鐘卉菲, 黃嫣嫣*, 金鈺龍, 趙 睿

(1. 北京分子科學國家研究中心, 中國科學院活體分析化學重點實驗室, 中國科學院分子科學科教融合卓越創(chuàng)新中心, 中國科學院化學研究所, 北京 100190; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

將蛋白質(zhì)貼上泛素分子(ubiquitin, Ub)標簽,即泛素化,是真核生物最普遍、最復(fù)雜的翻譯后修飾方式之一,參與并調(diào)控著包括蛋白質(zhì)降解、DNA修復(fù)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多生理過程[1-3]。泛素化過程的失調(diào)或紊亂與癌癥、阿爾茲海默癥、亨廷頓病等人類重大疾病密切相關(guān)[4-6]?？梢?全面而深入認識蛋白質(zhì)泛素化修飾,對于蛋白質(zhì)新功能的揭示,疾病靶標的發(fā)現(xiàn)和化學干預(yù)具有重要作用。泛素化過程是一個涉及多種酶的級聯(lián)催化反應(yīng)。通過將泛素分子C端羧基連接到底物蛋白質(zhì)的賴氨酸(Lys, K)殘基的ε-氨基上,即可實現(xiàn)蛋白質(zhì)的泛素化修飾[7,8](見圖1a)。泛素化修飾過程復(fù)雜,產(chǎn)物、位點、形式多樣,給蛋白質(zhì)泛素化的功能解析和調(diào)控研究帶來了巨大的挑戰(zhàn)。不同于磷酸化、甲基化等小分子修飾基團,泛素分子自身是一個含有76個氨基酸的小蛋白,其中N-端甲硫氨酸(Met1, M1)自由氨基和7個賴氨酸殘基(K6、K11, K27、K29、K33、K48、K63)的側(cè)鏈氨基可以作為反應(yīng)位點繼續(xù)被修飾,形成不同長度、不同結(jié)構(gòu)的泛素鏈,傳遞不同的信號,執(zhí)行不同的功能(見圖1a)。K48泛素鏈主要參與蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶體的降解過程,K63泛素鏈在DNA損傷修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等過程發(fā)揮作用,M1泛素鏈是炎癥信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,K11泛素鏈參與細胞周期的調(diào)控,K6泛素鏈和線粒體的質(zhì)量控制相關(guān),K27泛素鏈調(diào)節(jié)先天性免疫應(yīng)答過程,K29和K33泛素鏈參與多種激酶的修飾[1-3,9-11]。此外,泛素還可進一步進行磷酸化等其他多種類型的翻譯后修飾[12],進一步增加了蛋白質(zhì)泛素化的多樣性和復(fù)雜性(見圖1b)。

圖 1 (a)泛素的氨基酸序列、三維結(jié)構(gòu)和修飾位點[8]與 (b)泛素化修飾類型示意圖Fig. 1 (a) Sequence, structure and ubiquitination sites of ubiquitin[8] and (b) schematic representation of ubiquitination types Ub: ubiquitin.

生命分離分析新原理和新方法為蛋白質(zhì)泛素化結(jié)構(gòu)和功能探測提供了重要突破口。親和分離技術(shù)是基于生物分子之間特異性相互作用發(fā)展而來的,廣泛用于親和色譜、樣品前處理等領(lǐng)域[13]。近年來,以相應(yīng)的泛素化修飾為靶標,構(gòu)建高親和力、高專一性的親和配基,發(fā)展親和分離新方法,成為蛋白質(zhì)泛素化修飾分析研究的有力工具[8,14]。與此同時,質(zhì)譜技術(shù)的高速發(fā)展為泛素化蛋白質(zhì)的高通量鑒定提供了保障[15-17]。將親和分離和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合,是泛素化修飾通路研究中不可或缺的方法[18],為揭示蛋白質(zhì)泛素化修飾的生物學效應(yīng)、探索疾病調(diào)控規(guī)律提供重要信息。本文針對親和分離新材料和新方法在蛋白質(zhì)泛素化修飾分析中的應(yīng)用進展進行了綜述。

1 免疫親和分離法用于泛素化修飾分析

免疫親和分離是基于抗原-抗體特異性相互作用進行目標分子分離的方法。抗體作為最經(jīng)典的生物識別分子,具有親和力高、選擇性好的特點,在蛋白質(zhì)泛素化的分離分析中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[19]。例如,泛素分子的單克隆抗體既可特異性識別單泛素化產(chǎn)物,也能識別多泛素化綴合物,已廣泛應(yīng)用于泛素化蛋白質(zhì)的分離富集[20]。此外,K48、K63和M1等泛素鏈的特異性抗體也被用作特定泛素鏈的親和識別配基,在相關(guān)泛素化功能研究中發(fā)揮作用[21-23]。

泛素化蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后,產(chǎn)生的非泛素化肽段對泛素化位點的檢測產(chǎn)生嚴重干擾。為了促進蛋白質(zhì)泛素化位點的高通量鑒定,美國哈佛大學-麻省理工學院Broad研究所的Udeshi等[24]以抗賴氨酸-ε-甘氨酸-甘氨酸(Lys-ε-Gly-Gly, K-ε-GG)抗體為親和配基,將其化學交聯(lián)在蛋白A瓊脂糖珠表面,制備了新型分離材料,用于泛素化肽段的富集。泛素分子C端存在精氨酸-甘氨酸-甘氨酸(Arg-Gly-Gly, RGG)三肽片段,其中C末端甘氨酸的羧基通過異肽鍵連接到底物蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基的ε-氨基上,由此形成特征的K-ε-GG標簽,可被K-ε-GG抗體特異性識別(見圖2)。因此,含K-ε-GG抗體的瓊脂糖珠可用于蛋白質(zhì)泛素化修飾的特異性分析。利用該方法,實現(xiàn)了細胞和組織樣本中泛素化肽段的親和分離,結(jié)合LC-MS/MS鑒定到了10 000個泛素化位點。

圖 2 蛋白質(zhì)泛素化修飾位點K-ε-GG的結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structure of K-ε-GG siteX denotes any other amino acid.

如前所述,泛素化修飾種類多樣復(fù)雜,且泛素自身也會被進一步修飾,因此亟需特異性更高的抗體作為識別元件。雖然抗K-ε-GG抗體在泛素化鑒定中發(fā)揮了重要作用,研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)前體細胞表達下調(diào)因子8(neural precursor cell expressed developmentally down regulated 8, NEDD8)、干擾素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15, ISG15)等類泛素分子也會對蛋白質(zhì)進行修飾,NEDD8或ISG15的底物蛋白質(zhì)經(jīng)酶切后也會產(chǎn)生K-ε-GG結(jié)構(gòu),從而干擾泛素化位點的鑒定。為了解決這些問題,Akimov等[14]以泛素分子C端獨有的13肽(ESTLHLVLRLRGG)為靶標,制備了一種新型的單克隆抗體UbiSite。當泛素化蛋白質(zhì)經(jīng)賴氨酸C端內(nèi)切酶(LysC)水解后,泛素分子C端的13個氨基酸被保留在底物肽段上,因而可被UbiSite特異性識別。利用UbiSite為配基的親和分離材料,他們實現(xiàn)了不同組織來源細胞樣本中泛素化肽段的富集分離,結(jié)合LC-MS/MS鑒定到了63 455個泛素化位點,對應(yīng)9 207個泛素化蛋白質(zhì),同時鑒定了104個N末端泛素化蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)N末端泛素化和乙?；g呈負相關(guān),為相關(guān)的生物學研究提供了重要信息。

2 基于UBDs親和識別的泛素化修飾分析

泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ubiquitin binding domains, UBDs)一般由20～150個氨基酸組成,與泛素或多聚泛素鏈存在特異性相互作用[25]。目前已鑒定出近25個不同亞家族的UBDs,包括泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-associated domain, UBA)、泛素相互作用基序(ubiquitin-interacting motifs, UIMs)、鋅指(zinc finger, ZnF)家族的泛素結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-binding zinc finger domain, UBZ)等[12]。其中一些UBDs對特定泛素修飾方式具有專一性識別能力(見圖3),如:蛋白hHR23A的UBA可優(yōu)先結(jié)合K48泛素鏈;受體相關(guān)蛋白80(receptor-associated protein 80, RAP80)中的UIMs可特異性識別K63泛素鏈[8,9]。以這些UBDs為親和配基,制備分離材料,在蛋白質(zhì)泛素化修飾研究中具有重要的應(yīng)用價值。

圖 3 (a)UBDs的識別位點與(b)UBDs-泛素復(fù)合體的 結(jié)構(gòu)模型[8]Fig. 3 (a) UBDs recognition sites and (b) structural model of UBDs-ubiquitin complex[8] UBA: ubiquitin-associated domain; A20 ZnF: A20 zinc finger domain; ZnF_UBP: zinc finger of ubiquitin-specific processing protease domain.

隨著蛋白質(zhì)泛素化研究的日益深入,基于UBDs的親和分離法面臨一些挑戰(zhàn)。和抗體相比,多數(shù)UBDs和泛素分子之間親和力弱(Kd=10～500 μmol/L);同時UBDs對不同類型的泛素鏈具有親和力差異,難以全面反映蛋白質(zhì)的泛素化水平。為了獲得具有普適性的UBDs,提高泛素化蛋白質(zhì)的分離效率,Gao等[26]利用多個對不同泛素鏈具有結(jié)合力的UBDs為識別配基,以聚甘氨酸為柔性連接分子,構(gòu)建了串聯(lián)雜交泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Tandem hybrid UBDs, ThUBDs)。ThUBDs由2～4個混合型UBDs單元串聯(lián)而成,有利于多位點同時識別,可實現(xiàn)對7種不同泛素鏈的高效結(jié)合,其中ThUBDs和K48泛素鏈的Kd值可達4.46 μmol/L。結(jié)合該親和分離方法,實現(xiàn)了高轉(zhuǎn)移人肝癌細胞中泛素化蛋白質(zhì)的分離純化;結(jié)合LC-MS/MS技術(shù),成功鑒定了1 125個泛素化蛋白質(zhì)。

泛素鏈的長度往往通過分析其凝膠電泳的遷移率來確定。底物蛋白質(zhì)上泛素化修飾位點的多樣性為不同泛素鏈的長度測定提出了巨大的挑戰(zhàn)。Tsuchiya等[27]通過串聯(lián)UBA片段,構(gòu)建了可特異性識別多聚泛素鏈的串聯(lián)泛素結(jié)合實體(tandem ubiquitin-binding entities, TUBEs),建立了一種泛素鏈長度分析新方法Ub-ProT(Ub chain protection from trypsinization)。TUBEs和泛素鏈的結(jié)合可保護泛素化蛋白質(zhì)不受去泛素化酶(deubiquitinases, DUBs)和蛋白酶體的降解,保持了完整的結(jié)構(gòu)特性,進而可用電泳對其長度進行簡單快速分析。該研究團隊將Ub-ProT應(yīng)用于酵母裂解物中底物蛋白質(zhì)上泛素鏈的長度測定,發(fā)現(xiàn)K11和K63泛素鏈主要以二聚體形式存在,而K48、K6和K29泛素鏈中泛素分子多達7個;揭示了哺乳動物細胞中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)泛素修飾特點,其中K63連接的泛素鏈以四聚體至六聚體為主。

3 基于多肽識別的泛素化修飾分析

多肽是重要的內(nèi)源性生理活性物質(zhì),參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)眾多的生理過程[28,29]。和抗體等生物大分子相比,多肽具有相對分子質(zhì)量小、分子相互作用快、可控性強、制備簡便穩(wěn)定等特點。針對細胞、蛋白質(zhì)等靶標,人工設(shè)計合成靶向多肽,已成為化學和生物學關(guān)注的熱點,也為復(fù)雜生命體系的分離分析提供了識別工具[30-37]。在泛素分子末端加多聚組氨酸標簽(His6-tag),再利用固定化金屬離子親和色譜(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)進行泛素化蛋白質(zhì)的分離、富集或純化[38],是多肽識別在泛素化修飾分析中的一個重要應(yīng)用。鎳離子固定化親和色譜分離主要在變性條件下進行,有效降低了DUBs對泛素化蛋白質(zhì)的水解活性,同時可避免蛋白-蛋白相互作用引起的非泛素化蛋白質(zhì)的結(jié)合,在蛋白質(zhì)泛素化的分離分析中具有獨特優(yōu)勢[13,39]。

由直鏈多肽環(huán)化形成的環(huán)肽具有親和力高、選擇性好、抗生物降解等優(yōu)勢,在特定泛素鏈的高效分離中具有應(yīng)用前景[40,41]。以色列理工學院的Nawatha等[42]分別以K48泛素二聚體(K48Ub2)和泛素四聚體(K48Ub4)為靶標,利用mRNA展示技術(shù)獲得隨機肽庫,篩選得到了靶向環(huán)肽Ub2i、Ub2ii、Ub4i及Ub4ix。利用表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)及1H-、15N-NMR分析了環(huán)肽和K48泛素鏈的相互作用。結(jié)構(gòu)分析表明,Ub2ii和K48Ub2的作用位點位于泛素分子由亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸形成的疏水表面,結(jié)合比為1∶1, Ub4ix則同時結(jié)合K48Ub4的前3個泛素分子。其中3種環(huán)肽(Ub2i、Ub2ii和Ub4i)對K48Ub2及K48Ub4均具有高結(jié)合能力,親和力可達nmol水平;環(huán)肽Ub4ix則可特異性識別K48Ub4,Kd值低至6 nmol/L。針對不同結(jié)構(gòu)泛素鏈設(shè)計篩選親和多肽作為識別配基,為蛋白質(zhì)泛素化特異性分析提供了新工具。

圖 4 多肽Affimer的表征和應(yīng)用[43]Fig. 4 Characterization and applications of affimer[43]

相比于K48、K63修飾泛素鏈的相對高豐度,K6、K29和K33泛素鏈在細胞內(nèi)含量極低,并且缺乏特異性識別分子。劍橋大學的Michel等[43]以K6和K33泛素鏈為靶標,通過多肽噬菌體展示技術(shù),篩選出了K6和K33泛素鏈的多肽Affimer,測定了Affimer和K6、K33、K11泛素鏈的結(jié)合熱力學和動力學特性。其中,K6 Affimer可特異性識別K6泛素鏈(Kd<1 nmol/L), K33 Affimer對K33和K11泛素鏈均具有高效結(jié)合能力(見圖4)。他們將K6 Affimer應(yīng)用于人胚胎腎細胞中泛素化蛋白質(zhì)的親和分離,結(jié)合絕對定量法和bottom-up分析方法,不僅實現(xiàn)了K6泛素鏈的高效富集,而且鑒定了泛素連接酶HUWE1;揭示了HUWE1介導(dǎo)線粒體融合蛋白2(mitofusin2, Mfn2)上K6泛素鏈的修飾功能。

4 基于多種親和配基的泛素化修飾分離分析

細胞內(nèi)泛素化蛋白質(zhì)的含量普遍很低。通過單一親和配基直接分離復(fù)雜生物樣品中的泛素化蛋白質(zhì)或肽段,分離效果仍比較有限,尤其是一些非典型的、豐度極低的泛素化修飾類型,很難實現(xiàn)高效富集。為了降低背景干擾,提高親和分離效率,利用多種配基進行串聯(lián)或并聯(lián)識別,可望實現(xiàn)蛋白質(zhì)泛素化的高效、高靈敏度分離分析。例如,將生物素-鏈霉親和素識別體系(Kd=10-15mol/L)與His6-金屬離子識別相結(jié)合,研究人員構(gòu)建了新型串聯(lián)親和標簽:組氨酸-生物素(histidine-biotin, HB)[44]。攜帶HB標簽的泛素化蛋白質(zhì)可在變性條件下,被鎳親和樹脂、鏈霉親和素瓊脂糖捕獲,從而實現(xiàn)分離純化?；谠摲椒?在酵母細胞中分離鑒定到了258個泛素化蛋白質(zhì)。密歇根大學的Maine等[45]利用泛素分子N端的His6標簽,結(jié)合底物蛋白C端的生物素標記,建立了一種雙分子親和純化法。鎳親和色譜的初次分離,可得到所有泛素化蛋白質(zhì);后續(xù)鏈霉親和素的再次純化,可去除其他非目標蛋白質(zhì)的干擾,最終得到所需的泛素化靶蛋白。該方法被應(yīng)用于3種特定泛素化靶蛋白的分離,純度高達95%。

聯(lián)合使用抗體和UBDs作為親和配基,進行蛋白質(zhì)泛素化的識別和分離分析,也是一種行之有效的方法。為了實現(xiàn)泛素連接酶相關(guān)底物蛋白質(zhì)的高效鑒定,Yoshida等[46]利用蛋白Ubiquilin1的UBA片段,構(gòu)建了攜帶FLAG標簽的TUBEs。TUBEs對8種泛素鏈均具有結(jié)合能力,可防止底物蛋白的去泛素化和降解。在TUBEs對泛素鏈識別的基礎(chǔ)上,利用抗FLAG抗體和抗K-ε-GG抗體進行兩步親和純化,實現(xiàn)了底物蛋白泛素化肽段的高效分離富集。結(jié)合LC-MS/MS方法,鑒定到了連接酶FBXO21的底物蛋白質(zhì),可望成為泛素連接酶功能研究的有效手段(見圖5)。

圖 5 底物鑒定過程的示意圖[46]Fig. 5 Schematic representation of the substrate identification processes[46]TR-TUBE: trypsin-resistant tandem ubiquitin-binding entities; TBS-N: tris buffered saline; IP: immunoprecipitation.

一系列酶促級聯(lián)反應(yīng)執(zhí)行蛋白質(zhì)泛素化過程。如何高效分離并鑒定泛素連接酶特異性底物蛋白質(zhì),對于認識泛素化過程具有重要意義。Mark等[47]通過泛素連接酶和UBA片段的融合,設(shè)計了攜帶FLAG標簽的連接酶陷阱(ligase trap)。UBA和泛素鏈的結(jié)合,有利于提高連接酶對其泛素化底物的親和力。針對連接酶陷阱上的FLAG標簽和泛素分子上的His6標簽,以抗FLAG抗體和鎳離子為識別單元,建立了串聯(lián)親和純化方法,實現(xiàn)了酵母和哺乳動物細胞中泛素連接酶相關(guān)底物蛋白的親和分離;結(jié)合質(zhì)譜技術(shù),鑒定到了多種新型底物蛋白。

類泛素化修飾(small ubiquitin-like modifier, SUMO)與泛素化修飾密切相關(guān),但研究兩種修飾之間相互關(guān)系的分析方法仍比較有限。為了同時鑒定蛋白質(zhì)泛素化和SUMO化修飾,McManus等[48]突變SUMO分子C端肽段序列(QQQTGG)為RNQTGG,因此SUMO化修飾蛋白質(zhì)酶解后將產(chǎn)生含有K(NQTGG)結(jié)構(gòu)的肽段,可被抗K(NQTGG)抗體特異性識別;同時構(gòu)建了攜帶His6標簽的SUMO突變體(SUMO3m)。通過上述分子設(shè)計,利用鎳親和樹脂分離得到了SUMO化修飾蛋白質(zhì),富集倍數(shù)高達100倍;繼而利用抗K(GG)抗體及抗K(NQTGG)抗體進行免疫沉淀,實現(xiàn)了泛素化肽段和SUMO化肽段的親和分離。基于高的富集倍率和選擇性,結(jié)合LC-MS/MS技術(shù),僅需16 mg細胞提取物,即可鑒定8 000多個SUMO化修飾位點,以及3 500多個泛素化修飾位點,為闡明兩種蛋白質(zhì)修飾之間的功能和聯(lián)系提供了關(guān)鍵技術(shù)手段。

5 總結(jié)與展望

基于生物分子間特異性相互作用的親和分離技術(shù),在蛋白質(zhì)泛素化修飾分析中發(fā)揮了舉足輕重的作用。一些天然存在的識別配基,如:抗體、UBDs和生物素等,已成功用于泛素化修飾蛋白質(zhì)的分離富集之中。與此同時,人工設(shè)計篩選新型識別分子(如:靶向多肽),也得到了關(guān)注,并為泛素化修飾的特異性分析提供了新工具。不僅如此,多種親和識別配基的聯(lián)合使用,拓寬了泛素化蛋白質(zhì)高選擇性分析的思路,降低了復(fù)雜生物體系中的背景干擾,提高了分離富集的效率。不同親和分離方法可望為蛋白質(zhì)泛素化結(jié)構(gòu)與功能的認識提供新工具,在藥物新靶標的發(fā)現(xiàn)、治療干預(yù)等方面具有應(yīng)用潛能。

然而蛋白質(zhì)泛素化修飾的研究仍存在諸多挑戰(zhàn)。一些細胞內(nèi)含量極低的非典型泛素化修飾(如:K6、K27、K29和K33泛素鏈),其功能尚未完全揭示;和同型泛素鏈相比,混合型泛素鏈和分支型泛素鏈結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,對異型泛素鏈的識別和功能研究仍非常欠缺。因此,針對這些泛素化分子特征,構(gòu)建新的親和識別分子,建立高效、高選擇性的親和分離方法,對于滿足這些低豐度、可能具有關(guān)鍵生物功能的泛素鏈的分離分析具有非常重要的意義,也是未來研究關(guān)注的方向。