李虹瑾，唐玉嬌，劉嘉琳，劉 斌

(1. 長春科技學(xué)院職業(yè)技術(shù)學(xué)院，長春 130600；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

輪狀病毒(Rotavirus，RV)是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒及幼畜腹瀉的主要病原體之一，其感染動物范圍廣泛，包括各類哺乳動物與禽類。輪狀病毒根據(jù)VP6群特異性抗原決定簇可分為10種血清群型，分別為RV A～RV J，其中RV A、RV B和RV C與仔豬腹瀉密切相關(guān)[1]。RV在7日齡內(nèi)新生仔豬和21～28日齡斷奶仔豬中感染率最高，其中RV A是引起仔豬嚴(yán)重胃腸炎的主要血清型，發(fā)病率和死亡率較高，近些年RV B和RV C也常有發(fā)生，對我國養(yǎng)豬行業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。同時輪狀病毒可以在豬和人之間跨物種傳播，嚴(yán)重危害了我國公共衛(wèi)生安全[2]。

1 豬輪狀病毒形態(tài)及基因組結(jié)構(gòu)

RV屬于雙鏈RNA(dsRNA)病毒中的呼腸孤病毒科(Reoviridae)，因其獨有的車輪狀結(jié)構(gòu)而得名。RV無囊膜，在電鏡下類似球形，20面體對稱結(jié)構(gòu)，病毒粒子直徑約為70 nm。病毒粒子由三層蛋白衣殼組成，分別為外衣殼、內(nèi)衣殼及核衣殼。RV含有分節(jié)段的RNA基因組，由11個dsRNA片段組成，編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7及6個非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6[1-2]。病毒的中央為核芯髓，是一個電子致密的六角形核心，直徑約為40 nm，核衣殼由VP2及少量VP1、VP3蛋白組成。核芯髓周圍有一個電子透明層，病毒內(nèi)衣殼顆粒以此向外呈輻射狀排列，呈輻條狀，由VP6蛋白構(gòu)成。外周為由一層光滑薄膜組成的外衣殼，厚度約20 nm，由VP7和VP4兩種蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中VP7形成病毒的光滑表面，VP4形成病毒顆粒的尖峰[3]。病毒顆粒在電鏡下以三種形式存在，分別為具有傳染性的含完整雙層衣殼的實心光滑型顆粒(TLP)、不含外衣殼且僅含有內(nèi)衣殼的實心粗糙型顆粒(DLP)及缺失內(nèi)外雙層衣殼的核心顆粒(SLP/CLP)[1,3-4]。

2 流行病學(xué)

RV在全球范圍內(nèi)廣泛分布，常存在于不同地區(qū)的人類與動物種群中。相關(guān)流行病學(xué)研究表明，在豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)中，G3、G4、G5和G9是最常見的G基因型，通常與P[6]或P[7]基因型有關(guān)[5-6]。然而，豬群中也發(fā)現(xiàn)其它G和P基因型的存在，如G1、G2、G6、G8，G10和P[13]、P[19]、P[23]、P[27][7-13]。近幾十年來，世界各地對輪狀病毒進(jìn)行了廣泛的流行病學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了越來越多不常見的新基因型或輪狀病毒重組毒株，這些發(fā)現(xiàn)表明輪狀病毒在自然界中可能發(fā)生跨物種傳播[14-16]。2006年7月至2008年8月，泰國北部的131份糞便樣本拭子中PoRV A陽性率為10.7%，其中92.9%屬于罕見的P[23]基因型與G9或G3基因型組合[17]。Collins等[18]于2008年在愛爾蘭的仔豬中檢測到PoRV C，陽性率為4.4%，對VP7基因進(jìn)行序列分析，大多數(shù)毒株具有G1基因型，兩個毒株為G6基因型。Miyazaki[19]于2009年2月至2010年3月在日本糞便樣本中對PoRV A進(jìn)行了VP4及VP7序列分析，包括G3、G5、G9、P[7]、P[13]/[22]和P[23]基因型[19]。在中國主要以PoRV A最為常見，喬成鵬等應(yīng)用巢式PCR檢測方法對2015～2016 年我國東北三省地區(qū)進(jìn)行豬 A、B、C群輪狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查，在321份病料樣本中PoRV A陽性率為44.10%，PoRV B陽性率為2.75%，PoRV C陽性率為6.61%。Jeong等[20]于2006年在韓國6個城市收集137份糞便樣本，其中PoRV C陽性率為26.3%，表明PoRV C感染在韓國的腹瀉豬中廣泛存在[20]。Collins等[21]于2005～2007年進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查中在非腹瀉仔豬中檢測到了PoRV A，說明PoRV A可導(dǎo)致豬群無癥狀感染，有可能是由于母源性免疫和自然減毒毒株的存在導(dǎo)致無癥狀感染的發(fā)生[21]。

3 豬輪狀病毒細(xì)胞培養(yǎng)特性

RV雖然可以種間傳播，但毒株的嗜性很大程度具有種特異性，很難在細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖。Woode等在1974年首次從豬體內(nèi)分離出輪狀病毒，中國于1982年從腹瀉豬糞便中分離到輪狀病毒。研究發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)之前先用低濃度胰蛋白酶處理，經(jīng)胰酶剪切的病毒外殼蛋白VP3可促進(jìn)對細(xì)胞培養(yǎng)物的感染，適應(yīng)后病毒生長良好。關(guān)于輪狀病毒增殖培養(yǎng)的研究主要是來源于恒河猴腎上皮的MA104細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2和Caco-2中進(jìn)行[22]。MA104細(xì)胞是最適宜輪狀病毒增殖的細(xì)胞之一，10%小牛血清加高糖DMEM培養(yǎng)液可以滿足MA104細(xì)胞的生長需要。豬輪狀病毒在MA104細(xì)胞中最佳培養(yǎng)條件為5%CO2下37 ℃培養(yǎng)2～3 d。感染細(xì)胞傳代18 h后出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮融合、細(xì)胞核固縮、空泡化，染毒細(xì)胞出現(xiàn)大片脫落區(qū)域, 最后細(xì)胞死亡脫落，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞病變程度加深[23]。

4 豬輪狀病毒致病機制

RV主要靶細(xì)胞為小腸絨毛末端成熟上皮細(xì)胞。RV經(jīng)口感染后，排列在小腸絨毛頂部表面的成熟吸收上皮細(xì)胞上，感染從小腸上部發(fā)展到小腸下部，某些毒株感染至結(jié)腸。感染后，RV對上皮細(xì)胞造成破壞，導(dǎo)致小腸絨毛長度變短，密度降低，來自腸隱窩的未成熟細(xì)胞代替成熟細(xì)胞，從而引起吸收障礙、消化不良及滲透性腹瀉。RV會增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，破壞細(xì)胞骨架和緊密連接，增加細(xì)胞旁通透性。此外，RV還產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4，這是一種腸毒素，通過磷脂酶C(PLC)依賴機制誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子外流，進(jìn)一步導(dǎo)致電解質(zhì)失衡和分泌性腹瀉。輪狀病毒還可以通過NSP4依賴機制刺激腸道神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)一步促進(jìn)分泌性腹瀉和增加腸道動力。在感染過程的后期，輪狀病毒破壞成熟的腸細(xì)胞，進(jìn)一步導(dǎo)致吸收不良或滲透性腹瀉。在感染動物血液和全身器官中發(fā)現(xiàn)RV抗原、基因組RNA和感染性顆粒，全身性RV感染在疾病發(fā)病機制中的作用目前尚不清楚[1]。

病毒復(fù)制的早期階段，VP4蛋白在病毒附著和穿入靶細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用，經(jīng)胰酶裂解后產(chǎn)生VP5和VP8，與病毒的聚集有關(guān)，可提高病毒感染能力。有研究發(fā)現(xiàn)，VP4在病毒復(fù)制過程中與細(xì)胞不同的蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)相互作用，在病毒感染早期，細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)VP4蛋白的存在，推測其與微管、細(xì)胞脂質(zhì)筏、小分子GTP酶Rab5和異戊烯化Rab結(jié)合蛋白PRA1存在作用關(guān)系[24-25]。Li等[26]于2017年應(yīng)用串聯(lián)親和純化-質(zhì)譜分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)VP4與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的相互作用機制[26]。一些細(xì)胞表面分子如唾液酸、整聯(lián)蛋白、hsc70等可以作為輪狀病毒的受體或共同受體[22]。組織血型抗原介導(dǎo)輪狀病毒附著，此外，連接黏附分子JAM-A和緊密連接蛋白ZO-1等均在輪狀病毒進(jìn)入MA104細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[27-31]。感染后期，DLP組裝到病毒發(fā)生基質(zhì)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上駐留的糖蛋白VP7和胞質(zhì)蛋白VP4摻入DLP中，形成成熟的、有感染性的TLP[32]。

5 豬輪狀病毒臨床診斷技術(shù)

PoRV主要通過糞-口途徑傳播，可引起豬輪狀病毒病，多發(fā)于冬季和春季，癥狀嚴(yán)重程度受多方因素影響，如年齡、病毒毒株毒力強弱、是否有其它病原存在等，常表現(xiàn)為嘔吐、厭食、腹瀉。仔豬常因腹瀉引起脫水而死亡，育肥豬呈隱性感染，不表現(xiàn)出明顯癥狀。因臨床中常與豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎病毒等冠狀病毒及大腸桿菌等細(xì)菌性病原形成混合感染，使診斷難度加大，因此常通過實驗室診斷技術(shù)確診。

5.1 電子顯微鏡技術(shù)

應(yīng)用電子顯微鏡技術(shù)(electron microscopy，EM)可直觀地觀察病毒的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)，對病毒進(jìn)行快速鑒別診斷。若存在多種病毒混合感染時，只靠形態(tài)觀察很難區(qū)分，而且由于設(shè)備昂貴、技術(shù)需求較高，因此臨床上不能廣泛應(yīng)用，但在科學(xué)研究中可為病毒的分離鑒定提供重要依據(jù)。

5.2 病毒分離鑒定

研究發(fā)現(xiàn)，PoRV經(jīng)胰蛋白酶處理后可在MA104細(xì)胞、MARC-145細(xì)胞、Vero細(xì)胞與IEC-2細(xì)胞中進(jìn)行傳代生長，但病毒分離時間周期較長，費用較高，不適合在臨床診斷中推廣[33-35]。

5.3 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而對抗原進(jìn)行定位，該技術(shù)特異性強、敏感性高、檢測速度快，但需應(yīng)用熒光顯微鏡判定結(jié)果，主觀性較強，且實驗結(jié)果不能長期保存，限制了臨床中的應(yīng)用。

5.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked Immunosorbent assays，ELISA)利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)，反應(yīng)快速靈敏，可進(jìn)行定性和定量，直接檢測病毒的大致含量，在臨床中應(yīng)用較為廣泛。

5.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)可擴增特定的DNA片段，該方法具有特異性強、靈敏性高、檢測速度快的優(yōu)點，可在獸醫(yī)臨床上進(jìn)行推廣。

6 豬輪狀病毒防治措施

6.1 預(yù)防措施

用于PoRV防控的疫苗包括減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗等。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬消化道傳染病創(chuàng)新團(tuán)隊于2015年發(fā)明了豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5 型)三聯(lián)活疫苗(弱毒華毒株+弱毒 CV777 株+NX 株)，使我國豬病毒性腹瀉病得到精準(zhǔn)防控，減少了極大的經(jīng)濟(jì)損失。Park等[36]于2019年發(fā)表了關(guān)于針對韓國流行毒株G8P[7] 174-1、G9P[23] PRG942和G5P[7] K71的減毒三價豬輪狀病毒活體疫苗的研究，可更好地控制韓國及流行毒株類似國家的豬輪狀病毒病[36]。Wen等[37]將破傷風(fēng)類毒素通用CD4+T細(xì)胞表位P2引入PoRV P[6]或P[7]特異性截短VP8*重組亞單位蛋白中，使免疫原性得到增強。Yu等[38]將PoRV VP6基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯基因組中，用含有VP6衣殼蛋白的轉(zhuǎn)化馬鈴薯瘤組織口服免疫CD-1小鼠，成功產(chǎn)生抗VP6血清IgG和腸道IgA抗體效價，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。病毒樣顆粒(VLP)沒有病毒核酸，避免了病毒復(fù)制帶來的一些副作用，但El-Attar等研究發(fā)現(xiàn)，與豬輪狀病毒疫苗相比，VLP疫苗在病毒感染時具有部分保護(hù)作用，但誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答不足以完全抵抗輪狀病毒的攻擊，但前景較好，還需深入研究[39]。

6.2 治療措施

目前針對PoRV還沒有特異性治療藥物，藥物研發(fā)應(yīng)從抑制病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡、提高動物免疫力、保護(hù)腸黏膜等方面進(jìn)行。豬場還應(yīng)加強飼養(yǎng)管理，遵循防大于治的原則，做好消毒工作，保證圈舍干燥衛(wèi)生，使初生仔豬吃到初乳，增強免疫力。若發(fā)現(xiàn)發(fā)病豬，應(yīng)隔離發(fā)病豬，及時補液，防止脫水。

7 結(jié) 語

長期以來，仔豬腹瀉病一直是養(yǎng)豬行業(yè)的一大難題，對輪狀病毒進(jìn)行有效防治是減小損失、提高效益的有效手段。盡管目前已有多種安全有效的RV疫苗，但未能完全解決仔豬因RV感染所引起的嚴(yán)重腹瀉疾病。RV發(fā)病機制及病毒與宿主間相互作用的許多關(guān)鍵因素尚未得到充分的了解，從而阻礙了改進(jìn)疫苗和有效抗病毒療法的發(fā)展。特別是RV進(jìn)入目標(biāo)宿主細(xì)胞后所進(jìn)行的一系列基因調(diào)控，值得進(jìn)一步研究。