王艷，張宇卉，胡耐博，滕廣帥，周圓，白潔

1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科，天津300211；2中國(guó)醫(yī)學(xué)科院血液病醫(yī)院

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所）血液內(nèi)科

原發(fā)性骨髓纖維化（PMF）是骨髓增殖性腫瘤（MPN）的一種常見(jiàn)類型，其發(fā)病機(jī)制與造血干細(xì)胞（HSC）的克隆性增殖關(guān)系密切［1］，主要表現(xiàn)為脾大、全血細(xì)胞進(jìn)行性減少、骨髓纖維化等。研究［2］顯示，大約20%的PMF患者在確診后的10年內(nèi)會(huì)轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病（AML），預(yù)后極差。然而，PMF的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，其向AML轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制目前尚不完全清楚，明確PMF不良預(yù)后的分子機(jī)制可以為PMF的治療提供新的理論依據(jù)。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，基因測(cè)序已成為探索疾病分子機(jī)制的重要工具［3］。單細(xì)胞RNA測(cè)序可以檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞的RNA表達(dá)譜，與傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)相比具有更高的分辨率［4］。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)到那些傳統(tǒng)基因芯片技術(shù)難以檢測(cè)到的稀有細(xì)胞基因，而這些基因可能具有及其重要生物學(xué)意義。本研究通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集GSE153319中的HSC進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選出PMF向AML轉(zhuǎn)化過(guò)程中HSC的差異表達(dá)基因及核心基因，為探索PMF預(yù)后不良的分子機(jī)制及PMF的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集的選取以“Primary myelofibrosis and Acute myeloid leukemia”為檢索關(guān)鍵詞，從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索符合條件的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集，最終選取基因芯片GSE153319為研究對(duì)象。GSE153319數(shù)據(jù)集包含1例PMF患者進(jìn)展為AML過(guò)程中三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)（PMF慢性期、蘆可替尼治療后8個(gè)月、AML轉(zhuǎn)化期）的樣本。

1.2 HSC細(xì)胞和高變基因的篩選 利用R語(yǔ)言的Seurat包篩選GSE153319數(shù)據(jù)集中基因數(shù)量200～10 000和線粒體基因占比<5%的細(xì)胞，共獲得符合條件的細(xì)胞7 717個(gè)。為了去除納入研究細(xì)胞的批次效應(yīng)，且最大程度保留細(xì)胞的基因表達(dá)信息，我們對(duì)7 717個(gè)細(xì)胞進(jìn)行主成分分析（PCA）和T分布隨機(jī)鄰接嵌入（t-SNE）聚類，結(jié)果顯示，7 717個(gè)細(xì)胞被劃分為13個(gè)細(xì)胞簇，利用Seurat包的FindAllMarkers函數(shù)尋找每個(gè)細(xì)胞簇的特異性基因，并利用SingleR包和既往發(fā)表文獻(xiàn)中的細(xì)胞標(biāo)記基因?qū)Σ煌募?xì)胞簇進(jìn)行注釋，最后利用VlnPlot函數(shù)和FeaturePlot函數(shù)顯示HSC標(biāo)記基因在不同細(xì)胞簇的表達(dá)，最終篩選出HSC。利用R語(yǔ)言對(duì)HSC進(jìn)行PCA降維并可視化其主成分分布，篩選出HSC細(xì)胞間高度變化的基因（簡(jiǎn)稱高變基因），選取MALAT1、VIM、HLADRA、FOS、JUN、CD74、TSC22D3、TMSB4X、MTRNR2、KLF6等排名前2 000的高變基因用于后續(xù)分析。

1.3 PMF向AML轉(zhuǎn)化過(guò)程中HSC差異表達(dá)基因的篩選及基因本體（GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號(hào)通路分析 利用R語(yǔ)言的Seurat包Findmarkers函數(shù)，設(shè)置篩選條件為|log2FC|>0.5且P<0.01，篩選PMF慢性期和AML轉(zhuǎn)化期HSC的差異表達(dá)基因。利用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）在線數(shù)據(jù)庫(kù) 和Metascape（https：//metascape.org）在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PMF向AML轉(zhuǎn)化過(guò)程中HSC差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析，其中GO功能富集包括生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）。

1.4 PMF向AML轉(zhuǎn)化過(guò)程中HSC蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及核心基因篩選借助STRING10（http：//www.string-db.org）在線數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Cytoscape軟件的Mcode插件篩選出核心基因簇，通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的核心基因簇進(jìn)行GO功能富集，利用CytoHubba插件設(shè)置篩選條件為MCC算法【MCC（v）=∑c∈s（v）（|C|-1）！】，篩選出排名前5的基因，即為PMF向AML轉(zhuǎn)化過(guò)程中HSC的核心基因。

2 結(jié)果

2.1 PMF向AML轉(zhuǎn)化過(guò)程中HSC差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 共篩選出98個(gè)差異表達(dá)基因，與PMF慢性期相比，AML轉(zhuǎn)化期HSC中有78個(gè)上調(diào)基因、20個(gè)下調(diào)基因。上調(diào)的基因?yàn)镕KBP5、RPL3P2、DUSP6、PNMT、ISG20、ARL4C、KLF7、FOS、KLF13、BTG2、RGS2、OSBPL10、MAL、JUNB、AL158827.2、MAN2A1、TIPARP、EGR3、TNFAIP3、TP53INP1、C5orf30、CXCR4、IER2、RHOB、MCL1、SAP30、AP002982.1、RPL5P17、LMNA、TXNIP、SOCS1、RPS2P55、AGPS、MTRNR2L10、AC062028.2、AKR1C2、STK17B、ID1、CD69、MMP7、AC009362.1、DUSP2、PER1、PTGS2、ID3、ZFP36、AC020916.1、GSTM3、CXCL8、EGR1、AREG、AC099340.1、GNAI1、RPL27AP、AC113367.1、SESN1、AC114760.2、NRXN2、RGS1、HIF3A、AKR1C1、ATP2B1-AS1、RASGEF1B、AL031733.2、SOCS3、S100A10、KLF2、MYADM、AL356512.1、AL445433.1、TSC22D3、KLF6、KLF4、ARRDC3、WASF4P、PIK3IP1、KLF9、ZNF595。下調(diào)的基因?yàn)镮FI44L、PABPC1P4、PARP9、STAT2、IFIT3、PTAFR、RPS26P47、IFITM1、CLU、STON2、STAT1、TRIM69、TNFSF13B、IFI6、AC095059.2、DTX3L、HLA-H、OAS1、IRF7、MX1。

2.2 差異表達(dá)基因的GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果 GO功能富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因的BP主要富集在RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控、炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子反應(yīng)、成骨細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控以及血管新生等，CC主要富集在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，MF主要富集在DNA結(jié)合以及RNA聚合酶Ⅱ核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活子活性；下調(diào)基因的BP主要富集在炎癥反應(yīng)、干擾素-γ介導(dǎo)的信號(hào)通路以及細(xì)胞對(duì)α干擾素的反應(yīng)，CC主要富集在細(xì)胞質(zhì)。KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因的KEGG信號(hào)通路主要富集在TNF信號(hào)通路、癌癥相關(guān)通路、凋亡相關(guān)通路以及Apelin信號(hào)通路等。

2.3 PMF轉(zhuǎn)化為AML過(guò)程中HSC核心基因的篩選結(jié)果 構(gòu)建的PMF向AML轉(zhuǎn)化過(guò)程中HSC差異表達(dá)基因編碼的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖1。利用Cytoscape的Mcode插件分析獲得2個(gè)核心基因簇，基因簇1主要與免疫調(diào)控、JAK-STAT信號(hào)通路、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子反應(yīng)以及細(xì)胞增殖等關(guān)系密切，基因簇2主要與DNA轉(zhuǎn)錄以及凋亡調(diào)控關(guān)系密切。根據(jù)MCC算法篩選出排名前5的核心基因分別是FOS、EGR1、PTGS2、CXCL8和CXCR4，這5個(gè)基因可能是PMF轉(zhuǎn)化為AML過(guò)程中HSC的核心基因。

圖1 PMF向AML轉(zhuǎn)化過(guò)程中HSC差異表達(dá)基因編碼的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

PMF是一種罕見(jiàn)而具侵襲性的MPN，其致病因素為HSC的克隆增殖紊亂，主要表現(xiàn)為全血細(xì)胞減少、髓外造血和全身癥狀。目前PMF的治療方式主要為常規(guī)對(duì)癥治療、靶向藥物治療和HSC移植［5］。常規(guī)治療主要通過(guò)糖皮質(zhì)激素、雄激素治療骨髓纖維化相關(guān)性貧血［6］，對(duì)于脾大的骨髓纖維化患者可應(yīng)用羥基脲［1］。靶向藥物治療主要是指JAK抑制劑在PMF患者中的應(yīng)用，主要包括蘆可替尼、菲卓替尼等。隨著技術(shù)的發(fā)展，靶向藥物的研究也取得了突破性進(jìn)展，從而使得PMF患者的生存期和生存治療都有了較大提升［7-8］。HSC移植是患者接受放化療或聯(lián)合免疫抑制劑清除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞后，通過(guò)回輸HSC以重建造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的一種治療方式，是目前唯一可能治愈PMF的方法［9］。然而，由于PMF本身的異質(zhì)性以及移植后并發(fā)癥的存在，使得HSC移植的應(yīng)用存在一定局限性。目前PMF的治療仍存在很大難度，且一旦轉(zhuǎn)化為AML，預(yù)后極差。本課題組通過(guò)檢索GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中與PMF不良預(yù)后有關(guān)的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集，利用生物信息學(xué)技術(shù)，尋找PMF進(jìn)展為AML的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，為PMF的治療提供新的理論依據(jù)。

本課題組通過(guò)R語(yǔ)言的Seurat包、SingleR包以及既往文獻(xiàn)將單細(xì)胞數(shù)據(jù)集GSE153319中的7 717個(gè)細(xì)胞劃分為13個(gè)細(xì)胞簇。既往研究［10］發(fā)現(xiàn)，HSC的克隆增殖紊亂是PMF的主要發(fā)病機(jī)制。因此，本研究通過(guò)R語(yǔ)言提取HSC進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選PMF預(yù)后不良的關(guān)鍵分子機(jī)制。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集發(fā)現(xiàn)，PMF進(jìn)展為AML的差異表達(dá)基因主要富集在炎癥調(diào)控、細(xì)胞增殖以及分化等過(guò)程中，KEGG信號(hào)通路則主要富集在TNF信號(hào)通路、癌癥相關(guān)通路、凋亡相關(guān)通路以及Apelin信號(hào)通路等，提示PMF進(jìn)展為AML的過(guò)程中，HSC的增殖、分化功能以及對(duì)骨髓微環(huán)境免疫調(diào)控的功能發(fā)生了改變。通過(guò)Cytoscape進(jìn)一步篩選出2個(gè)核心基因簇，其中基因簇1主要與免疫調(diào)控、JAK-STAT信號(hào)通路、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子反應(yīng)以及細(xì)胞增殖等關(guān)系密切，基因簇2主要DNA轉(zhuǎn)錄以及凋亡調(diào)控關(guān)系密切，進(jìn)一步驗(yàn)證了HSC增殖、分化紊亂以及免疫調(diào)控在PMF不良預(yù)后中的作用。

利用Cytoscape的Cytohubba插件根據(jù)MCC算法篩選出排名前5的核心基因，分別是FOS、EGR1、PTGS2、CXCL8和CXCR4。研究［11-12］顯示，F(xiàn)OS和EGR1屬于原癌基因，可以協(xié)同作用，共同促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化，在AML的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PTGS2可促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化，在AML患者中的表達(dá)水平明顯升高，其表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)［13］。CXCL8是趨化因子的一種，可以促進(jìn)HSC的增殖、分化，與AML的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［14］。CXCR4是趨化因子CXCL12的特異受體，在調(diào)控細(xì)胞增殖、髓外移行、浸潤(rùn)、黏附及對(duì)化療藥物的耐藥中起重要作用［15-16］。ABDELOUAHAB等［17］學(xué)者發(fā)現(xiàn)，骨髓纖維化患者的CXCR4通路被過(guò)度激活，是PMF診斷的敏感標(biāo)記物。

綜上所述，本研究通過(guò)檢索GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中PMF不良預(yù)后的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集，對(duì)PMF和AML樣本中的HSC進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定與PMF不良預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)基因。與PMF慢性期相比，AML轉(zhuǎn)化期HSC中有98個(gè)差異表達(dá)基因；差異表達(dá)基因主要富集在炎癥調(diào)控、細(xì)胞增殖以及分化等過(guò)程中，參與TNF信號(hào)通路、癌癥相關(guān)通路、凋亡相關(guān)通路以及Apelin信號(hào)通路等；FOS、EGR1、PTGS2、CXCL8、CXCR4等5個(gè)差異表達(dá)基因可能是PMF轉(zhuǎn)化為AML過(guò)程中HSC的核心基因。本研究通過(guò)分析預(yù)測(cè)了PMF預(yù)后不良的可能發(fā)病機(jī)制并篩選出參與PMF進(jìn)展為AML的核心基因，為PMF的診治提供了新的思路。然而，本研究還具有一定的局限性，本研究完全基于對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)篩選出的核心基因仍需通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。