ⅱ表達(dá)增加(P<0.05)；與TAC相比，TAC+PK組LC3B-Ⅱ表達(dá)減少(P<0.05)；與CON組相比，TAC組Beclin表達(dá)增加(P<0.05)；與TAC相比，TAC+PK組Beclin表達(dá)減少(P<0.05)，見圖4。與CON組相比，TAC組腎小管細(xì)胞中Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)；與TAC組相比，TAC+PK組Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)，見圖5。

圖4 腎組織細(xì)胞的LC3B/Beclin蛋白ROS能力監(jiān)測及蛋白表達(dá)對比分析

圖5 四組細(xì)胞的Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及檢測值分析

3 討論

PK抗氧化功能與自噬的自我保護(hù)功能已經(jīng)被多位學(xué)者提及[12-13]。Hisamura等[14]通過大量研究證實(shí)TAC對于細(xì)胞的ROS表達(dá)具有正向的促進(jìn)作用，能夠抑制細(xì)胞組織中的氧化磷酸化反應(yīng)過程，提高氧化反應(yīng)的抵抗能力和防御能力，使抗氧化應(yīng)急反應(yīng)水平下降，最終造成近端的小管細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)或逐漸凋亡。Zhou等[15]研究發(fā)現(xiàn)TAC對細(xì)胞的死亡具有誘導(dǎo)作用，且細(xì)胞的ROS表達(dá)能力和TAC劑量存在顯著的相關(guān)性，細(xì)胞中滴注氧化氫酶、N-乙酰半胱氨酸之后，實(shí)現(xiàn)了TAC介導(dǎo)過程的抑制，使細(xì)胞ROS下降，TAC對細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)能力下降。本文通過研究證實(shí)了TAC組細(xì)胞ROS水平與細(xì)胞活力水平存在負(fù)相關(guān)性，即細(xì)胞活力較高時，細(xì)胞的ROS較低，反之則較高；通過對細(xì)胞的PK干預(yù)使細(xì)胞活性能力得到提高，ROS顯著下降。上述結(jié)果表明TAC可通過促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，PK可以顯著抑制TAC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)一步保護(hù)HK-2細(xì)胞。

腎小管上皮細(xì)胞的代謝效率會隨著腎臟氧氣消耗速度的加快而同步提高，細(xì)胞的自噬有對腎小管細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)定性、細(xì)胞活力水平、細(xì)胞生理功能等方面具有正向的激勵作用。有研究證實(shí)細(xì)胞自噬現(xiàn)象對腎功能藥物損傷、糖尿病腎病、梗阻性腎病均具有良好的保護(hù)作用[16]。同時，在開展體外組織細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的過程中，采用免疫印跡法對HK-2細(xì)胞中的LC3B表達(dá)功能和Beclin表達(dá)功能進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)TAC組的LC3B-Ⅱ表達(dá)功能和Beclin表達(dá)功能均有所提高，PK組的LC3B-Ⅱ和Beclin表達(dá)功能有所下降。在電子顯微鏡的觀察下，HK-2細(xì)胞免疫印跡結(jié)果和腎小管上皮細(xì)胞的自噬體形成過程具有較高的一致性。Lim等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)TAC誘導(dǎo)引發(fā)的損傷主要是因?yàn)榘椎鞍走\(yùn)行阻力增大、細(xì)胞自噬空泡量增加，溶酶體出現(xiàn)損傷。在電子顯微鏡下的典型表現(xiàn)為近端小管中有大量自噬空泡，腎組織與腎小管的P62水平升高、Beclin蛋白表達(dá)能力升高、LC3BⅡ/Ⅰ比值顯著增大，Klotho基因治療可以通過提高溶酶體活力促進(jìn)改善TAC誘導(dǎo)的的自噬體的清除障礙，減少超負(fù)荷蛋白及自噬空泡的聚集，進(jìn)一步調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，與本研究結(jié)果具有較高的相似性。研究有發(fā)現(xiàn)非急性CsA腎損傷與自噬空泡數(shù)量增多，以及自噬清除功能衰退存在顯著的相關(guān)性，典型特征為自噬空泡數(shù)量異常，LC3B-Ⅱ和Beclin的表達(dá)數(shù)量顯著增多。自噬清除減少則表現(xiàn)為P62表達(dá)增加，使用腎臟保護(hù)藥物干預(yù)后自噬功能障礙可明顯改善[18]。Xu等[19]通過電子顯微鏡觀察高糖培養(yǎng)液中的 HK-2 細(xì)胞變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量增長速度較快，且Beclin表達(dá)能力下降，但LC3B-Ⅱ表達(dá)能力增強(qiáng)、P62水平顯著下降。

細(xì)胞自噬現(xiàn)象對腎臟損傷造成的影響備受研究者們的重視，現(xiàn)有的研究結(jié)果尚不統(tǒng)一。研究報(bào)道指出，自噬在各種原因造成的腎功能損傷中，均能夠發(fā)揮一定的腎組織功能保護(hù)作用[20]，但是目前尚無關(guān)于直接提高自噬的方法來證明自噬的作用報(bào)道，通過進(jìn)一步的研究，PK有望成為改善自噬的重要手段。對細(xì)胞凋亡或壞死具有影響作用的因素較多。有文獻(xiàn)報(bào)道，TAC通過細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[21-22]?？紤]到上述PK對細(xì)胞活力的保護(hù)作用，本課題組對PK與HK-2細(xì)胞凋亡的相關(guān)性進(jìn)行了分析和探討，并運(yùn)用免疫印跡檢測法對細(xì)胞凋亡的分子表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)TAC組的Bcl-2表達(dá)有所下降，Bax的表達(dá)有所增強(qiáng)，TAC+PK組Bcl-2表達(dá)顯著高于TAC組，Bax表達(dá)較低。體外研究結(jié)果顯示，腎組織細(xì)胞凋亡與ROS密切相關(guān)[23]，TAC誘導(dǎo)的大鼠腎損傷模型在出現(xiàn)腎小管細(xì)胞凋亡的同時出現(xiàn)腎氧化應(yīng)激水平增高，凋亡增加同時伴隨著氧化應(yīng)激水平的進(jìn)一步增高，凋亡和氧化應(yīng)激水平的此種同向變化提示TAC誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加( Bcl-2蛋白表達(dá)的減少及Bax的增多)可能與其下調(diào)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)LC3B-Ⅱ體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果截然相反，目前考慮與腎組織細(xì)胞群體的不均一性，Beclin、P62等指標(biāo)相互影響作用及細(xì)胞外因素(激素水平、離子濃度等)作用有關(guān)，尚有待進(jìn)一步研究。但二者之間是否存在因果關(guān)系，其具體作用通路如何，尚有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

胰激肽原酶對他克莫司誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制與胰激肽原酶抑制抗氧化應(yīng)激及調(diào)節(jié)自噬有關(guān)。