吳曉東，李朋朋，程建，霍維玲，李國棟

1徐州市中心醫(yī)院骨科，江蘇徐州221009；2蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生院；3徐州市中心醫(yī)院藥劑科

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是以關(guān)節(jié)疼痛和功能喪失為主要特征的一種綜合征，也是一種與年齡相關(guān)的關(guān)節(jié)退行性疾病，多發(fā)生在45歲以上的人群中，全球約有4億關(guān)節(jié)炎患者［1］。目前，OA引起關(guān)節(jié)退行性變的機制尚不清楚［2］。OA對各年齡段及特殊職業(yè)人群都有一定的影響，明顯的臨床癥狀為疼痛，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致殘疾。隨著OA患者的增多且年輕化，臨床醫(yī)生對其也越來越重視，世界衛(wèi)生組織把OA列為致殘的第二大疾?。?］。目前的醫(yī)療策略不能完全治愈OA，只能減緩癥狀或延緩疾病的進展。OA治療方法分為手術(shù)治療和非手術(shù)治療［4］。減輕或者消除疼痛、控制炎癥的發(fā)展是目前治療OA的主要手段，如何減緩或延緩OA的發(fā)展甚至是根治，已經(jīng)成為臨床上研究的重要課題之一。隨著組織工程學(xué)及材料學(xué)的不斷發(fā)展，研究者以納米微粒作為藥物的載體，可抑制OA患者的炎性反應(yīng)和促進軟骨的修復(fù)。2018年9月—2020年7月，本研究使用-sese-基團作為活性氧簇（ROS）反應(yīng)，制備了負載地塞米松（DEX）和軟骨衍生形態(tài)發(fā)生蛋白1（CDMP-1）的盤狀脂質(zhì)納米粒DLNPs，然后建立新西蘭兔膝關(guān)節(jié)炎模型，觀察膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射DLNPs對膝關(guān)節(jié)炎新西蘭兔血清和滑膜組織中炎性因子的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 盤狀脂質(zhì)納米粒DLNPs、新西蘭兔、儀器及試劑 參照文獻［6］，使用-sese-基團作為活性氧簇（ROS）制備負載地塞米松（DEX）和軟骨衍生形態(tài)發(fā)生蛋白1（CDMP-1）的盤狀脂質(zhì)納米粒DLNPs，經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定。健康雄性新西蘭兔購自南京大學(xué)動物研究中心，共計35只，體質(zhì)量2.0～3.0 kg。FACS CantoⅡ流式細胞儀購自美國Biosciences公司，ESJ120-4A型電子天平購自沈陽龍騰電子科量儀器有限公司。地塞米松（DEX）、軟骨衍生形態(tài)發(fā)生蛋白1（CDMP-1）、家兔白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及前列腺素2（PGE2）、血清ELISA試劑盒購自江蘇酶標(biāo)生物公司。兔IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP13）一抗及二抗購自美國Proteintech公司；兔TNF-α抗體購自美國RD公司［5］。本研究經(jīng)徐州市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，許可證號：SYXK（蘇）2021-0017。

1.2 膝關(guān)節(jié)炎新西蘭兔模型的制備、分組及DLNPs的給予方法 35只健康新西蘭兔在實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字法分為對照組、模型組、DEX組、CDMP-1組、DLNPs組5組，每組7只。模型組、DEX組、CDMP-1組、DLNPs組新西蘭兔采用Hulth改良法制備膝關(guān)節(jié)炎新西蘭兔模型［7］：手術(shù)暴露兔右膝關(guān)節(jié)，尋找兔內(nèi)側(cè)副韌帶、內(nèi)側(cè)半月板及前交叉韌帶并且將其切斷，依據(jù)抽屜試驗和側(cè)方應(yīng)力試驗方法判定兔右膝手術(shù)后的穩(wěn)定性，當(dāng)確定其不穩(wěn)定后，對暴露的右膝進行逐層縫合。為預(yù)防感染，術(shù)后進行抗感染及對手術(shù)部位進行消毒，抗感染藥物使用青霉素，肌注，40萬單位/次，1次/日［8］。對照組不進行手術(shù)。所有新西蘭兔均以相同條件喂養(yǎng)。造模成功后，分別在第1、4、7、10天于膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物［9］：DEX組注射9.8%的DEX 5 mL，CDMP-1組注射0.53%的CDMP-1 5 mL，DLNPs組注射DLNPs（DEX濃度為9.8%，CDMP-1濃度為0.53%［6］）5 mL，對照組、模型組不給藥。造模成功后第13天，耳緣靜脈注射10%水合氯醛（2 mL/kg）進行麻醉，然后打開腹腔，在腹腔內(nèi)尋找腹主動脈，應(yīng)用采血針和真空采血管在腹主動脈處取血15 mL，常溫靜止放置15～20 min，4℃條件下3 000 r/min離心5 min，離心后取上清液放入冰箱-80℃冷凍保存。取完血后，手術(shù)暴露兔膝關(guān)節(jié)，取膝關(guān)節(jié)滑膜組織。

1.4 各組新西蘭兔血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2檢測 采用ELISA法。造模成功后第13天，耳緣靜脈注射10%水合氯醛（2 mL/kg）進行麻醉，然后打開腹腔，在腹腔內(nèi)尋找腹主動脈，應(yīng)用采血針和真空采血管在腹主動脈處取血15 mL，常溫靜止放置15～20 min，4℃條件下3 000 r/min離心5 min，離心后取上清液，嚴(yán)格按照血清ELISA試劑盒說明書要求，檢測各組新西蘭兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2。

1.5 各組新西蘭兔滑膜組織中炎性因子IL-1β、TNF-α、MMP-13檢測 采用BCA法。取滑膜組織10 mg，使用玻璃研磨器碾碎，把蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑混合液0.2 mL注入玻璃研磨器內(nèi)，使用玻璃棒攪勻，形成漿液，4℃冰箱內(nèi)靜止放置20 min后，倒入離心管，12 000 r/min離心15 min，提取上層清液進行BCA蛋白濃度測定。吸取20μL樣品溶液于酶標(biāo)孔中，加入BCA試劑200μL輕搖，于37℃保溫45 min，冷卻至室溫后，以空白為對照，在酶標(biāo)儀上562 nm處比色，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線空白為對照，根據(jù)樣品的吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上分別查出炎性因子IL-1β、TNF-α、MMP-13的蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組新西蘭兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平比較 各組新西蘭兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平比較見表1。由表1可知，模型組、DEX組、CDMP-1組、DLNPs組新西蘭兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平與對照組相比均顯著升高（P均<0.05），DEX組、CDMP-1組、DLNPs組新西蘭兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平與模型組相比均顯著降低（P均<0.05），DEX組、CDMP-1組、DLNPs組新西蘭兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平組間相比，P均<0.05，且CDMP-1組最高、DLNPs組最低（P均<0.05）。

表1 各組新西蘭兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平比較（±s）

表1 各組新西蘭兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平比較（±s）

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與DEX組相比，△P<0.05；與CDMP-1組相比，▲P<0.05。

組別DLNPs組CDMP-1組DEX組模型組對照組IL-1β（μg/L）32.45± 8.14*#△▲56.32± 7.98*#△42.56± 5.34*#58.32±10.32*16.22± 1.02 IL-6（μg/L）156.65±13.29*#△▲219.65±10.85*#△187.47±12.33*#236.67±21.36*57.33± 3.85 TNF-α（μg/L）429.21±35.68*#△▲687.01±40.10*#△465.58±37.60*#734.21±52.14*115.36±15.12 PGE2（μg/L）435.59±31.30*#△▲631.31±30.25*#△465.39±28.11*#653.57±26.26*315.56±14.12

2.2 各組新西蘭兔滑膜組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13相對表達量比較 各組新西蘭兔滑膜組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13相對表達量比較見表2。由表2可知，模型組、DEX組、CDMP-1組、DLNPs組新西蘭兔滑膜組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13相對表達量與對照組相比均顯著升高（P均<0.05），DEX組、CDMP-1組、DLNPs組新西蘭兔滑膜組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13相對表達量與模型組相比均顯著降低（P均<0.05），DEX組、CDMP-1組、DLNPs組新西蘭兔滑膜組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13相對表達量組間相比，P均<0.05，且CDMP-1組最高、DLNPs組最低（P均<0.05）。

表2 各組新西蘭兔滑膜組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13相對表達量比較（±s）

表2 各組新西蘭兔滑膜組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13相對表達量比較（±s）

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與DEX組相比，△P<0.05；與CDMP-1組相比，▲P<0.05。

組別DLNPs組CDMP-1組DEX組模型組對照組IL-1β 2.39±0.55*#△▲3.75±0.21*#△2.62±0.36*#4.16±0.32*1.00 TNF-α 2.35±0.44*#△▲3.14±0.31*#△2.47±0.22*#3.52±0.34*1.00 MMP-13 1.53±0.34*#△▲2.12±0.47*#△1.65±0.56*#2.32±0.53*1.00

3 討論

終末期膝關(guān)節(jié)治療的最后方法是膝關(guān)節(jié)置換術(shù)［10］，但軟骨特別是透明軟骨無血管和神經(jīng)組織分布，因此軟骨細胞幾乎沒有增殖和遷移、自我修復(fù)和再生的潛力。膝關(guān)節(jié)炎形成期，炎性因子積聚，造成軟骨的破壞，而軟骨無法自我修復(fù)，最終導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)的不可逆損傷，以至通過膝關(guān)節(jié)置換術(shù)來治療。而膝關(guān)節(jié)置換術(shù)具有創(chuàng)傷大、花費高、易感染、術(shù)后療效不滿意及患者術(shù)后生活質(zhì)量降低等缺點［11-13］。因此，如何有效延緩甚至修復(fù)或逆轉(zhuǎn)軟骨損傷是臨床研究的重點課題。

炎癥因子在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理中起著關(guān)鍵的作用，尤其是IL-1β［14］。研究［15］顯示，IL-1β可以促使NO、PGE2及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等炎性細胞因子的產(chǎn)生。TNF-α的表達在炎性因子中也起到重要的作用，TNF-α含量的增高可以使MMPs的表達也增加，而MMPs的表達升高使關(guān)節(jié)炎的癥狀持續(xù)加重，直至導(dǎo)致嚴(yán)重后果。因此，減少OA引起的炎癥和疼痛的主要策略是通過降低前列腺素的水平。糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)分泌的，具有很好的環(huán)氧化酶抑制活性，還在促進細胞生長、增殖、發(fā)育和再生中發(fā)揮重要作用。DEX是糖皮質(zhì)激素的一種，具有抗炎、抗內(nèi)毒素、抑制免疫、抗休克及增強應(yīng)激反應(yīng)等藥理作用，并且不良反應(yīng)少，故廣泛應(yīng)用于治療多種疾病。本課題組引入DEX，制備了負荷DEX的納米顆粒，通過DEX的緩慢釋放，以期長時間的抑制關(guān)節(jié)炎炎性因子的表達，降低軟骨破壞，促進軟骨細胞的增殖、再生，從而緩解關(guān)節(jié)炎患者的疼痛。

CDMP-1是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）家族中的新亞型，作用于骨骼系統(tǒng)，具有多種調(diào)節(jié)功能，特別是能促進軟骨形成和發(fā)育，可在異位誘導(dǎo)軟骨形成。大量研究［16-17］發(fā)現(xiàn)，CDMP-1能在體外誘導(dǎo)骨間充質(zhì)細胞、骨膜源性細胞等，形成軟骨樣結(jié)構(gòu)。而有研究［18］發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜中的CDMP-1可以被炎性因子IL-1β抑制，進一步抑制了關(guān)節(jié)軟骨的自身修復(fù)。本課題組通過制備負荷DEX與CDMP-1的具有緩釋作用的納米顆粒，DEX與CDMP-1的緩慢釋放，相互促進，達到抑制炎性反應(yīng)，促進軟骨細胞增殖、再生，從而緩解關(guān)節(jié)炎患者的疼痛，修復(fù)軟骨關(guān)節(jié)面，以期能夠避免膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)。

本文針對自主研發(fā)的盤狀脂質(zhì)納米粒DLNPs對炎癥因子的影響效果進行研究發(fā)現(xiàn)，DLNPs組與DEX組和CDMP-1組相比，對于血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2表達水平以及滑膜組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13蛋白表達水平，能夠使其明顯的降低，但CDMP-1組的降低不明顯，可能是因為CDMP-1主要起修復(fù)作用，對炎癥的影響較小。

綜上所述，與單獨注射DEX或CDMP-1相比，膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射負載CDMP-1和DEX的盤狀脂質(zhì)納米粒DLNPs可以顯著降低膝關(guān)節(jié)炎新西蘭兔血清和滑膜組織中炎性因子的水平，并且能促進損傷軟骨的修復(fù)，延緩或避免了關(guān)節(jié)置換手術(shù)的發(fā)生。本研究提示具有緩釋作用的載有協(xié)同作用藥物的盤狀脂質(zhì)納米粒在臨床上具有廣闊的發(fā)展空間。