張寶會, 王晨桐, 郭 淼, 肖 華

(微生物代謝國家重點實驗室, 上海交通大學生命科學技術學院, 上海 200240)

在生命活動的調(diào)解中,蛋白質(zhì)通過改變自身的豐度、定位、降解和翻譯后修飾(PTM)來實現(xiàn)催化、免疫和細胞增殖等各項功能[1]。磷酸化是常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式[2],在特定時間內(nèi),超過30%的蛋白質(zhì)會發(fā)生磷酸化或以磷酸化形式呈現(xiàn)[3]。固定化金屬離子親和色譜(IMAC)是一種高效的磷酸化肽段富集技術[4],金屬離子(如Ti4+、Fe3+和Ga3+)[5,6]通過螯合固定在基質(zhì)上,在酸性條件下吸附磷酸化肽段,并在堿性條件下洗脫[7]。該方法具有很高的特異性,能夠富集不同氨基酸位點上的磷酸基團。新型鈦離子螯合IMAC材料(Ti4+-IMAC)具有高選擇性和高穩(wěn)定性[8]。通過使用Ti4+-IMAC材料,Giansanti等[9]從Jurkat T細胞中分離鑒定到了30 000多種特征磷酸化肽段。

蛋白質(zhì)的磷酸化會影響細胞增殖、轉(zhuǎn)移等特性[10],而癌癥的轉(zhuǎn)移又是癌癥進展和惡化的主要表現(xiàn)。在臨床上,癌癥通常會在中晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移,影響原發(fā)灶以外的其他臟器,給治療和預后帶來極大挑戰(zhàn)。以肺癌為例,其常見的轉(zhuǎn)移部位包括肝臟、大腦、骨骼和淋巴等,而相應的生物學機制尚不十分清楚[11]。因此,比較不同轉(zhuǎn)移能力細胞的磷酸化蛋白質(zhì)組有助于研究蛋白質(zhì)磷酸化在癌癥轉(zhuǎn)移和進展中的作用。

人低轉(zhuǎn)移肺癌細胞95C和人高轉(zhuǎn)移肺癌細胞95D是通過單細胞克隆技術從人肺巨細胞癌細胞系(PLA-801)中分離得到的4個亞系(A、C、D、E株)中的兩株。皮下接種裸鼠后,D株(95D)自發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較高,A、E株中等,而C株(95C)較低,95D和95C是研究腫瘤轉(zhuǎn)移和非小細胞肺癌的理想模型。MRC5是貼壁、梭型、成纖維肺細胞,從14周胎兒正常肺組織中獲得。研究這些正常肺細胞和不同轉(zhuǎn)移能力的肺癌細胞中的蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組,將有助于發(fā)現(xiàn)與肺癌轉(zhuǎn)移進展相關的關鍵通路和調(diào)控蛋白[11]。

本文在現(xiàn)有Ti4+-IMAC方法的基礎上,比較兩種尺寸(10 μm和30 μm)Ti4+-IMAC在磷酸肽富集中的差異,并對比了10 μm Ti4+-IMAC通過振蕩法和固相萃取法(SPE)富集磷酸化肽的效果,采用優(yōu)化的策略研究了3種轉(zhuǎn)移能力不同的肺細胞系(MRC5、95C和95D),通過對不同轉(zhuǎn)移能力肺細胞的蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組進行比較分析,對差異蛋白質(zhì)進行生信分析,揭示了差異表達的磷酸化位點和磷酸化肽段,從而發(fā)掘肺癌轉(zhuǎn)移相關的磷酸化蛋白質(zhì)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

納升液相色譜(Easy-nLC1000)和軌道離子阱質(zhì)譜儀(LTQ-Orbitrap XL)購于賽默飛公司(美國)。電熱鼓風干燥箱購于上海恒科學儀器有限公司(中國),超聲波清洗器購于昆山市超聲波儀器有限公司(中國), 5424離心機和離心濃縮儀購于艾本德公司(美國),多功能酶標儀購于GE公司(美國)。

蛋白質(zhì)酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購于羅氏公司(瑞士), Ti4+-IMAC(～10 μm)和Ti4+-IMAC(～30 μm)購于百靈威科技有限公司(中國),蛋白質(zhì)濃度測定(BCA)試劑盒購于賽默飛公司(美國), MEM基本培養(yǎng)基和RPMI1640基本培養(yǎng)基購于Gibco公司(美國)。

1.2 模式磷酸化肽段樣本的制備

對牛血清白蛋白(BSA)和α-酪蛋白(α-casein)分別進行酶解,并按照質(zhì)量比200∶1的比例混合,制備模式磷酸化肽段樣本。

1.3 細胞培養(yǎng)和細胞蛋白質(zhì)酶解

MRC5使用MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),95C和95D細胞使用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(10%胎牛血清,1×青霉素/鏈霉素溶液)。所有細胞在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞長到對數(shù)生長期后期傳代,胰酶37 ℃消化數(shù)分鐘,傳代密度控制在細胞增殖最快的狀態(tài)。取長勢良好的細胞,300×g下離心5 min,棄上清,收集細胞沉淀,用含6 mol/L尿素的碳酸氫銨溶液裂解細胞,棄上層脂質(zhì)部分,向澄清的細胞樣本中加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,得到細胞蛋白質(zhì)樣本。參照BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒說明書測定細胞蛋白樣本的濃度。取適當質(zhì)量的蛋白質(zhì)溶液,加入終濃度2 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT), 60 ℃水浴1 h,加入10 mmol/L碘乙酰胺(IAA),室溫避光反應40 min。按照常規(guī)FASP(filter-aided sample preparation)方法進行蛋白酶解(胰酶與樣品蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1∶50)。

1.4 磷酸化肽段的富集

將30 μm的大尺寸Ti4+-IMAC標記為Ti4+-IMAC-L,將10 μm的小尺寸Ti4+-IMAC標記為Ti4+-IMAC-S,按照Ti4+-IMAC說明書將Ti4+螯合在IMAC上,并配制以下溶液:上樣緩沖液(80%(v/v,下同)乙腈,6%三氟乙酸)、洗滌緩沖液1(50%乙腈,6%三氟乙酸,200 mmol/L氯化鈉)、洗滌緩沖液2(30%乙腈,0.1%三氟乙酸)、洗脫緩沖液1(10%氨水)和洗脫緩沖液2(1%甲酸)。

振蕩法富集磷酸化肽段方法:將凍干后的肽段樣品重溶于1倍體積的上樣緩沖液至終濃度為1 mg/mL,將肽段溶液與Ti4+-IMAC混合(材料與肽段質(zhì)量比為25∶1)振蕩30 min, 15 000×g離心去上清。加入1倍體積的洗滌緩沖液1,振蕩30 min,離心棄上清,再加入1倍體積的洗滌緩沖液2洗滌兩次(混合振蕩15 min并離心棄上清),將鹽離子充分洗去。加入150 μL洗脫緩沖液1超聲15 min,再振蕩15 min,離心收集洗脫液,再向材料中加入150 μL洗脫緩沖液1振蕩15 min,離心收集第二次的洗脫液,將兩份洗脫液合并,18 000×g離心5 min,充分去除材料沉淀,真空干燥。

SPE法富集磷酸化肽段[12]:參考文獻[12]制作SPE柱,肽段溶液與Ti4+-IMAC質(zhì)量比為1∶20,加入緩沖液的體積使肽段濃度保持在1 mg/mL左右。用適當轉(zhuǎn)速離心,使液體全部流下時間約為10 min。加入200 μL洗滌緩沖液1,用相同轉(zhuǎn)速離心至液體全部流下并重復洗滌一次,再用洗滌緩沖液2以同樣方法洗滌兩次。更換收集管,加入200 μL洗脫緩沖液洗滌1兩次,再用100 μL洗脫緩沖液2洗脫兩次。將濾出液真空干燥。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜分析

取細胞總蛋白質(zhì)酶解后的肽段,通過ZipTipC18除鹽。取2 μg除鹽后的肽段上樣進行基于液相色譜-質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組分析,每個樣品進行3次技術重復。

取500 μg各細胞總蛋白質(zhì)酶解后的肽段,采用Ti4+-IMAC富集磷酸化肽段,除鹽后上樣,進行基于液相色譜-質(zhì)譜的磷酸化蛋白質(zhì)組分析,每個樣品進行3次技術重復。

液相色譜-質(zhì)譜的相關參數(shù)如下:C18反相柱(15 cm×75 μm, 3 μm, Thermo Fisher Scientific),離子源為電噴霧(ESI),質(zhì)譜電噴霧毛細管電壓1 900 V,氣體流速2.0 L/min,離子源溫度為120 ℃,選擇質(zhì)核比為350～2 000的母離子進行CID(collision-induced dissociation)二級碎裂掃描,碰撞能量為20～70 eV,動態(tài)排除0.25 min。

1.6 數(shù)據(jù)分析

Proteome Discoverer(PD,版本1.3)搜庫:Homo sapiens數(shù)據(jù)庫(版本2017_11_28, 20 244條序列),胰酶消化,母離子質(zhì)量誤差值為15 ppm(15×10-6),漏切位點最大值設置為2;蛋白質(zhì)和肽段鑒定假陽性率(FDR)小于1%,蛋白質(zhì)鑒定標準為至少檢測到兩個特征肽段。

MaxQuant(版本1.6.7.0)搜庫:數(shù)據(jù)庫、消化酶、漏切位點最大值、固定修飾、可變修飾等參數(shù)與PD搜庫的設置相同。母離子質(zhì)量誤差值設置為20 ppm(20×10-6),主要搜索肽段誤差值為4.5 ppm(4.5×10-6)。蛋白質(zhì)鑒定標準為至少檢測到兩個特征肽段,且肽段長度大于或等于7個氨基酸,設置蛋白質(zhì)及二級譜圖數(shù)量(peptide-spectrum matches, PSM)的假陽性率為0.01。用Perseus軟件進行數(shù)據(jù)分析[13],篩選肽段及位點等,篩選出符合要求的總蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白質(zhì)、總肽段和磷酸化肽段以及磷酸化位點(位置可能性>0.75)。

免標記定量蛋白質(zhì)組學分析以四分位法對iBAQ(intensity-based absolute quantification)值進行歸一化。針對磷酸化位點的定量分析,我們首先以在一組中至少有兩個以上強度值不為零的標準篩選磷酸化位點,用t-test檢驗法計算p值。然后,篩選有顯著差異的(p-value<0.05)磷酸化位點,并計算它們的上下調(diào)倍數(shù)(fold change, FC)。若FC≥1.5或≤0.66且p-value<0.05,即為顯著上調(diào)或下調(diào)的磷酸化位點。

對蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組進行生物學分析,利用GO(Gene Ontology)分析、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析等探索蛋白質(zhì)功能。對定量數(shù)據(jù)進行IPA(Ingenuity Pathway Analysis, Qiagen)途徑分析,包括經(jīng)典通路、疾病和生物學功能分析等,并對磷酸化蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組進行比較分析。

表 1 Ti4+-IMAC-S通過SPE和振蕩法富集磷酸化肽段的特異性

表 2 Ti4+-IMAC-S和Ti4+-IMAC-L富集95C細胞磷酸化肽段的特異性

2 結(jié)果與討論

2.1 Ti4+-IMAC-S通過SPE和振蕩法富集模式磷酸化肽段的特異性比較

為優(yōu)化富集方法,采用模式磷酸化肽段比較了SPE[8]和振蕩法對Ti4+-IMAC-S富集效果的影響。分別選取200 μg和400 μg為肽段的富集起始量,在相同條件下酶解模式磷酸化肽段。然后利用SPE和振蕩法對相同起始量的肽段進行磷酸化肽的富集,PD的搜庫結(jié)果表明,與SPE相比,振蕩法可以富集到更多的磷酸化肽段(見表1)。

在富集效率方面,振蕩法和SPE相差不大。SPE可用于樣品量較大的研究[12]。同時發(fā)現(xiàn),樣品起始用量越大,所檢測到的磷酸化肽段數(shù)就越多。在起始蛋白質(zhì)用量為200 μg和400 μg的條件下,振蕩法中材料與肽段的振蕩混合時間為30 min,接觸時間較長,磷酸化肽段被材料吸附的概率增大,因此Ti4+-IMAC-S用振蕩法富集到的磷酸化肽段較多。

2.2 Ti4+-IMAC-S與Ti4+-IMAC-L在95C細胞磷酸化肽段富集中的比較分析

用振蕩法,尺寸不同的Ti4+-IMAC-S和Ti4+-IMAC-L分別對95C細胞磷酸化肽段進行富集。Ti4+-IMAC-L在溶液中較分散,無法通過振蕩后離心的方法使固液分離,因此采用SPE進行磷酸化肽段的富集[12]。磷酸肽的分析結(jié)果(PD搜庫)如表2所示,與Ti4+-IMAC-L相比,Ti4+-IMAC-S富集到的磷酸化肽段的數(shù)量更多,特異性更高。

2.3 不同轉(zhuǎn)移能力肺細胞蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的比較分析

為探究細胞蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組之間的聯(lián)系,我們進行了MRC5、95C和95D的細胞蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組分析?；谏鲜龇椒▋?yōu)化結(jié)果,我們選用Ti4+-IMAC-S(振蕩法)進行了細胞的磷酸化肽段富集。取相同質(zhì)量肽段樣品進行LC-MS/MS分析(3次技術重復),實驗結(jié)果采用Maxquant軟件進行分析。

2.3.1肺細胞蛋白質(zhì)組定量分析

圖1a為MRC5、95C和95D細胞系全蛋白質(zhì)組的韋恩圖,3種細胞系的3次技術重復中共鑒定到1 262種蛋白質(zhì),3種細胞系全蛋白質(zhì)數(shù)目較為接近,分別鑒定到992、1 102、1 182種蛋白質(zhì),其中共有的蛋白質(zhì)達到840種,占所有檢測到蛋白質(zhì)的66.6%。

圖 1 MRC5、95C和95D細胞系(a)全蛋白質(zhì)和 (b)磷酸化蛋白質(zhì)的韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of (a) proteins and (b) phospho- proteins among MRC5, 95C, and 95D

與正常肺細胞MRC5相比,95C中有325個蛋白質(zhì)上調(diào),292個蛋白質(zhì)下調(diào)(見圖2a)。與MRC5相比,95C和95D中上調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)目依次增加,細胞活性增強,轉(zhuǎn)移能力和增殖能力也隨之越強。

表 3 磷酸化蛋白質(zhì)位點數(shù)頻數(shù)表

2.3.2肺細胞磷酸化蛋白質(zhì)組定量分析

與全蛋白質(zhì)相比,3種細胞系共有的磷酸化蛋白質(zhì)種類比例顯著下降。如圖1b所示,MRC5、95C和95D細胞系分別富集到510、863和1 108種磷酸化蛋白質(zhì),只有317種磷酸化蛋白質(zhì)是3種細胞系共有的,僅占25.0%。3種細胞系中較大差異的磷酸化蛋白質(zhì)能夠反映細胞的更多動態(tài)信息,為研究細胞轉(zhuǎn)移等特征提供了依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn),高轉(zhuǎn)移的肺癌細胞有更多的蛋白質(zhì)發(fā)生了磷酸化修飾,并且蛋白質(zhì)上的磷酸化位點也更多(見表3)。95D中含有7到11個磷酸化位點、13到15個磷酸化位點的磷酸化蛋白質(zhì)數(shù)量比95C和MRC5明顯增多。

圖 2 MRC5、95C和95D細胞差異表達的(a)蛋白質(zhì)和 (b)磷酸化位點Fig. 2 Dysregulated (a) proteins and (b) phospho- sites in MRC5, 95C, and 95D

3種細胞系中共檢測到7 560個磷酸化位點,其中定量到1 983個磷酸化位點。顯著變化的磷酸化位點的數(shù)量如圖2b所示,肺癌細胞比正常肺細胞磷酸化位點多,其中高轉(zhuǎn)移能力肺癌細胞95D的磷酸化位點數(shù)最多。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是控制細胞代謝的調(diào)節(jié)方式,由于MRC5細胞為肺成纖維細胞,而95C和95D分別為低轉(zhuǎn)移肺癌細胞和高轉(zhuǎn)移肺癌細胞,因此這些結(jié)果表明,癌細胞較正常細胞代謝旺盛,分裂能力更強。雖然3種細胞的蛋白質(zhì)種類及含量差異較小,但由于蛋白質(zhì)的磷酸化水平發(fā)生變化,因此起調(diào)節(jié)作用和信號轉(zhuǎn)導功能的磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸化位點差異較大,說明蛋白質(zhì)磷酸化可能在癌癥轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。

對3種細胞系中富集到的磷酸化肽段及磷酸化位點進行分析發(fā)現(xiàn),三磷酸化肽段(3-P)在95D中數(shù)量最多,占比最高(見圖3a)。圖3b顯示了絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上磷酸化的數(shù)量及比例,結(jié)果表明,絲氨酸磷酸化在轉(zhuǎn)移能力越高的細胞中含量略有升高。

2.3.3磷酸化蛋白質(zhì)組的生物信息學分析

對1 130個異常表達的磷酸化位點所對應的磷酸化蛋白質(zhì)進行GO分析(見表4)。結(jié)果表明,這些差異磷酸化蛋白質(zhì)參與的生物學過程集中在代謝和RNA加工相關的過程,所屬的細胞成分主要集中在細胞核,具有的分子功能表現(xiàn)為與蛋白質(zhì)、核酸均有結(jié)合。

磷酸化位點定量分析得到了73個在MRC5、95C、95D中依次上調(diào)的磷酸化位點,對這些磷酸化位點對應的磷酸化蛋白質(zhì)進行GO分析,有助于探究這些在轉(zhuǎn)移能力較強的肺細胞中上調(diào)的磷酸化位點與細胞轉(zhuǎn)移和癌變的關系。分析結(jié)果表明,在假陽性率最低的前10個生物學過程中,與細胞正調(diào)控有關的過程有4個,與細胞周期、有絲分裂有關的過程有3個。與所有異常表達的1 130個磷酸化位點所對應的RNA有關的生物過程不同,這些磷酸化蛋白質(zhì)偏向于與細胞癌變有關;對于細胞成分而言,大多數(shù)磷酸化蛋白質(zhì)都集中在細胞核部分,與蛋白質(zhì)組相同;分子功能分析中,與激酶結(jié)合的占3個,置信度較高,且與DNA結(jié)合置信度及位點所對應的蛋白質(zhì)所占比例均較大。因為MRC5、95C、95D依次上調(diào)的磷酸化位點所對應的蛋白質(zhì)主要參與了細胞分裂周期的調(diào)節(jié)及DNA的結(jié)合,所以對磷酸化位點進行定量分析是研究細胞轉(zhuǎn)移及癌變過程的一個重要切入點,可以為后續(xù)機理或生物標志物研究奠定基礎,為癌癥等疾病診斷提供依據(jù)。

圖 3 (a)單、多磷酸化肽段和(b)磷酸化位點的數(shù)量及比例Fig. 3 Numbers and ratios of (a) mono- and multi-phosphopeptides and (b) different phosphosites1-P: singly phosphorylation; 2-P: doubly phosphorylation; 3-P: triply phosphorylation.

表 4 異常表達磷酸化位點對應磷酸化蛋白質(zhì)的GO分析

表 5 全蛋白質(zhì)組顯著調(diào)節(jié)的激酶相關蛋白質(zhì)

2.3.4激酶及其磷酸化位點分析

全蛋白質(zhì)組中激酶表達情況與磷酸化蛋白質(zhì)組有一定關聯(lián),全蛋白質(zhì)組共鑒定到43種激酶,其中28種激酶在3種細胞中有顯著變化,如表5所示。

其中,6種激酶在磷酸化肽富集之后的位點分析中同樣出現(xiàn)顯著性變化(粗體顯示),分別是ATP依賴6磷酸果糖激酶(PFKAP)、C-Jun-氨基末端激酶相互作用蛋白4(JIP4)、T淋巴細胞活化的殺傷細胞來源蛋白激酶(TOPK)、富含肉豆蔻堿的C激酶底物(MARCKS)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(DCLK1)和S期激酶相關蛋白1(SKP1),其磷酸化位點上下調(diào)的倍數(shù)顯示在蛋白質(zhì)的倍數(shù)下方(斜體加粗)。對于這28個差異激酶,經(jīng)文獻檢索,選取其中8個分析其典型激酶調(diào)節(jié)特征。

1. 腺苷酸激酶(KAD):是催化腺嘌呤核苷酸(AMP/ADP/ATP)相互轉(zhuǎn)化的磷酸轉(zhuǎn)移酶,在維持細胞能量平衡中起重要作用,在95C和95D細胞中依次呈現(xiàn)過表達趨勢。研究[14]發(fā)現(xiàn),KAD2在肺腺癌患者肺癌組織中過表達,且KAD2的下調(diào)可抑制人肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲,誘導細胞凋亡和自噬。

2. 激酶A錨定蛋白12(AKA12):僅在95C和95D細胞中被檢測到,在MRC5細胞中未鑒定到。研究[15]發(fā)現(xiàn),AKA12是介導蛋白激酶A和蛋白激酶C亞細胞分區(qū)的錨定蛋白質(zhì),與細胞內(nèi)β腎上腺素受體信號調(diào)節(jié)相關。

3. PFKAP:與糖酵解相關[16],在癌細胞中高表達。值得注意的是,該酶的磷酸化水平在癌細胞中也顯著升高,說明PFKAP在癌細胞中代謝活力強。

4. 肌酸激酶(KCRB):能夠可逆催化ATP的合成,在能量需求大的細胞中高表達,也有大量研究表明KCRB為潛在腫瘤標志物[17]。

5. JIP4:又叫人肺致癌基因6蛋白,C-Jun是原癌基因,在多種癌癥中表達顯著增強[18],在本文實驗數(shù)據(jù)中,JIP4及其磷酸化位點(T586)在癌細胞中表達增強。

6. TOPK:在癌細胞中高表達,研究[19]表明TOPK在白血病和骨髓瘤等高增殖腫瘤中過表達,在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關鍵作用。

7. MARCKS及其磷酸化:在癌細胞中高表達,研究[20]發(fā)現(xiàn)MARCKS可以調(diào)節(jié)膽道癌細胞的轉(zhuǎn)移。

8. SKP1:研究[21]發(fā)現(xiàn),其在56.3%的非小細胞肺癌中過表達,且預后不良時其表達升高;在95D細胞中高表達,磷酸化水平顯著提高,現(xiàn)象與文獻[21]一致。

我們鑒定到的異常表達的激酶中大部分已被證實與細胞癌變及轉(zhuǎn)移密切相關,另有部分異常表達的激酶尚未見報道,可作候選蛋白質(zhì),驗證其成為生物標志物的可能性。因此,全蛋白質(zhì)水平的激酶調(diào)節(jié)對癌癥進展和后續(xù)磷酸化蛋白質(zhì)組的研究都具有重要意義。

2.3.5蛋白質(zhì)組與磷酸化蛋白質(zhì)組對比分析

將顯著變化的蛋白質(zhì)與磷酸化蛋白質(zhì)進行了IPA分析。在疾病和生物功能方面,蛋白質(zhì)組顯示了與DNA、細胞周期有關的上調(diào),而與RNA、細胞死亡有關的下調(diào),并且肺癌進展有關的蛋白質(zhì)上調(diào)。磷酸化蛋白質(zhì)組顯示了與死亡相關、細胞生長相關的蛋白質(zhì)下調(diào),遷移侵襲、DNA修復有關的蛋白質(zhì)上調(diào)。磷酸化蛋白質(zhì)組的對比分析發(fā)現(xiàn),95D/95C、95C/MRC5、95D/MRC5有相同的變化趨勢,即MRC5、95C、95D依次上調(diào)或下調(diào),且與細胞增殖和轉(zhuǎn)移有關的磷酸化蛋白質(zhì)上調(diào)。與蛋白質(zhì)組相比,磷酸化蛋白質(zhì)組更能反映細胞的轉(zhuǎn)移能力的差異。

本研究鑒定到的Histone H1.5(H15)、真核翻譯起始因子4B(IF4B)、富含十四烷基的富含丙氨酸的C激酶底物(MARCS)和神經(jīng)母細胞分化相關蛋白(AHNAK)等蛋白質(zhì)的磷酸化位點表達量變化也與肺癌進展正相關[22],提示其在肺癌轉(zhuǎn)移中的潛在功能。

3 結(jié)論

與大尺寸的Ti4+-IMAC-L相比,Ti4+-IMAC-S在富集磷酸化肽段的數(shù)量和特異性上更優(yōu)。與SPE相比,振蕩法由于樣品與Ti4+-IMAC-S材料接觸的時間較長,富集到的磷酸化肽段數(shù)量更多。將Ti4+-IMAC-S的振蕩法應用于不同轉(zhuǎn)移能力的肺細胞磷酸化蛋白質(zhì)組學研究中發(fā)現(xiàn),3種細胞系的全蛋白質(zhì)水平差異較小,而磷酸化蛋白質(zhì)水平差異較大。隨著細胞轉(zhuǎn)移能力的增加,蛋白磷酸化水平也顯著增加。其中95C和95D上調(diào)的磷酸化位點對應的蛋白質(zhì)與細胞周期、細胞增殖顯著相關。一些異常表達的激酶及其磷酸化程度與細胞的惡性增殖有關。異常表達的磷酸化蛋白質(zhì)主要與細胞侵襲、遷移和死亡等細胞遷移方面的功能有關,后續(xù)研究可對這些異常表達的磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸化位點進行肺癌轉(zhuǎn)移等功能的驗證。本研究充分說明基于Ti4+-IMAC的親和色譜技術是開展癌癥轉(zhuǎn)移相關研究的強有力工具。