李世森，杜昆利，劉小娟

空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化外科，西安 710032

胃癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，是全球第4大常見(jiàn)腫瘤，其發(fā)病率和病死率均逐年上升，并趨于年輕化，嚴(yán)重危害患者的健康。中國(guó)是胃癌高發(fā)地區(qū)，每年胃癌新發(fā)例數(shù)和病死例數(shù)均居全球前列，因此有必要深入探討胃癌發(fā)生機(jī)制，探尋可以早期診斷預(yù)測(cè)胃癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)指標(biāo)，具有重要的臨床實(shí)際意義。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶12（cyclin dependent kinase 12，CDK12）屬于CDK的一種，在調(diào)控DNA損傷和應(yīng)激損傷的細(xì)胞應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄方面發(fā)揮特定作用。近年來(lái)關(guān)于CDK12過(guò)表達(dá)在多種惡性腫瘤如乳腺癌、胰腺導(dǎo)管癌等中已有報(bào)道。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 1[poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP1]基因產(chǎn)物是與腫瘤風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的重要蛋白，可催化單鏈斷裂的堿基切除修復(fù)步驟，在人類(lèi)癌變DNA修復(fù)系統(tǒng)和維持基因組的完整性方面起關(guān)鍵作用。早期研究已報(bào)道

PARP1

基因多態(tài)性與胃癌易感性有關(guān)，同時(shí)攜帶

PARP

-1940Lys/Arg和

PARP

-1762Ala/Ala+Val/Ala基因型的個(gè)體患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)是野生型攜帶者的4.2倍，但近年來(lái)關(guān)于PARP1在胃癌患者中的表達(dá)研究少見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中CDK12、PARP1的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系，探究其臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年3月至2015年3月于空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)切除治療的76例胃癌患者為研究對(duì)象，取其胃癌組織標(biāo)本及相應(yīng)癌旁正常胃黏膜組織標(biāo)本（距離腫瘤組織＞5 cm）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲，均經(jīng)病理檢查證實(shí)為胃癌；②均為首次治療，接受胃癌根治術(shù)，且術(shù)前未行放療、化療或其他抗腫瘤治療；③臨床資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他原發(fā)腫瘤；②不配合隨訪。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析Ualcan（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個(gè)有效的腫瘤數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站，GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）是一個(gè)由北京大學(xué)開(kāi)發(fā)的數(shù)據(jù)庫(kù)，二者都是基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)分析和可視化的網(wǎng)站，可幫助醫(yī)學(xué)科研人員對(duì)相關(guān)腫瘤基因進(jìn)行生物標(biāo)志物鑒定、表達(dá)圖譜分析、生存分析等。本研究基于上述兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)

CDK12

、

PARP1

mRNA在胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中的表達(dá)差異進(jìn)行比較。

1.2.2 免疫組化法檢測(cè)胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中CDK12、PARP 1蛋白表達(dá)將石蠟組織標(biāo)本以4 μm切片，進(jìn)行脫蠟、水化處理，采取免疫組化EnVision兩步染色法檢測(cè)CDK12、PARP1蛋白表達(dá)情況，方法步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。一抗采用兔抗人CDK12多克隆抗體、兔抗人PARP1多克隆抗體（均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司），二抗采用羊抗兔CDK12、PARP1（均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司），二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。以已知陽(yáng)性切片標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分。①按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為0分，淺黃色為1分，黃色或黃棕色為2分，棕褐色為3分；②按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，＜25%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。兩種評(píng)分方法得分的乘積為最終結(jié)果，以最終結(jié)果＞2分為陽(yáng)性表達(dá)（+），≤2分為陰性表達(dá)（-）。

1.3 隨訪觀察

所有胃癌患者術(shù)后均行電話隨訪或門(mén)診隨訪，隨訪自手術(shù)后第1個(gè)月起，截至2020年3月或患者死亡（8～60個(gè)月）。第1～2年每1～3個(gè)月隨訪一次，第3～4年每6個(gè)月隨訪一次，之后每年隨訪一次。觀察胃癌患者在隨訪結(jié)束時(shí)及隨訪過(guò)程中的生存狀況，分析CDK12、PARP1蛋白表達(dá)情況與患者生存的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)中正常胃黏膜組織和胃癌組織中CDK12、PARP 1 mRNA表達(dá)情況的比較

Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，胃癌組織（

n

=415）中

CDK12

mRNA表達(dá)水平為19.17（12.47，24.73），高于正常胃黏膜組織（

n

=34）的 9.41（7.52，11.78），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

Z

=10.265，

P

＜0.05）；胃癌組織（

n

=415）中

PARP1

mRNA表達(dá)水平為65.37（50.09，88.61），高于正常胃黏膜組織（

n

=34）的35.63（28.15，42.20），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

Z

=17.923，

P

＜0.05）。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，胃癌組織（

n

=408）中

CDK12

、

PARP1

mRNA表達(dá)水平分別為（4.17±0.63）、（5.92±0.78），均高于正常胃黏膜組織（

n

=211）的（3.12±0.42）、（4.23±0.59），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=21.827、27.643，

P

＜0.05）。胃癌組織中

CDK12

mRNA和

PARP1

mRNA水平呈正相關(guān)（

r

=0.15，

P

=0.003）。

2.2 免疫組化法分析胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中CDK12和PARP 1蛋白表達(dá)情況的比較

免疫組化結(jié)果顯示，CDK12在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，其中細(xì)胞核占多數(shù)，PARP1主要定位于細(xì)胞核（圖1）。胃癌組織中CDK12、PARP1陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.58%（62/76）、85.53%（65/76），均明顯高于癌旁正常胃黏膜組織中的17.11%（13/76）、21.05%（16/76），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=63.195、63.459，

P

＜0.01）。

圖1 胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中CDK12和PARP 1蛋白表達(dá)情況（免疫組化法，×400）

2.3 不同臨床特征胃癌患者的胃癌組織中CDK12和PARP 1蛋白表達(dá)情況的比較

不同年齡、性別、腫瘤大小的胃癌患者的胃癌組織中CDK12和PARP1蛋白表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。不同TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的胃癌患者的胃癌組織中CDK12和PARP1蛋白表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胃癌患者的胃癌組織中CDK12和PARP 1蛋白表達(dá)情況的比較（ n=76）

2.4 生存分析

生存分析結(jié)果顯示，CDK12蛋白陽(yáng)性表達(dá)胃癌患者5年生存率為30.65%（19/62），明顯低于CDK12蛋白陰性表達(dá)患者的78.57%（11/14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=10.980，

P

=0.001）；PARP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者5年生存率為32.31%（21/65），明顯低于PARP1蛋白陰性表達(dá)患者的81.82%（9/11），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=7.691，

P

=0.006）。（圖2、圖3）

圖2 CDK12蛋白陽(yáng)性表達(dá)（ n=62）與CDK12蛋白陰性表達(dá)（ n=14）胃癌患者的生存曲線

圖3 PARP 1蛋白陽(yáng)性表達(dá)（ n=65）與PARP 1蛋白陰性表達(dá)（ n=11）胃癌患者的生存曲線

2.5 胃癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

以胃癌患者預(yù)后情況為因變量（生存=0，死亡=1），以年齡（＜60歲=0，≥60歲=1）、性別（女=0，男=1）、腫瘤大?。ǎ?.0 cm=0，≥5.0 cm=，）、CDK12蛋白表達(dá)（陰性=0，陽(yáng)性=1）、PARP1蛋白表達(dá)（陰性=0，陽(yáng)性=1）、TNM分期（Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1）、分化程度（低分化=1，高/中分化=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無(wú)=0，有=1）為自變量進(jìn)行單因素及多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，CDK12蛋白陽(yáng)性表達(dá)、PARP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（

P

＜0.01）。（表2、表3）

表2 胃癌患者預(yù)后影響因素的單因素Cox回歸分析

表3 胃癌患者預(yù)后影響因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

胃癌的早期癥狀不易被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)，多數(shù)已發(fā)展為中后期，其難治性主要與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲作用有關(guān)。細(xì)胞的生命開(kāi)始于細(xì)胞周期，腫瘤細(xì)胞亦然，細(xì)胞周期的正常運(yùn)行依賴于精確的調(diào)控機(jī)制。目前已發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞周期調(diào)控的分子有3大類(lèi)：細(xì)胞周期蛋白、CDK以及CDK抑制劑，其中CDK是調(diào)控的核心。大量研究發(fā)現(xiàn)，有90%左右的腫瘤存在CDK活性增強(qiáng)，CDK調(diào)控異常可作為腫瘤發(fā)生的標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)，CDK12定位于人體染色體17p12上，包含一個(gè)相對(duì)保守的激酶域（kinase domain，KD），KD可介導(dǎo)RNA聚合酶Ⅱ的磷酸化。CDK12在人體內(nèi)普遍表達(dá)，其中生殖組織、內(nèi)分泌組織、骨髓、脾臟等組織器官中CDK表達(dá)較高，且主要表達(dá)于細(xì)胞核。本研究結(jié)果顯示，CDK12在胃癌組織中主要定位于細(xì)胞核，其陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，表明CDK12在胃癌組織中過(guò)表達(dá)，可能發(fā)揮致癌基因作用。研究發(fā)現(xiàn)，CDK12/cyclin K復(fù)合物在Ser2位點(diǎn)磷酸化RNA聚合酶Ⅱ，是轉(zhuǎn)錄開(kāi)始到延伸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)；敲除

CDK12

或

cyclin K

導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)DNA損傷反應(yīng)敏感，提示CDK12/cyclin K在DNA損傷修復(fù)（DNA damage repair，DDR）及損傷應(yīng)答中起重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，CDK12蛋白表達(dá)水平與胃癌分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與Ualcan、GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中

CDK12

mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致，然而未觀察到CDK12蛋白表達(dá)與胃癌患者年齡、性別的相關(guān)性，可能基因與蛋白水平存在一定差異。C-C趨化因子配體21（C-C motif chemokine ligand 21，CCL21）可能是 CDK12的下游效應(yīng)基因，CCL21可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞生物學(xué)功能，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答激活，與腫瘤浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測(cè)CDK12可能通過(guò)CDK12/CCL21通路參與胃癌腫瘤細(xì)胞的惡性功能調(diào)節(jié)和免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)，影響胃癌腫瘤細(xì)胞的增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。PARP1是PARP家族表達(dá)最豐富、研究最多的一種，由N末端的DNA結(jié)合域（DNA-binding domain，DBD）、中間的自身修飾結(jié)構(gòu)域（self modification domain，SMD）和C末端的催化結(jié)構(gòu)域（catalytic central domain，CCD）組成，PARP1通過(guò)DBD中的2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)識(shí)別單鏈或雙鏈斷裂DNA并與之結(jié)合發(fā)揮修復(fù)作用。生理狀態(tài)下的PARP1活性較低，當(dāng)接收到機(jī)體應(yīng)激信號(hào)時(shí)可引起生物活性增加，感知并轉(zhuǎn)導(dǎo)不同信號(hào)，通過(guò)磷酸化、乙?；?、泛素化或糖基化修飾作用與相應(yīng)靶蛋白結(jié)合，參與DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄、基因組完整性維持、細(xì)胞分裂凋亡、炎性因子表達(dá)等生理過(guò)程。國(guó)內(nèi)學(xué)者張頂頂?shù)妊芯繄?bào)道，PARP1在激活后，與DNA結(jié)合可調(diào)控腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎性因子表達(dá)，通過(guò)上調(diào)血管壁外膜炎癥反應(yīng)參與調(diào)控顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展及破裂，揭示了PARP1與炎癥因子的作用關(guān)系。另有研究指出，PARP1過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致染色體DNA大量斷裂，并觸發(fā)一種固有的依賴于PARP1的細(xì)胞死亡程序，該程序廣泛存在于多種器官系統(tǒng)中。本研究結(jié)果顯示，PARP1主要表達(dá)于胃癌組織細(xì)胞的細(xì)胞核中，其在腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，推測(cè)胃癌組織及細(xì)胞中PARP1細(xì)胞死亡程序被過(guò)度激活，DNA遭到大量破壞，細(xì)胞周期調(diào)控異常，使得腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖，導(dǎo)致患者病情惡化。另外，PARP1蛋白表達(dá)與胃癌組織分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明PARP1可能參與胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中CDK12和PARP1表達(dá)呈正相關(guān)，與GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中

CDK12

mRNA和

PARP1

mRNA在胃癌組織中表達(dá)趨勢(shì)一致，推測(cè)二者可能發(fā)揮協(xié)同作用調(diào)控DNA的轉(zhuǎn)錄，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，具體作用機(jī)制尚不清楚。生存分析結(jié)果顯示，CDK12、PARP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)胃癌患者5年生存率均明顯低于陰性表達(dá)患者，Cox分析顯示CDK12蛋白、PARP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明CDK12、PARP1表達(dá)與胃癌患者生存預(yù)后有關(guān)，可能作為提示胃癌患者預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)志物。有研究顯示，PARP抑制劑對(duì)治療

CDK12

缺失患者具有重要意義，或可對(duì)臨床治療提供重要參考依據(jù)，因此關(guān)于兩者的具體作用機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，CDK12、PARP1蛋白在胃癌組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)，二者可能共同作用在基因轉(zhuǎn)錄水平參與胃癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。