羅雯 賈莉 張佳文 王冬杰 孔英君

調(diào)查統(tǒng)計顯示，2018年全球新發(fā)肺癌患者和死于肺癌的患者分別為2 093 876和1 761 007例，占所有惡性腫瘤的11.6%和18.4%，肺癌的發(fā)病率和死亡率均排在第一[1]。非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌的80%，臨床上約65%的患者在確診時已處于中晚期，NSCLC的5年生存率小于15%，但是關(guān)于NSCLC發(fā)生和發(fā)展的機制仍不清楚[2]。最新研究顯示自噬和腫瘤干細胞(Cancer stem cells，CSCs)分化在腫瘤進展中起著重要調(diào)控作用，NSCLC細胞的自噬和CSCs會導(dǎo)致疾病進展和化療敏感性降低[3-4]，關(guān)于腫瘤細胞自噬和CSCs的機制是現(xiàn)階段的研究熱點。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一種新型的非編碼RNA，由不帶有5′端帽和3′聚腺苷酸尾的外顯子mRNA或長非編碼RNA反向剪接形成的[5]。circRNA可以使微小RNA(microRNA，miRNA)海綿化失活，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達參與NSCLC的進展[6]。有研究顯示，circABCB10在NSCLC細胞系中的表達增加，下調(diào)circABCB10可促進miR-1252表達并抑制FOXR2水平，從而抑制NSCLC細胞增殖和遷移[7]。還有研究表明，hsa_circ_0020123在NSCLC中表達上調(diào)，且被認為與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后不良密切相關(guān)，hsa_circ_0020123可通過靶向結(jié)合miR-144上調(diào)ZEB1和EZH2，進而促進癌細胞生長和轉(zhuǎn)移[8]。本研究通過基因測序選定hsa_circ_0041198，由于hsa_circ_0041198是由MYO1C基因的部分外顯子環(huán)化而來，所以又稱為circRNA MYO1C。本研究通過細胞實驗分析circRNA MYO1C對NSCLC自噬、CSCs和遷移的影響。希望通過本研究為提高NSCLC化療敏感性提供新的作用靶點，進而能讓目前困擾臨床的化療耐藥問題能有所突破。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

人肺上皮細胞BEAS-2B購自ATCC公司和肺癌細胞A549購自ATCC公司；96孔、24孔組織培養(yǎng)板購自康寧公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；Lipofectamine?2000(Invitrogen公司)；TRIzol試劑購自Aidlab公司；實時熒光定量PCR儀；分光光度計；一抗anti-OCT4，anti-SOX2，anti-NANOG，anti-LC3，anti-P62，anti-GAPDH購自SANTA CRUZ公司；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；PVDF膜。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染

BEAS-2B和A549細胞均培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清、0.1 mg/mL的鏈霉素和100 U/mL的青霉素。將細胞在5%CO2培養(yǎng)箱中于37°C和95%濕度下培養(yǎng)。

將A549細胞分為對照組、NC組和siMYO1C組，NC組和si-MYO1C組細胞分別轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒和si-circRNA MYO1C質(zhì)粒，根據(jù)試劑盒說明書利用LipofectamineTM 2000進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件為7℃和5%CO2，48 h后收集細胞進行后續(xù)研究。

1.3 檢測方法

1.3.1 RT-qPCR實驗 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄，實時定量PCR：使用TRIzol從細胞中提取總RNA。RNA濃度和純度使用分光光度計進行測量。將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA為模板，熒光定量PCR儀擴增。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參，最終數(shù)據(jù)以2-△△CT法計算mRNA相對表達水平，實驗重復(fù)3次。

1.3.2 CCK-8實驗 將1×105個處理后細胞(150 μL)在96孔板中接種，分別在培養(yǎng)第24 h、48 h和72 h加入10 μL CCK-8試劑并在37℃下孵育顯色，利用酶標(biāo)儀檢測在450nm下每孔吸光度(OD)值。

1.3.3 Transwell實驗 在37℃下將細胞培養(yǎng)在無血清DMEM中，將細胞進行血清饑餓處理24 h。然后將細胞接種到24孔Transwell裝置的上部腔室中，將含有10%胎牛血清的DMEM充滿下部腔室。24 h后，清洗掉未侵入的細胞，并將滲透到下腔室中的細胞用4%多聚甲醛固定30 min，并在室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色5 min，光鏡下觀察并統(tǒng)計細胞數(shù)量。

1.3.4 Western blot實驗 將細胞在放射免疫沉淀測定裂解緩沖液中在冰上裂解并收集總蛋白。通過SDS-PAGE分離每個樣品中等量的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。通過在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h來封閉非特異性抗原。隨后，將膜與分別用封閉液稀釋的一抗(1∶200)在4℃下孵育過夜，然后將膜與山羊抗免IgG二抗(1∶1000)在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，使用BandScan分析膠片灰度值計算蛋白相對于GAPDH的表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 circRNA MYO1C在肺癌中的表達特點

相對正常肺上皮細胞，circRNA MYO1C在A549細胞中表達明顯上調(diào)(0.99±0.06vs.4.87±0.88，t=7.597，P=0.002)(圖1)。

圖1 RT-qPCR檢測人肺上皮細胞BEAS-2B和肺癌細胞A549中circRNA MYO1C的表達水平Figure 1 The levels of circRNA MYO1C in BEAS-2B and lung cancer A549 cells were detected by RT-qPCRNote：**P<0.01，when compared with BEAS-2B cells.

2.2 各組細胞中circRNA MYO1C的水平

通過檢測對照組、NC組和siMYO1C組中circRNA MYO1C水平驗證轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示干擾circRNA MYO1C后，與對照組及NC組比較，circRNA MYO1C在A549中表達顯著降低(1.07±0.12，1.05±0.25vs.0.22±0.04，F(xiàn)=27.238，P<0.001)(圖2)。選取NC組和siMYO1C組進行后續(xù)實驗。

圖2 RT-qPCR檢測各組細胞中circRNA MYO1C的表達水平Figure 2 The levels of circRNA MYO1C in the control，NC and siMYO1C groups were detected by RT-qPCRNote：***P<0.001，when compared with the control and NC groups.

2.3 干擾circRNA MYO1C對肺癌細胞生長的影響

結(jié)果顯示與NC組比較，siMYO1C組細胞培養(yǎng)第3天的OD值顯著低于對照組(P<0.001)(圖3)。

圖3 CCK-8法檢測干擾circRNA MYO1C對肺癌細胞生長的影響Figure 3 The effect of interfering circRNA MYO1C on lung cancer cell proliferationNote：***P<0.001，when compared with NC group.

2.4 干擾circRNA MYO1C對肺癌細胞遷移能力的影響

相對NC組，干擾circRNA MYO1C后顯著抑制了A549細胞的遷移(t=-34.154，P<0.001)(圖4)。

圖4 Transwell檢測干擾circRNA MYO1C對肺癌細胞遷移能力的影響(200×)Figure 4 The effect of interfering circRNA MYO1C on the migration ability of lung cancer cells(200×)Note：***P<0.001，when compared with the NC group.

2.5 干擾circRNA MYO1C對肺癌細胞CSC的影響

通過檢測CSCs標(biāo)志蛋白分析circRNA MYO1C對肺癌細胞CSCs的影響。相對NC組，干擾circRNA MYO1C后細胞中OCT4、SOX2和NANOG蛋白水平顯著降低，siMYO1C組的CSCs顯著低于NC組(t=-48.143，P<0.001；t=-31.846，P<0.001；t=-29.721，P<0.001)(圖5)。

圖5 Western blot檢測干擾circRNA MYO1C對肺癌細胞CSC的影響Figure 5 The effect of interfering circRNA MYO1C on CSC in lung cancer cellsNote：***P<0.001，when compared with NC group.

2.6 干擾circRNA MYO1C對肺癌細胞自噬水平的影響

通過檢測自噬底物標(biāo)志蛋白P62和自噬小體形成標(biāo)志蛋白IC3II/LC3I來評估細胞自噬水平。

結(jié)果顯示與NC組比較，siMYO1C組的IC3II/LC3I水平明顯降低，而P62水平升高(t=-39.240，P<0.001；t=51.385，P<0.001)(圖6)。

圖6 Western blot檢測干擾circRNA MYO1C對肺癌細胞自噬水平的影響Figure 6 The effect of interfering circRNA MYO1C on protein expression related to autophagy in lung cancer cellsNote：***P<0.001，when compared with NC group.

3 討論

CSCs作為腫瘤細胞群體中一種異質(zhì)性的細胞對腫瘤的生長和維持具有重要意義。CSCs除了具有和腫瘤細胞相似的特征，如細胞遷移、抗凋亡、放化療抵抗外，CSCs還展現(xiàn)了和干細胞相似的自我更新和多向分化潛能，同時CSCs可表達特異性標(biāo)記蛋白OCT3/4、Nestin、NANOG、CD44、CD24、CD133等[9]。其中作為轉(zhuǎn)錄因子的OCT4賦予了CSCs多向分化和自我更新的潛能[10]；而CD44和CD133表達可增加腫瘤化療耐藥[11]。關(guān)于CSCs起源目前公認的有三種：CSCs起源于干細胞，CSCs起源于祖細胞，CSCs起源于細胞去分化。去分化理論認為原癌基因突變導(dǎo)致了細胞去分化，即在腫瘤組織中，腫瘤細胞去分化成CSCs，這一過程牽涉到對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的誘導(dǎo)，導(dǎo)致干細胞樣表型的獲得和CSCs的形成。TGF-β、Wnt、Hedgehog(Hh)、β-catenin、Notch、NFκB和STAT3等信號通路參與到了對CSCs分化的調(diào)控[12]。除此之外，自噬對CSCs分化也起到了重要調(diào)控作用，但具體機制尚不清楚[13]。

自噬是一個高度保守的自我降解過程，在細胞應(yīng)激反應(yīng)和生存中起著關(guān)鍵作用。最近的研究已經(jīng)開始探索自噬在癌癥轉(zhuǎn)移中的作用，鑒于目前缺乏有效的治療方法來治療轉(zhuǎn)移性疾病，這一點尤其值得關(guān)注。已有研究證實自噬參與了腫瘤的侵襲和化療耐藥過程[14]。自噬作為維持正常組織干細胞和CSCs干性的必要條件，在過去幾年中被廣泛研究。自噬促進干細胞形成的機制以及為什么干細胞比非干細胞更依賴自噬是許多實驗室正在研究的熱點。在正常的組織干細胞中，自噬可通過控制氧化應(yīng)激反應(yīng)來向神經(jīng)干細胞提供代謝物，進而促進神經(jīng)發(fā)生[15]；對于腫瘤，自噬隨著腫瘤惡性程度增加而上調(diào)，抑制自噬激活在很大程度上可增加腫瘤化療敏感性[16]；抑制CSCs分化也同樣可增加腫瘤化療敏感性，提示自噬可通過CSCs來影響腫瘤患者預(yù)后。且很多文獻也已經(jīng)證實自噬對CSCs分化具有促進作用[17]。

除了自噬，越來越多的研究還發(fā)現(xiàn)非編碼RNA對腫瘤化療耐藥起重要調(diào)控作用，circRNA是一種非編碼RNA，在真核生物中的前體mRNA反向剪接過程中，通過3′和5′末端共價連接形成一個閉合的連續(xù)環(huán)[18]。circRNA上有miRNA結(jié)合位點，可通過吸附miRNA來調(diào)控mRNA表達并影響生物學(xué)功能，因此circRNA也被稱為“miRNA分子海綿”[19]。相關(guān)研究顯示，circABCB10在NSCLC細胞系中的表達增加，下調(diào)circABCB10可促進miR-1252表達并抑制FOXR2水平，從而抑制NSCLC細胞增殖和遷移[20]。最近一項研究表明，hsa_circ_0020123在NSCLC中表達上調(diào)，且被認為與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后不良密切相關(guān)，hsa_circ_0020123可通過靶向結(jié)合miR-144上調(diào)ZEB1和EZH2，進而促進癌細胞生長和轉(zhuǎn)移[21]。雖然circRNA在細胞增殖、凋亡、侵襲等惡性表型的多個方面發(fā)揮著重要作用，但是其在腫瘤耐藥性調(diào)節(jié)方面的機制研究還不深入。本研究通過基因測序選定的hsa_circ_0041198，是由MYO1C基因的部分外顯子環(huán)化而來，所以稱為circRNA MYO1C。本次研究首先發(fā)現(xiàn)了circRNA MYO1C在NSCLC細胞系A(chǔ)549細胞中比正常肺上皮細胞明顯升高。并且進一步的研究結(jié)果顯示降低circRNA MYO1C的水平后，A549細胞的增殖和遷移的水平也顯著降低。

miRNA是真核細胞中一類非編碼的小RNA，在進化上具有保守性，通過結(jié)合靶mRNA的3′-UTR參與轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控[22]，在腫瘤生物學(xué)中扮演著重要的作用。研究顯示在動脈粥樣硬化中，miR-129-5p抑制上皮細胞自噬[23]，同時，其他報道也顯示miR-129-5p介導(dǎo)自噬[24]。另有研究顯示，miR-30a可以通過降低beclin 1介導(dǎo)的自噬作用，增強癌細胞對化療藥物的敏感性[25]，提示可通過上調(diào)miR-30a的表達水平提高癌癥化療的療效。此外，miR-489在大多數(shù)乳腺癌細胞和幾種耐藥乳腺癌細胞系中下調(diào)，而miR-489直接靶向自噬激活激酶1(ULK1)和溶酶體蛋白跨膜4β(LAPTM4β)，從而介導(dǎo)自噬抑制，是阿霉素致敏的主要機制[26]。

當(dāng)前的研究顯示miRNA的表達譜在耐藥和不耐藥腫瘤里表達不同。miRNA在腫瘤耐藥方面發(fā)揮多種調(diào)控作用，因此，針對miRNA的新型治療藥物的發(fā)現(xiàn)有望為未來的癌癥治療帶來希望。研究顯示，過表達miR-195可顯著降低抗凋亡蛋白Bcl-w的表達水平，提高肝癌對5-FU的敏感性[27]。項目組研究發(fā)現(xiàn)miR-296-3p可通過靶向抑制CX3CR1來提高NSCLC的化療敏感性[28]。此外，miR-216b在肝癌中介導(dǎo)自噬，它的上調(diào)抑制自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II的表達，通過HIF-2α-MALAT1-miR-216b軸調(diào)控肝癌的多重耐藥性[29]。

根據(jù)研究報道，miR-147b可逆轉(zhuǎn)EMT，誘導(dǎo)細胞周期阻滯，且能逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細胞對抗癌藥物吉非替尼的耐藥性[30]。此外，miR-147b在結(jié)腸癌細胞中下調(diào)，過表達miR-147b降低了結(jié)腸癌細胞中腫瘤干細胞標(biāo)記物OCT4、SOX2和NANOG的表達，進一步證實miR-147b通過Wnt/β-Catenin通路抑制EMT，進而抑制結(jié)腸癌干細胞化[31]。研究發(fā)現(xiàn)miR-147b在HCC細胞系和原發(fā)性肝癌組織中均下調(diào)，HOXC6是miR-147b的下游靶點，過表達miR-147b抑制了HOXC6表達，顯著抑制肝癌在體外的增殖和遷移，并增加對5-FU化療敏感性，降低體內(nèi)致瘤性[32]。這表明miR-147b可以作為逆轉(zhuǎn)和預(yù)防肺癌耐藥性的潛在靶點[33]。下一步可對circRNA MYO1C與miR-147b間具有怎樣的表達相關(guān)性進行研究證實。

本研究結(jié)果顯示在干擾circRNA MYO1C后，細胞中OCT4、SOX2、NANOG和IC3II/LC3I水平蛋白水平顯著降低，而P62水平升高。本研究首次揭示了circRNA MYO1C促進NSCLC細胞生長和遷移的功能，此外，circRNA MYO1C還參與了CSCs和自噬調(diào)控，這可能與NSCLC的轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。

綜上所述，下調(diào)circRNA MYO1C能夠抑制NSLCLC細胞的CSCs分化和自噬相關(guān)蛋白表達，并抑制肺癌細胞遷移。本研究為提高NSCLC化療敏感性提供新的作用靶點，希望進而能讓目前困擾臨床的化療耐藥問題能有所突破。