王麗娜 王樂 靳紅 李奇 成海燕

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤[1]，嚴(yán)重危害女性的健康。目前宮頸癌發(fā)生發(fā)展的確切分子機(jī)制尚不完全清楚，其研究主要集中在基因表達(dá)水平的調(diào)控上，對翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)水平的調(diào)控研究較少。泛素蛋白1(Ubiquilin 1，UBQLN1)是泛素蛋白(UBQLNs)家族中的一員，參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，主要通過促進(jìn)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)降解[2]、參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解[3]、自噬[4]、細(xì)胞凋亡[5]和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)[6]等多種機(jī)制。UBQLN1過表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌、胃癌、肺癌及乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，并可作為判斷胃癌和乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)[7-10]。UBQLN1通過多種機(jī)制促進(jìn)其自身的表達(dá)從而調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，然而目前尚無UBQLN1參與調(diào)控宮頸癌的研究。本研究旨在檢測UBQLN1在宮頸癌中的表達(dá)，探討其與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，分析UBQLN1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 一般資料

宮頸癌芯片(HUTES154SU01)共納入117例宮頸癌癌組織和32例配對的癌旁組織。所有患者均于2010年1月—2011年10月在哈醫(yī)大附屬腫瘤醫(yī)院接受根治性手術(shù)，術(shù)前、術(shù)后均未接受放療和化療。所有患者均無嚴(yán)重內(nèi)科合并癥。收集完整資料，包括患者年齡、組織學(xué)分級、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期(2018年)。本研究獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初治患者；(2)宮頸活組織切片病理檢查診斷為宮頸鱗癌、腺癌或腺鱗癌患者；(3)患者經(jīng)兩位臨床婦科醫(yī)生確定宮頸癌國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)臨床分期；(4)臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他腫瘤病史的患者；(2)其他少見病理類型的宮頸癌如透明細(xì)胞癌等；(3)患者既往有過盆腔放療史或全身化療史。

1.3 隨訪

定期隨訪本研究中所有患者，隨訪截止時(shí)間為2017年3月，隨訪時(shí)間范圍5.5～6.8年，33例患者死亡。無病生存期(DFS)是指從手術(shù)日期到確認(rèn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時(shí)間?？偵嫫?OS)是指從手術(shù)到由于任何原因死亡或最后一次接觸的時(shí)間。

1.4 方法

1.4.1 免疫組織化學(xué)染色[11-13]組織切片去蠟油，再水化，并用羊血清阻塞。4℃下抗UBQLN1抗體(1∶1 000，ab3341，Abcam)孵育過夜后，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次，與HRP偶聯(lián)二抗(1∶300，K8002，Dako)室溫孵育30 min。PBS沖洗3次5 min后，將染色的切片與3，3′-二氨基聯(lián)苯胺反應(yīng)10 min，然后用0.1%蘇木精反染。

1.4.2 UBQLN1免疫組化染色分析 免疫組織化學(xué)結(jié)果由兩位病理學(xué)專家獨(dú)立評估，均未參考臨床資料。UBQLN的表達(dá)通過染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)來確定。強(qiáng)度分為四個(gè)分?jǐn)?shù)：“0”表示沒有棕色顆粒；“1”表示淺棕色顆粒；“2”表示中等棕色顆粒；“3”表示深棕色顆粒。UBQLN1中陽性細(xì)胞百分比也分為4個(gè)評分：陽性細(xì)胞<10%為0；陽性細(xì)胞10～40%為1；陽性細(xì)胞≥40～70%為2；陽性細(xì)胞≥70%為3。以“染色強(qiáng)度評分”與“染色陽性率”的乘積作為分組總評分。根據(jù)數(shù)據(jù)分布，≤3分為低表達(dá)組，>3分為高表達(dá)組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 23.0。采用卡方檢驗(yàn)比較不同組的臨床病理特征。獨(dú)立樣本采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較,配對資料通過配對t檢驗(yàn)比較組間差異。采用單因素和多因素Cox回歸分析確定宮頸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)比較各組生存曲線的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織中UBQLN1蛋白的過表達(dá)

UBQLN1在宮頸癌癌組織和癌旁組織細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞核中表達(dá)，呈棕黃色顆粒(圖1)。32對宮頸癌及其配對癌旁組織的免疫組化染色分析結(jié)果顯示，宮頸癌組織中UBQLN1蛋白表達(dá)高于癌旁組織(t=3.19，P=0.003)(圖2)。宮頸癌組織中UBQLN1陽性率為88.8%(104/117)，配對癌旁組織中UBQLN1陽性率為56.3%(18/32)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.041，P<0.001)。

圖1 免疫組化染色分析UBQLN1在宮頸癌及癌旁組織標(biāo)本中的表達(dá)Figure 1 The expression of UBQLN1 in cervical cancer and adjacent tissues by immunohistochemistryNote：A.The high expression of UBQLN1 in cervical carcinoma tissues；B.The low expression of UBQLN1 in the corresponding cervical carcinoma adjacent tissues；C.The high expression of UBQLN1 in cervical adenocarcinoma tissues；D.The low expression of UBQLN1 in the corresponding cervical adenocarcinoma adjacent tissues(A-D.original magnification，100×；a-d.original magnification，200×).

圖2 UBQLN1蛋白在宮頸癌癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Figure 2 The expression of UBQLN1 in cervical cancer tissues and adjacent tissues

表1 宮頸癌組織和癌旁組織中UBQLN1陽性表達(dá)率[n(%)]Table 1 Comparison for positive rate of UBQLN1 in cervical cancer and adjacent tissues[n(%)]

2.2 UBQLN1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

UBQLN1蛋白高表達(dá)與年齡大、組織學(xué)分級差相關(guān)(P<0.05)。UBQLN1蛋白高表達(dá)與患者病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HPV、病灶大小、臨床分期無關(guān)(P>0.05)(表2)。

表2 UBQLN1蛋白表達(dá)與117例宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]Table 2 Relationship between UBQLN1 protein expression and clinicopathological features in 117 cases of cervical cancer[n(%)]

2.3 宮頸癌患者UBQLN1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

117例患者的中位OS為71.71個(gè)月，95%CI為67.42～76.00個(gè)月，中位DFS為69.89個(gè)月，95%CI為65.49～74.29個(gè)月。UBQLN1高表達(dá)與短OS和DFS相關(guān)(圖3)。將Kaplan-Meier分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)FIGO分期和年齡為宮頸癌患者OS和DFS的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)(P<0.001)，而UBQLN1并不是宮頸癌患者OS和DFS的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)(P=0.315和P=0.174)(表3，表4)。

表3 宮頸癌患者OS的影響因素分析Table 3 Analysis of influencing factors of OS of patients with cervical cancer

圖3 UBQLN1表達(dá)與生存期的Kaplan-Meier分析Figure 3 The Kaplan-Meier analysis for the relationship between UBQLN1 expression and survival of cervical cancer patient

表4 宮頸癌患者DFS的影響因素分析Table 4 Analysis of influencing factors of DFS of patients with cervical cancer

4 討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多階段的復(fù)雜過程，關(guān)于其分子機(jī)制研究層出不窮[14-15]，泛素蛋白(UBQLNs)是維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要因素, 在多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮著重要作用。泛素蛋白(UBQLNs)包含5個(gè)亞型蛋白(UBQLN1-4、L)。所有的UBQLNs都有三個(gè)功能域:N端泛素樣結(jié)構(gòu)域(UBL)、C端泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(UBA)和中間的STI伴侶結(jié)構(gòu)域[17-18]。UBQLN1蛋白屬于UBQLNs主要成員之一，UBQLN1全長由11個(gè)外顯子組成，具有3個(gè)功能域，編碼基因位于人類9號染色體(9q22)上，編碼589或561個(gè)氨基酸序列，廣泛表達(dá)于組織[16]。UBQLN1參與多種惡性腫瘤的調(diào)控，其中包括食管癌、胃癌和胰腺癌等。謝光琴等[19]實(shí)驗(yàn)證明UBQLN1能促進(jìn)EMT的發(fā)生，并能通過誘導(dǎo)EMT增加食管鱗癌細(xì)胞間移動性，降低粘附力，從而促進(jìn)食管癌的侵襲和遷移。Bao等[8]通過免疫組化研究證實(shí)UBQLN1在胃癌組織中表達(dá)率較高，并且腫瘤組織大、TNM 分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高UBQLN1表達(dá)的胃癌患者預(yù)后較差，并且生存期也明顯降低。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中mir-675-5p和UBQLN1共同作用可使ZEB1蛋白表達(dá)增加，并可通過調(diào)控UBQLN1- ZEB1 - mir200信號通路促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展過程。以上研究證實(shí)UBQLN1參與調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，提示UBQLN1可能成為腫瘤研究進(jìn)展的標(biāo)記物。但在宮頸癌中相關(guān)研究未見。本實(shí)驗(yàn)通過臨床樣本研究證實(shí)UBQLN1在宮頸癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，參與促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)UBQLN1在宮頸癌組織中UBQLN1陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，但由于本實(shí)驗(yàn)所選標(biāo)本期別較早，不涉及明顯的深層侵犯問題，無法說明是否影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。單因素分析顯示UBQLN1與預(yù)后顯著相關(guān)，說明UBQLN1的表達(dá)影響宮頸癌患者的預(yù)后。由于本研究只對早期宮頸癌患者進(jìn)行研究，受到病例數(shù)和患者臨床分期早的限制，不能明確闡述UBQLN1對宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的影響。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)UBQLN1能夠參與調(diào)控惡性腫瘤的的侵襲和轉(zhuǎn)移[3-5]，UBQLN1能否在宮頸癌中發(fā)揮同樣作用，需要我們今后通過實(shí)驗(yàn)不斷證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)UBQLN1在宮頸癌中明顯高表達(dá)，且其高表達(dá)與宮頸癌預(yù)后不良相關(guān)。UBQLN1可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，這與UBQLN1在其他實(shí)體腫瘤中研究一致，但是具體通過何種信號通路或者基因靶點(diǎn)等調(diào)控宮頸癌進(jìn)程有待進(jìn)一步研究。相信伴隨著UBQLN1的深入研究會為宮頸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、藥物治療研究和預(yù)后評估提供新的靶點(diǎn),為臨床工作中腫瘤的有效治療提供更可靠的依據(jù)。