鄭鑫彤, 王 雪, 張福生, 張旭陽(yáng), 趙艷艷, 卿光焱*

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧 大連 116044; 2. 中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023)

自從人類基因組計(jì)劃完成后,基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)、酶組學(xué)、代謝組學(xué)等[1-4]各種形式的“組學(xué)”研究逐漸蓬勃發(fā)展起來(lái)。蛋白質(zhì)組學(xué)從整體的角度分析生物體細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)組成,以及表達(dá)水平與翻譯后修飾狀態(tài),進(jìn)而了解蛋白質(zhì)功能與生命體活動(dòng)之間的規(guī)律;其中翻譯后修飾使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,功能更為完善,調(diào)節(jié)更為精細(xì),作用更為專一。蛋白質(zhì)翻譯后修飾是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,目前在真核生物中有多達(dá)300多種的修飾種類[5],蛋白質(zhì)的磷酸化和糖基化是最基礎(chǔ)、最普遍,也是最重要的翻譯后修飾方式,在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答和細(xì)胞分化等方面起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[6]。同時(shí)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與異常的蛋白糖基化和磷酸化關(guān)系密切[7,8],其具有十分重要的生物學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

然而,在復(fù)雜的生物樣品體系中,磷酸化蛋白和糖蛋白的含量極其微量,并且翻譯后修飾動(dòng)態(tài)可變性大;此外,糖肽、磷酸化肽在質(zhì)譜中離子化效率低,存在強(qiáng)烈的背景干擾等問(wèn)題,因而很難用質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行直接分析,因此迫切需要對(duì)樣品進(jìn)行高效的分離和富集,才能獲得較高選擇性和較廣類型覆蓋范圍的磷酸化肽和糖肽。糖肽的富集方法主要包括凝集素親和色譜法[9]、肼化學(xué)法[10]、苯硼酸親和色譜法[11]、親水色譜法[12]等。磷酸化肽的富集方法主要有固定金屬離子親和色譜法[13]和金屬氧化物親和色譜法[14]等,而這些傳統(tǒng)的分離方法部分解決了糖肽和磷酸化肽富集的難題,但是也有一些不可避免的問(wèn)題,例如基于金屬離子對(duì)多磷酸化肽的結(jié)合力過(guò)大,導(dǎo)致其難以洗脫和被質(zhì)譜鑒定。此外,材料對(duì)糖肽的捕獲效率不足,目前被鑒定出的糖肽大多為唾液酸型,大量的中性糖、O-糖肽難以被富集和鑒定。

智能聚合物基材料是一類新涌現(xiàn)的材料,基于自身的智能屬性,即其物理和化學(xué)性質(zhì)(例如高分子構(gòu)象、表面形貌、浸潤(rùn)性、黏彈性、吸附性能等)對(duì)溫度、pH值、溶劑、光、電場(chǎng)或生物分子等外界刺激,具有靈敏、快速、顯著和可逆的響應(yīng)性,已被廣泛應(yīng)用于納米材料、生物、醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域[15-17]。借助聚合物鏈可控的構(gòu)象轉(zhuǎn)變及由此產(chǎn)生的開(kāi)-關(guān)效應(yīng),智能聚合物基材料在可控藥物遞送和釋放、組織工程等方面展現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景,但其在分離分析領(lǐng)域的潛力還未引起人們足夠的關(guān)注。新型材料設(shè)計(jì)理念的引入,有可能開(kāi)發(fā)出對(duì)生物、醫(yī)藥和環(huán)境中特殊生物分子靈敏和高效的分離技術(shù)與檢測(cè)方法。對(duì)于翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)而言,更需要融入先進(jìn)的方法和技術(shù),以顯著提升富集的效率和對(duì)修飾肽鏈的覆蓋率,從而彌補(bǔ)現(xiàn)有富集材料在富集效率和覆蓋率方面的不足。近年來(lái),智能聚合物基材料在磷酸化肽和糖肽分離及富集領(lǐng)域取得了一些進(jìn)展(見(jiàn)表1),為此我們撰寫本篇綜述,總結(jié)智能材料在該領(lǐng)域中的應(yīng)用現(xiàn)狀,分析其優(yōu)勢(shì)、問(wèn)題,以迎接未來(lái)的挑戰(zhàn)。

1 智能聚合物基磷酸化肽富集材料

蛋白質(zhì)磷酸化是指蛋白質(zhì)分子中的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基在蛋白激酶的作用下,從三磷酸腺苷(ATP)分子上獲取磷酸基團(tuán)而發(fā)生磷酸化的過(guò)程。磷酸化是大自然中最廣泛的翻譯后修飾形式,據(jù)統(tǒng)計(jì),在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,30%以上的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生不同程度的磷酸化。同時(shí),蛋白質(zhì)磷酸化又是一個(gè)可逆過(guò)程,在磷酸酯酶的作用下,磷酸化的氨基酸殘基又可以發(fā)生去磷酸化過(guò)程。蛋白質(zhì)磷酸化盡管修飾形式和基團(tuán)較為簡(jiǎn)單,但是卻在生命活動(dòng)中扮演著極為重要的角色,例如調(diào)節(jié)大量細(xì)胞活動(dòng)如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、分化和代謝等[29-32]。此外,在病理意義上,異常磷酸化更是與許多人類疾病密切相關(guān),如阿爾茨海默病(AD)[33]和癌癥。阿爾茨海默病的病理特征之一就是因微管結(jié)合蛋白Tau的異常蛋白質(zhì)磷酸化所產(chǎn)生的神經(jīng)原纖維纏結(jié),尤其在多點(diǎn)磷酸化微管蛋白結(jié)合區(qū)域,可以累積成不溶性配對(duì)螺旋細(xì)絲,產(chǎn)生許多神經(jīng)原纖維纏結(jié)。然而,值得注意的是磷酸化肽的天然豐度很低,離子化效率也較低,同時(shí)樣品中還存在著大量具有強(qiáng)烈背景干擾的高豐度非修飾肽段[34,35]。因此,在進(jìn)行質(zhì)譜分析前,首要任務(wù)是從復(fù)雜的生物樣品中高效專一地選擇性富集目標(biāo)分析物,提高質(zhì)譜分析樣品中磷酸化肽的濃度,并消除樣品基質(zhì)中非修飾肽、鹽等各類干擾成分。

表 1 用于富集翻譯后修飾產(chǎn)物的代表性智能聚合物基材料

多位點(diǎn)磷酸化是細(xì)胞中最重要且常見(jiàn)的修飾方式。然而由于富集材料的限制,從復(fù)雜的生物樣品中捕獲低豐度多磷酸化肽的難度很大,因此對(duì)于多磷酸化肽的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于單磷酸化肽。這主要是因?yàn)榛诙嘀亟饘衮系闹髁鞣椒ǔ杀兜卦黾恿嘶|(zhì)金屬與多磷酸化肽的親和力,然而這種螯合作用過(guò)于強(qiáng)烈,不易調(diào)控,使得結(jié)合的多磷酸化肽難以從材料表面解離下來(lái)。除了洗脫難題,大多數(shù)富集材料對(duì)酸性干擾肽也存在嚴(yán)重的非特異性吸附,大大降低了材料的富集選擇性。Qing等[18]針對(duì)上述多磷酸化肽的選擇性富集難題設(shè)計(jì)了一種基于氫鍵的智能共聚物。該共聚物包含一個(gè)高效的磷酸識(shí)別單體-對(duì)羧基苯基硫脲(ATBA),以及一個(gè)柔性聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)網(wǎng)絡(luò),他們將該聚合物與多孔硅膠基質(zhì)進(jìn)行復(fù)合,制備了一種新型的多磷酸化肽富集材料。該材料的特點(diǎn)包括材料與磷酸化肽通過(guò)動(dòng)態(tài)可逆的多重氫鍵進(jìn)行結(jié)合;對(duì)多磷酸化肽高度可控的吸附行為可以通過(guò)溶劑極性、pH和溫度等環(huán)境參數(shù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控;對(duì)磷酸化肽具有超高的吸附容量和富集回收率;對(duì)稀有的酪氨酸磷酸化肽展現(xiàn)出獨(dú)特的親和力。正是基于上述特點(diǎn),該材料成功地從人宮頸癌細(xì)胞裂解液中富集得到了1 257條磷酸化肽(其中71%為多磷酸化肽),并且通過(guò)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)了大量之前從未被報(bào)道的磷酸化新位點(diǎn)。在這些新位點(diǎn)中,稀有的蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)的比例明顯提高。智能聚合物基材料這一優(yōu)異的富集效果,揭示了其在多磷酸化肽富集中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),為豐富和推進(jìn)磷酸化蛋白組學(xué)研究提供了一種新型、強(qiáng)有力的富集工具。

圖 1 智能聚合物基材料對(duì)多磷酸化肽和唾液酸型糖肽的可控吸附和脫附行為[19]Fig. 1 Controllable adsorption and desorption behaviors of smart polymer-based materials toward both multiple phosphorylated peptides and sialylated glycopeptides[19]Man: mannose; GlcNAc: N-acetyl-glucosamine; Gal: galactose; Neu5Ac: N-acetylneuraminic acid.

基于相似的策略,Lu等[19]進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了對(duì)磷酸化肽和唾液酸糖肽具有同步富集能力的智能聚合物基材料。他們發(fā)現(xiàn)對(duì)羧基苯基硫脲功能單體既可以通過(guò)氫鍵作用實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化位點(diǎn)的精確識(shí)別,也可以選擇性地結(jié)合唾液酸。聚合物鏈初始時(shí)處于緊縮的狀態(tài),在結(jié)合多磷酸化肽或唾液酸糖肽之后發(fā)生了從緊縮向完全舒張的轉(zhuǎn)變,顯著提升了對(duì)磷酸化肽和唾液酸糖肽這些肽鏈的吸附(見(jiàn)圖1)。進(jìn)一步提高溶液的酸性后,強(qiáng)質(zhì)子的環(huán)境破壞了硫脲單元與磷酸化位點(diǎn)或唾液酸化位點(diǎn)之間的氫鍵作用,使得捕獲的多磷酸化肽、唾液酸糖肽又從材料表面解離下來(lái)。該智能共聚物具有很高的唾液酸糖肽吸附容量(370 mg/g)和高回收率,以及高的富集選擇性,可以從50 μg人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞裂解液中富集得到糖肽和磷酸化肽的占比為79%,從631個(gè)磷酸化肽中產(chǎn)生721個(gè)獨(dú)特的磷酸化位點(diǎn),從120個(gè)糖肽中產(chǎn)生125個(gè)獨(dú)特的糖基化位點(diǎn),這將為翻譯后修飾富集材料的開(kāi)發(fā)開(kāi)辟出一條新途徑。

表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合技術(shù)由于接枝密度高、聚合物鏈長(zhǎng)度可控等優(yōu)勢(shì),被廣泛用于在不同的基底接枝不同的聚合物。Qin等[36]利用這種技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種新型的毛細(xì)管柱,并成功地將其與LC-MS系統(tǒng)聯(lián)合,應(yīng)用于自動(dòng)在線磷酸化肽的富集和鑒定。這種聚合技術(shù)開(kāi)發(fā)的新型毛細(xì)管柱從HepG2細(xì)胞裂解液中鑒定出475條磷酸化肽以及662個(gè)磷酸化位點(diǎn),遠(yuǎn)高于利用TiO2在線富集的39條磷酸化肽。更重要的是,這種聚合技術(shù)可以與各種功能化單體有效兼容,并且不需要嚴(yán)苛的實(shí)驗(yàn)條件,這為富集材料的開(kāi)發(fā)提供了一種新思路。

2018年,Luo等[20]通過(guò)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合技術(shù)合成Fe3O4/聚多巴胺/聚(2-氨基乙基甲基丙烯酸酯鹽酸鹽)-精氨酸(Fe3O4/PDA/PAMA-Arg)納米復(fù)合微球。核心的PAMA-Arg聚合物刷代替了傳統(tǒng)的金屬離子螯合體系,有效避免了材料在上樣和洗脫過(guò)程中金屬離子的流失。同時(shí)聚合物刷舒展的三維空間結(jié)構(gòu),顯著促進(jìn)了精氨酸胍基與磷酸化肽間的相互作用,實(shí)現(xiàn)了對(duì)磷酸化肽的高效富集。此外,Fe3O4良好的磁性能簡(jiǎn)化了分離過(guò)程,避免了煩瑣的離心操作,有助于磷酸化肽活性的保持。通過(guò)簡(jiǎn)單的緩沖梯度調(diào)節(jié),納米微球可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單、多磷酸化肽的選擇性富集。此材料不僅可以從標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物、脫脂牛奶和大鼠腦脊液中選擇性富集磷酸化肽,還可以從模型蛋白質(zhì)混合物、脫脂牛奶和蛋清中特異性捕獲磷酸化蛋白質(zhì)。該研究工作進(jìn)一步表明,借助多重氫鍵相互作用,結(jié)合聚合物鏈上豐富的結(jié)合位點(diǎn),可以實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽的選擇性富集。由于該Fe3O4/PDA/PAMA-Arg納米復(fù)合微球材料特異性不高,因此為了增強(qiáng)材料對(duì)目標(biāo)磷酸化肽富集的特異性,Xiong等[21]制備了一種新的親和材料,在聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)修飾的Fe3O4微球上引入胍基,通過(guò)簡(jiǎn)單調(diào)節(jié)上樣溶液成分,可以對(duì)全部磷酸化肽或僅對(duì)多磷酸化肽具有選擇性富集能力。該復(fù)合材料吸附容量大(200 mg/g),檢測(cè)靈敏度高(0.5 fmol),富集回收率高(91.30%),特異性強(qiáng),有利于低豐度磷酸化肽的檢測(cè)和鑒定。這種材料可以通過(guò)簡(jiǎn)單的調(diào)節(jié)溶劑梯度選擇性富集單、多磷酸化肽,為開(kāi)發(fā)新型的富集材料提供了新思路。

分子印跡聚合物(MIPs)因其穩(wěn)定性高、制備簡(jiǎn)單、可特異性識(shí)別、可重復(fù)使用等優(yōu)勢(shì)被越來(lái)越多地用作富集材料。Emgenbroich等[37]采用表位印跡法設(shè)計(jì)了一種針對(duì)酪氨酸磷酸化肽的選擇性印跡聚合物受體,對(duì)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)表現(xiàn)出良好的親和力,明顯更易識(shí)別酪氨酸磷酸化肽而非絲氨酸磷酸化肽。與抗體進(jìn)一步對(duì)比,印跡聚合物能夠捕獲酪氨酸磷酸化肽遠(yuǎn)多于非磷酸化肽和絲氨酸磷酸化肽。Stefan等[38]利用尿素單體與模板分子Fmoc-pTyrOEt,以物質(zhì)的量比為2∶1的條件,制備了一種非印跡聚合物(NIP),該聚合物與印跡聚合物完全相同,但省略了模板。該聚合物每個(gè)尿素基團(tuán)都能與磷酸根離子產(chǎn)生氫鍵,從而與pTyr側(cè)鏈的結(jié)合位點(diǎn)緊密連接,結(jié)果顯示該聚合物對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量較低的酪氨酸磷酸化肽表現(xiàn)出很強(qiáng)的親和力。

在此基礎(chǔ)上,Xia和Yang[22]采用表位印跡法[39]合成了一種溫敏性分子印跡聚合物(TMIPs),其制備過(guò)程見(jiàn)圖2。由于采用了苯基磷酸作為模板,所制備的TMIPs對(duì)靶標(biāo)的酪氨酸磷酸化肽具有較強(qiáng)的識(shí)別能力和選擇性。當(dāng)溫度為28 ℃時(shí),聚合物空腔尺寸正好匹配苯基磷酸位點(diǎn),TMIPs對(duì)混合肽樣品中的酪氨酸磷酸化肽展現(xiàn)出選擇性吸附行為,而對(duì)非修飾肽段或者絲氨酸、蘇氨酸磷酸化肽的吸附能力很弱。當(dāng)溫度提升至28 ℃以上時(shí),聚合物發(fā)生明顯收縮,導(dǎo)致印跡空腔尺寸顯著降低,從而將捕獲的酪氨酸磷酸化肽釋放出來(lái),便于質(zhì)譜鑒定。經(jīng)過(guò)4次再結(jié)合循環(huán)后,材料仍保持對(duì)酪氨酸磷酸化肽78.9%的吸附效率。該材料同時(shí)兼顧了分子印跡聚合物優(yōu)異的靶向性,以及溫敏型聚合物的溫度響應(yīng)性,為開(kāi)發(fā)其他類型的翻譯后修飾富集材料提供了有益的啟示。

圖 2 溫敏型分子印跡聚合物的合成和工作模式圖[22]Fig. 2 Synthesis of thermo-sensitive molecular printing polymer and working principle of the material[22] Red, green, yellow, and blue balls represent tyrosine, serine, threonine phosphorylation sites, and unmodified amino acids, respectively. PPA: phenylphosphonic acid; NIPAm: N-isopropylacrylamide; MBA: N,N-methylenebisacrylamide; LCST: lower critical solution temperature; T: temperature.

2 智能聚合物基糖肽富集材料

蛋白糖基化與受體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凝血、免疫反應(yīng)、細(xì)胞死亡和發(fā)育等多種生物學(xué)活動(dòng)密切相關(guān),是最復(fù)雜、最關(guān)鍵的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。糖蛋白組學(xué)因其在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)上的重要意義,受到越來(lái)越多的關(guān)注[40]。充分的證據(jù)表明,癌癥等重大疾病的發(fā)生與蛋白糖基異常相關(guān),目前臨床上使用的腫瘤生物標(biāo)志物大多是糖蛋白[41]。傳統(tǒng)的糖肽富集材料大部分是基于單分子層的材料,它們與糖肽之間的親和力受到其接枝密度極大的限制,因此將糖肽富集材料從二維的單層擴(kuò)展到三維的聚合物將有助于特異性富集能力的大幅提升。

2015年,Qian等[23]制備了一種基于智能聚合物的糖肽富集材料。在弱酸性條件下,這種pH敏感型的聚丙烯酸-co-酰肼能夠在水中溶解分散,與蛋白質(zhì)或肽段發(fā)生充分接觸,均相的作用環(huán)境促進(jìn)了材料對(duì)痕量糖肽的捕獲(見(jiàn)圖3a)。在溶液的pH值降至2.0的條件下,該聚合物迅速自組裝成多個(gè)大顆粒團(tuán)聚體,并從溶液中析出,借助快速固液分離,實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)糖肽與干擾物的有效脫離。聚合物從均質(zhì)到非均質(zhì)狀態(tài)的快速轉(zhuǎn)化,在1 h內(nèi)達(dá)到95%的轉(zhuǎn)化率,比使用傳統(tǒng)固體/不溶性瓊脂糖珠的轉(zhuǎn)化率快了8倍(見(jiàn)圖3b)。這種pH敏感型的富集材料從小鼠大腦裂解液中共富集出了458個(gè)N-糖蛋白以及1 317個(gè)N-連接糖肽,進(jìn)一步驗(yàn)證了該材料在富集實(shí)際樣品中糖蛋白和糖肽的可行性。此外,與3種主流富集材料相比,聚丙烯酸-酰肼材料對(duì)富集到的唾液酸化糖肽表現(xiàn)出更強(qiáng)的信號(hào)敏感性(見(jiàn)圖3c)。

2017年,Qian等[24]還設(shè)計(jì)了一種聚異丙基丙烯酰胺溫敏型聚合物,同時(shí)偶聯(lián)了三苯基膦試劑(見(jiàn)圖4a),用于從復(fù)雜生物樣品中捕獲疊氮標(biāo)記的O-GlcNAc糖蛋白。該聚合物在水中溶解性良好,界面?zhèn)髻|(zhì)阻力低,空間位阻小,有利于均相反應(yīng)的發(fā)生。該聚合物通過(guò)Staudinger反應(yīng)促進(jìn)負(fù)載的三苯基膦與疊氮標(biāo)記的O-GlcNAc蛋白之間實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)(見(jiàn)圖4b)。同時(shí),可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液溫度,使得聚合物從溶解狀態(tài)到完全析出,實(shí)現(xiàn)從溶液中快速回收聚合物與O-GlcNAc蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物。利用這種新型的固定化三芳基膦試劑,研究人員從HeLa細(xì)胞裂解液中通過(guò)質(zhì)譜鑒定到超過(guò)1 700個(gè)潛在的O-GlcNAc型糖蛋白。

圖 4 基于可溶性和熱敏性PNIPAM-三芳基膦均相富集O-GlcNAc蛋白的策略[24]Fig. 4 Liquid phase homogenous enrichment strategy of O-GlcNAc protein using highly soluble and thermo-sensitive PNIPAM-triarylphosphine[24] a. working principle of the highly soluble and thermo-sensitive PNIPAM-triarylphosphine[24]; b. synthesis of the highly soluble and thermo-sensitive PNIPAM-triarylphosphine[24].

圖 5 用于選擇性分離卵清糖蛋白的溫敏型聚合物修飾的分子印跡核殼納米微球的制備示意圖[25]Fig. 5 Preparation of molecularly imprinted core-shell nanospheres modified by thermo-sensitive polymer for selective separation of ovalbumin (OB)[25] MMA: methyl methacrylate; p-VPBA: 4-vinylphenylbronic acid; KPS: potassium persulfate; SDS: sodium dodecyl sulfate; NIPAAm: N-isopropylacrylamide; AAm: acrylamide; MBA: N,N-methylenebisacrylamide; TEMED: N,N,N,N-tetramethylenediamine.

借助苯基硼酸(PBA)與含有順式二醇化合物之間存在的可逆硼二酯鍵,PBA材料被廣泛用于堿性緩沖液中富集糖肽。2014年,Li等[41]研制了一種聚PBA修飾的硅膠材料,基于其選擇性和疏水相下的親水作用,實(shí)現(xiàn)了對(duì)糖肽的高選擇性結(jié)合。然而傳統(tǒng)的單層PBA材料不可避免地會(huì)遇到負(fù)載效率低、孵育時(shí)間長(zhǎng)、選擇性差等問(wèn)題。Gao等[25]通過(guò)模板共價(jià)固定和表面印跡,開(kāi)發(fā)了溫敏型分子印跡聚合物微球,用于選擇性分離卵清糖蛋白(OB)。首先合成了聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)-co-PBA納米微球,然后通過(guò)PBA與糖可逆的共價(jià)鍵,將模板分子OB固定在微球表面上。隨后引發(fā)NIPAAm和丙烯酰胺在納米微球表面的聚合,形成均勻的聚合物涂層。在去除OB模板后,得到分子印跡納米微球(見(jiàn)圖5)。利用PBA與OB結(jié)合時(shí)的pH依賴性,該材料對(duì)OB具有高度可控的吸附、脫附行為和良好的選擇性識(shí)別能力,被成功地應(yīng)用于選擇性分離來(lái)自蛋清樣品中的OB。值得指出的是,該印跡納米球在20 min內(nèi)達(dá)到飽和吸附,表明吸附速率快。

糖肽富集的基礎(chǔ)是材料對(duì)靶標(biāo)糖鏈的特異性捕獲和靈敏響應(yīng)。在糖響應(yīng)聚合物的構(gòu)筑方面,Qing和Sun等[42]在2011年設(shè)計(jì)了一種包括識(shí)別單元、介導(dǎo)單元和柔性聚合物主鏈PNIPAM的三組分共聚物聚(N-異丙基丙烯酰胺)-甲基酯化-天門冬氨酸-苯丙氨酸二肽-雙(三氟甲基)改性苯硫脲(PNIPAM-β-MAP-di-TFP)薄膜。初始時(shí),共聚物由于識(shí)別單元MAP和介導(dǎo)單元TFP之間的氫鍵相互作用,使得聚合物鏈?zhǔn)湛s卷曲,薄膜處于超疏水的狀態(tài)。當(dāng)聚合物薄膜浸泡在單糖溶液中時(shí),來(lái)蘇糖分子通過(guò)多重氫鍵作用結(jié)合MAP識(shí)別單元,導(dǎo)致共聚物氫鍵網(wǎng)格的破壞,聚合物鏈發(fā)生了從緊縮向完全舒張的轉(zhuǎn)變,伴隨著薄膜從超疏水向超親水的劇烈變化,從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)來(lái)蘇糖的靈敏響應(yīng)和檢測(cè)。采用類似的策略,該研究組設(shè)計(jì)了一種在聚乙烯基亞胺(PEI)修飾甲基酯化二肽(D-Asp-D-Phe, DF)的智能聚合物基材料薄膜(PEI-g-D-DF)[43]。該聚合物膜由L-核糖溶液處理后,變得更加柔軟;而與D-核糖溶液作用后,變得更加堅(jiān)硬,這一手性效應(yīng)為測(cè)定L/D-核糖的對(duì)映體純度,提供了一種全新方法,在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出的手性色譜柱實(shí)現(xiàn)了對(duì)脫氧核糖對(duì)映異構(gòu)體的手性分離,以及對(duì)多種單糖、二糖和寡糖的高效分離。這些研究工作表明糖響應(yīng)型聚合物在糖分離,糖肽富集等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

圖 6 聚合物材料的篩選及其對(duì)糖肽的富集[26,27]Fig. 6 Screening of polymer materials and enrichment of glycopeptide[26,27] a. highly efficient enrichment of glycopeptides and precise discrimination of glycosylic linkage isomers by Pro-Glu dipeptide based polymeric material, which was screened by orthogonal experiments[26]; b. possible binding model of polyacrylamide-g-allose0.10 with sialic acid through multiple hydrogen bonding interactions[27]; c. influence of grafting ratios of the allose in the polymer for binding with a sialylated glycopeptide[27].

2016年,Qing等[26]建立了一種基于親水指數(shù)的二肽序列篩選策略,從54種二肽中篩選出3種最優(yōu)的二肽序列(見(jiàn)圖6a)。優(yōu)化得到的聚合物材料聚(Pro-Glu)@SiO2在糖肽富集方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能,可以從1∶1 000倍胎球蛋白與牛血清白蛋白酶解液的混合液中,富集鑒定到33個(gè)糖肽信號(hào),對(duì)HeLa細(xì)胞裂解液中糖肽的富集選擇性達(dá)到70%。同時(shí),該二肽聚合物材料對(duì)不同組成、不同聚合度甚至不同連接異構(gòu)體的寡糖、糖鏈均表現(xiàn)出高效的色譜分離。材料將對(duì)糖肽的高選擇性富集與對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)的精細(xì)區(qū)分融為一體,代表了新一代糖肽分離材料發(fā)展的方向。

隨后,該研究組受到糖-糖相互作用的生物啟發(fā),將阿洛糖引入到聚丙烯酰胺鏈中,制備了一種糖響應(yīng)型的聚合物材料[27]。在pH為4的弱酸性條件下,阿洛糖識(shí)別受體可以選擇性地結(jié)合唾液酸(見(jiàn)圖6b);然而阿洛糖單元在聚合物中的比例至關(guān)重要,接枝比例低時(shí),材料對(duì)唾液酸糖肽的吸附能力較弱;而接枝比例過(guò)高時(shí),聚合物鏈又會(huì)因?yàn)殒渻?nèi)的氫鍵相互作用,處于緊縮卷曲的狀態(tài)。當(dāng)阿洛糖引到聚丙烯酰胺鏈的接枝率為0.10時(shí)(見(jiàn)圖6c),聚合物對(duì)唾液酸糖肽表現(xiàn)出最佳的吸附容量(220 mg/g)和較好的富集能力,可以從1∶500倍胎球蛋白與牛血清白蛋白酶解液混合液中,富集鑒定到15個(gè)糖肽信號(hào),同時(shí)從HeLa細(xì)胞裂解液中鑒定得到180個(gè)唾液酸糖基化位點(diǎn)。此外,該聚合物薄膜體現(xiàn)出明顯的疏水性(水接觸角大約80°),改變了人們對(duì)傳統(tǒng)富集材料的認(rèn)識(shí),它們通常具有很高的親水性(水接觸角大約15°)?；陬愃频脑O(shè)計(jì)思想,Li等[44]還開(kāi)發(fā)了其他基于乳糖的聚合物材料,用于唾液酸糖肽富集。

2017年,Qing等[45]將研究從糖鏈末端的唾液酸擴(kuò)展至糖鏈片段,設(shè)計(jì)的基于L-Asp-L-Phe的二肽能夠?qū)ν僖核?、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖(Gal)和甘露糖(Man)產(chǎn)生強(qiáng)烈且有差異性的結(jié)合,正好契合Neu5Ac-Gal-GlcNAc-Man序列的唾液復(fù)合體型聚糖。石英晶體微天平吸附實(shí)驗(yàn)表明,L-Asp-L-Phe二肽接枝的聚乙烯亞胺薄膜,對(duì)模型的唾液酸三糖具有顯著的吸附行為,能夠清晰地區(qū)分它們的連接異構(gòu)體。這些特性有助于利用PEI-g-L-Asp-L-Phe修飾的mSiO2@SiO2@Fe3O4核-殼結(jié)構(gòu)微球,從復(fù)雜的蛋白酶解液中選擇性捕獲到唾液酸糖肽。該研究將有力推動(dòng)糖鏈靶向型分離材料的開(kāi)發(fā),為糖鏈特異性生物材料的開(kāi)發(fā)指明了方向。Liu等[28]用己二酸二肼對(duì)Fe3O4@聚甲基丙烯酸(Fe3O4@PMAA)表面進(jìn)行改性,得到一種肼功能化的核-殼結(jié)構(gòu)磁性微球Fe3O4@PMAH。材料表面豐富的肼基實(shí)現(xiàn)了對(duì)糖肽的高選擇性捕獲,Fe3O4核心優(yōu)異的磁性便于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高通量和自動(dòng)化的樣品處理。此外,親水性聚合物表面可以降低肽鏈的非特異性吸附。與商用化肼樹(shù)脂富集材料相比,Fe3O4@PMAH的富集得到糖肽的信噪比提高了5倍以上。該納米材料在對(duì)結(jié)直腸癌患者血清N-連接糖蛋白的表征中,鑒定出175條糖肽和181個(gè)糖基化位點(diǎn),以及63個(gè)不同的糖蛋白位點(diǎn),富集糖肽和相應(yīng)糖蛋白的選擇性分別為69.6%和80.9%。

多孔聚合物材料同樣也被廣泛應(yīng)用于生物分離,然而傳統(tǒng)的均質(zhì)多孔聚合物材料不能有效地從復(fù)雜樣品中分離出特定的低豐度生物分子。2015年,Jin等[46]提出了一種簡(jiǎn)便的無(wú)模板合成中孔酚醛聚合物的方法,合成的聚合物具有較高的BET比表面積(548 m2/g)和中孔尺寸(13 nm),并顯示出優(yōu)異的糖肽類捕獲性能。用nano LC-MS/MS進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)后,能夠成功地鑒定出169個(gè)獨(dú)特的糖肽和92個(gè)糖蛋白,展現(xiàn)了中孔聚合物在高選擇性糖肽富集方面的潛在應(yīng)用。2018年,Song等[47]報(bào)道了通過(guò)乳液界面聚合法制備具有大小可調(diào)的異質(zhì)結(jié)構(gòu)納米孔的顆粒,用于實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中低豐度糖肽的分離。納米孔內(nèi)的異質(zhì)結(jié)構(gòu)表面,允許生物分子依賴于溶劑的局部吸附到親水或疏水區(qū)域;在疏水區(qū)域去除高豐度疏水蛋白和非修飾肽后,通過(guò)低極性溶劑中納米孔的親水區(qū)域,可以有效地富集到低豐度親水型糖肽。這些具有異質(zhì)結(jié)構(gòu)納米孔的顆粒有望用于核酸、糖類和蛋白質(zhì)的分離及下游的臨床診斷。

3 結(jié)論

智能聚合物基材料能夠動(dòng)態(tài)響應(yīng)外界的各種物理和化學(xué)刺激,發(fā)生劇烈的構(gòu)象變化,從而引起表界面物理化學(xué)性質(zhì)的大幅轉(zhuǎn)變,這為生物分離分析提供了一個(gè)額外的驅(qū)動(dòng)力,能夠大幅提升生物分離分析方法的靈敏性、選擇性和響應(yīng)速率?；诜g后修飾蛋白組的富集材料的開(kāi)發(fā),智能聚合物基材料,特別是生物分子敏感型聚合物,能夠有效解決材料富集選擇性不足、吸附效率低、難以洗脫等難題,有望實(shí)現(xiàn)更廣泛的應(yīng)用,是翻譯后修飾蛋白富集和蛋白前處理的理想材料。

然而一些難題和挑戰(zhàn)有待解決:第一,目前智能聚合物基材料大多面向模型蛋白體系,包括混合有牛血清白蛋白的復(fù)雜樣品、細(xì)胞裂解液,甚至血液等,這些樣品與人體實(shí)際樣本在復(fù)雜性上還有很大的差異性。智能聚合物基材料在復(fù)雜人體環(huán)境中的工作能力還有待觀察和體驗(yàn),這需要分析化學(xué)家與醫(yī)學(xué)臨床科研人員更加緊密地合作,讓分析方法更加貼近實(shí)際需求。第二,分離分析方法對(duì)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性提出了很高要求,對(duì)于同一樣本的不同批次處理,數(shù)據(jù)集之間應(yīng)具有很高的重疊性。為此智能聚合物基材料需要著力提升材料的可逆性,實(shí)現(xiàn)材料高質(zhì)量的可重復(fù)利用,為測(cè)量數(shù)據(jù)的可重復(fù)性提供有力保障。第三,智能材料應(yīng)大力擴(kuò)展應(yīng)用范圍,將研究重心從磷酸化肽、唾液酸糖肽,逐漸擴(kuò)展至其他翻譯后修飾類型,例如O-連接型糖肽、中性糖糖肽、甲基化肽、乙?；?、泛素化肽等,可以預(yù)測(cè)智能聚合物基材料將在翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)中獲得更為廣闊和深入的應(yīng)用。