譚鋮，羅洪斌,2*，黃勝

(1 湖北民族大學(xué) 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實驗室 & 醫(yī)學(xué)部，恩施 445000；2 湖北民族大學(xué) 神經(jīng)精神共患病研究所，恩施 445000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一種發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)退行性疾病.隨著社會老齡化進(jìn)程的加快，AD發(fā)病率和發(fā)病人數(shù)急劇上升，目前我國65歲以上的老年人發(fā)病率大約在4.8%[1]，且AD的發(fā)病率隨著年齡的增長而升高，已成為嚴(yán)重威脅老齡人群身心健康的常見疾病.由于記憶力及智力衰退，AD患者生活不能自理，晚期幾乎完全需要他人護(hù)理，給社會和家庭帶來了沉重負(fù)擔(dān)和極大痛苦[1].

目前，臨床上治療阿爾茨海默病的藥物主要有乙酰膽堿酯酶抑制劑，谷氨酸受體抑制劑等.這些藥物可緩解認(rèn)知功能下降所引發(fā)的癥狀，但無法從根本上消除病因[2].因此，尋找更為有效的AD治療藥物就顯得格外重要.

中醫(yī)學(xué)是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)寶庫，在防治疾病方面具有不可替代的優(yōu)勢，很多中藥的潛在治療作用正在挖掘并得到有效應(yīng)用.中醫(yī)學(xué)中AD被稱為“癡呆”，又名呆病.其病位在腦，與心肝脾腎關(guān)系密切，基本病機(jī)為髓海空虛，元神失養(yǎng)[3].臨床分期常依據(jù)癥狀分為平臺期、波動期、下滑期.中醫(yī)治療老年癡呆的論治主要體現(xiàn)于補(bǔ)腎健脾、養(yǎng)心安神[4].近年來，許多基于中醫(yī)理論研制出來的中藥單體或復(fù)方制劑常通過多組分作用和多靶點(diǎn)方式來治療AD等疾病，取得了良好的治療效果，如傳統(tǒng)中藥千層塔有效成分石杉堿甲就已廣泛應(yīng)用于AD等神經(jīng)退行性疾病的早期治療[4]，這與中醫(yī)理論強(qiáng)調(diào)整體觀來治療疾病與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論高度契合.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)、多元藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科知識[5]并通過分析藥物的有效成分，映射疾病相關(guān)靶點(diǎn)，利用多靶點(diǎn)、多通路與疾病的相互作用形成可視化網(wǎng)絡(luò)，在探索治療途徑，明確藥物療效特別是尋找藥物有效成分方面具有非常重要的作用，與中醫(yī)理論所強(qiáng)調(diào)的整體觀高度吻合.近年來，國內(nèi)眾多學(xué)者利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究了許多中藥材的有效成分及治療疾病的靶點(diǎn)、機(jī)制，為許多疾病的藥物開發(fā)提供了新的思路.黃斌等[6]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了藥物頭頂一顆珠治療阿爾茨海默病的可行性，驗證了頭頂一顆珠可通過抑制乙酰膽堿酯酶活性、促進(jìn)神經(jīng)元及突觸發(fā)育等機(jī)制改善AD的發(fā)展.時悅等[7]研究預(yù)測了開心散緩解AD可能與抑制乙酰膽堿酯酶活性、抑制Tau的過度磷酸化等相關(guān).說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在探討中藥治療AD的有效成分及其作用分子機(jī)制方面具有非常重要的預(yù)測作用.

首烏藤(PolygnimultifloriCaulis)，又名夜交藤，為蓼科植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb.)的藤莖，性平，味甘.具有養(yǎng)血安神、祛風(fēng)通絡(luò)之功效，屬養(yǎng)心安神藥.臨床上常用于治療失眠夢多、血虛身痛等[8].針對處于波動期的癡呆患者，中醫(yī)常使用含首烏藤的天麻鉤藤飲進(jìn)行治療，其治法治則主要為清心平肝、安神定志，從而緩解健忘顛倒及認(rèn)知損害[9].劉瓊麗等發(fā)現(xiàn)首烏藤能通過調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶等緩解小鼠腦的氧化應(yīng)激損傷[10]，而氧化應(yīng)激又是AD可能的發(fā)病機(jī)制之一.因此，首烏藤具有治療AD的潛在作用，有必要借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)研究方法深入研究探討該藥物治療AD的有效成分及其作用分子機(jī)制.

鑒于此，本文擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)知識，篩選首烏藤有效成分，確定其映射AD疾病的靶點(diǎn)及相關(guān)細(xì)胞信號通路，探究其有效成分及其治療AD的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 首烏藤有效成分篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid/)檢索首烏藤的化合物成分，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道對其有效成分進(jìn)行補(bǔ)充.按照生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%對所獲得的化合物進(jìn)行初步篩選.在Pub Chem數(shù)據(jù)庫對首烏藤的有效成分進(jìn)行檢索，獲得每個成分的Canonical SMILES格式，將SMILES號依次導(dǎo)入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫中，對所分析的化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的生物活性分子靶點(diǎn)預(yù)測，在物種選擇為人類的基礎(chǔ)上將結(jié)果導(dǎo)出.

1.2 AD疾病靶點(diǎn)的獲取

以“Alzheimer′s disease”為關(guān)鍵詞在TTD數(shù)據(jù)庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(https://www. genecards. org)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)對其(即AD)進(jìn)行檢索，對檢索到AD的已知潛在靶點(diǎn)進(jìn)行匯總，同時刪除重復(fù)靶點(diǎn).在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索所得到的靶點(diǎn)按照大于Score值進(jìn)行篩選，而Score大小與靶點(diǎn)的密切程度成正相關(guān).再將最終所得靶點(diǎn)基因在Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)中進(jìn)行基因的標(biāo)準(zhǔn)化.

1.3 首烏藤-AD疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將檢索并篩選到的首烏藤有效成分進(jìn)行簡稱命名，分別由SWT1-SWTn表示.將首烏藤成分潛在作用靶點(diǎn)信息與AD的疾病相關(guān)靶點(diǎn)信息均導(dǎo)入EXCEL中，保留其共有靶點(diǎn)，去除其他靶點(diǎn).整理后導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中進(jìn)行首烏藤-AD疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，并對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析.將每個節(jié)點(diǎn)的顏色按照自由度進(jìn)行漸變，顏色的深淺與該節(jié)點(diǎn)的重要程度呈正相關(guān).

1.4 首烏藤成分-AD靶點(diǎn)與通路的富集分析

DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)是一個基因功能在線注釋平臺，它能對所分析的基因進(jìn)行系統(tǒng)提取，展現(xiàn)其所涉及的疾病、蛋白、通路以及進(jìn)行GO、KEGG的功能注釋與富集分析，能幫助研究者從分子層面更加深入地了解基因之間的富集關(guān)系[11].將首烏藤作用于AD的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入到DAVID平臺，對其進(jìn)行GO與KEGG的分析，對導(dǎo)出的結(jié)果進(jìn)行表格整理與圖形可視化，以便后續(xù)分析討論.

1.5 首烏藤成分-AD靶點(diǎn)-重要信號通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape3.7.2構(gòu)建首烏藤成分-AD靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步分析其活性成分、作用靶點(diǎn)及信號通路之間的相互作用關(guān)系.

2 結(jié)果與分析

2.1 首烏藤有效成分及靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫、TCMID數(shù)據(jù)庫以及文獻(xiàn)[12-13]報道初步提取出首烏藤有效成分53種，經(jīng)OB限定篩選后得到活性成分14種，分別以SWT1-SWT14表示(見表1)，其中BBB(blood brain barrier)值用于衡量分子對血腦屏障的通透性，BBB<-0.3的化合物通透性差，BBB介于-0.3～0.3則具有中等通透性，BBB>0.3則具有強(qiáng)穿透性[14].將14種化合物在Swiss Target Prediction中進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測后得到成分作用靶點(diǎn)383個.

表1 首烏藤潛在活性化合物基本信息Tab.1 Basic information of potential active compounds of Polygni multiflori Caulis

2.2 AD相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

利用TTD、Drugbank、Genecards及OMIM數(shù)據(jù)庫對AD進(jìn)行檢索，對于Genecards數(shù)據(jù)庫按照score值大小選擇相關(guān)性較高的靶點(diǎn)，刪去重復(fù)靶點(diǎn)最終得到靶點(diǎn)228個.

2.3 首烏藤成分-AD疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將首烏藤有效成分潛在作用靶點(diǎn)與AD疾病相關(guān)的靶點(diǎn)導(dǎo)入Excel進(jìn)行比較，保留其中共有的靶點(diǎn)并繪制韋恩圖，得到首烏藤成分-AD共同靶點(diǎn)50個(見圖1).

圖1 首烏藤成分-AD靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn map of Polygni multiflori Caulis component and AD target

而首烏藤成分-AD共有的50個靶點(diǎn)具體信息見表2.進(jìn)而將首烏藤成分-AD靶點(diǎn)對應(yīng)信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，繪制首烏藤成分-AD靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2.

圖2 首烏藤成分-AD疾病靶點(diǎn)圖Fig.2 Disease target map of Polygni multiflori Caulis compatibility ingredients-AD 注：邊形代表首烏藤；菱形代表首烏藤有效成分；圓形代表首烏藤與AD共同作用的靶點(diǎn)；節(jié)點(diǎn)顏色隨自由度漸變，顏色越深則其在網(wǎng)絡(luò)中越重要

表2 首烏藤映射AD疾病的共同靶點(diǎn)的相關(guān)名稱Tab.2 Related names of Polygni multiflori Caulis mapping the common target of AD

表2(續(xù))

2.4 GO過程富集分析

DAVID平臺進(jìn)行GO功能富集分析后共得到GO條目185個，其中生物過程(biological process, BP)條目117個，細(xì)胞組分(cellular component, CC)條目32個，分子功能(molecular function, MF)條目36個.按照分析數(shù)據(jù)中錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.01進(jìn)行限定，得到的BP、CC、MF組分如表3所示.而GO功能分析結(jié)果見圖3.

表3 GO分析項目信息Tab.3 Information of GO analysis

圖3 首烏藤與AD疾病潛在靶點(diǎn)GO功能分析Fig.3 GO function analysis map of Polygni multifloriCaulis and AD potential target

2.5 KEGG通路分析

2.5.1 KEGG信號通路富集分析結(jié)果

在DAVID平臺進(jìn)行KEGG富集分析后共得到KEGG信號通路21條.將得到的21條信號通路按FDR<0.05限定進(jìn)行篩選，得到篩選后的信號通路共3條，按FDR從小到大的順序排列，見表4.

表4 首烏藤作用于AD的KEGG信號通路信息Tab.4 Information of the signal pathways by KEGG ofPolygni multiflori Caulis acting on AD

2.5.2 成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將KEGG信號通路分析所得到的FDR<0.05的信號通路進(jìn)行整理，獲取其相關(guān)的靶點(diǎn)信息.將首烏藤成分、信號通路、相關(guān)靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)-重要通路網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4.

圖4 首烏藤與富集所得通路共同映射的成分靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Target maps and disease target maps mapped together in the compatibility of Polygni Multiflori Caulis注:藍(lán)色代表信號通路；黃色代表首烏藤成分；桃紅色代表信號通路與成分疾病共同靶點(diǎn)基因

2.6 首烏藤與AD共同作用靶點(diǎn)-重要信號通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將與AD相關(guān)的血清素能突觸信號通路、鈣信號通路、神經(jīng)配體-受體相互作用信號通路單獨(dú)與藥物疾病共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，見圖5.重要信號通路及其對應(yīng)的基因見表5.

圖5 首烏藤成分與AD共同作用靶點(diǎn)-重要信號通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Network map of targets and important pathways in combination of Polygni multiflori Caulis and AD注：藍(lán)色代表重要信號通路；桃紅色代表成分疾病共同靶點(diǎn)基因

表5 AD相關(guān)重要通路對應(yīng)靶點(diǎn)信息Tab.5 Information of targets of AD-related important signal pathways

3 討論

到目前為止，AD病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，一般認(rèn)為遺傳因素、免疫因素、環(huán)境因素等在內(nèi)的多種因素都參與致病.AD的發(fā)病機(jī)制主要有β淀粉樣蛋白(beta-amyloid, Aβ)學(xué)說、Tau過度磷酸化學(xué)說、神經(jīng)血管學(xué)說、膽堿能學(xué)說、免疫炎癥學(xué)說以及氧化應(yīng)激學(xué)說等多種學(xué)說[15-17].其主要病理表現(xiàn)為腦組織中的老年斑(senile plaque, SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle, NFT)、大量營養(yǎng)不良性神經(jīng)炎及神經(jīng)元功能受損，其最主要的臨床癥狀為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)精神和行為學(xué)功能失調(diào)，以致最終喪失生活能力為主要臨床表現(xiàn).其中老年斑主要由毒性Aβ在神經(jīng)細(xì)胞外聚集引起；NFT主要以雙螺旋絲(paired helical filaments, PHFs)樣結(jié)構(gòu)存在.已有研究表明：一過性的Tau蛋白磷酸化對神經(jīng)具有保護(hù)作用，而異常過度磷酸化的Tau蛋白可形成雙螺旋絲樣結(jié)構(gòu)，構(gòu)成NFT[18].Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，它能與微管蛋白結(jié)合促進(jìn)其聚合形成微管.而Tau蛋白與管蛋白結(jié)合成為微管蛋白可作為微管組裝早期的核心，進(jìn)而促進(jìn)其他微管蛋白在此核心上延伸聚集形成微管參與各種生理活動[19].

在AD的發(fā)病過程中涉及多因素、多機(jī)制以及多條細(xì)胞信號通路的參與.而目前臨床上治療AD療效顯著的藥物則報道不多，現(xiàn)有臨床藥物多僅能緩解輕中度AD的臨床癥狀且作用機(jī)制單一.而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、信息學(xué)等多個學(xué)科綜合而成的研究方法，能對多組分、多靶點(diǎn)、多通路進(jìn)行分析，且與中醫(yī)用藥的整體性有很大的相似性，適合用于研究AD這類多因素致病的疾病[20].

本文篩選得到首烏藤有效成分14種，其中8種成分對血腦屏障有著較好的通透性，6種成分則通透性較低.首烏藤有效成分與AD疾病共同作用的靶點(diǎn)為50個，占總AD相關(guān)靶點(diǎn)(228個)的21.93%，首烏藤對AD靶點(diǎn)的映射率較好.因此首烏藤能通過多個靶點(diǎn)作用于AD并可產(chǎn)生較好的防治作用.

對首烏藤成分-成分疾病作用靶點(diǎn)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)后，得到自由度最高的前4個基因節(jié)點(diǎn)分別為ACHE、ADORA2A、ESR2、MAOA.這4種基因所表達(dá)的蛋白廣泛參與AD的發(fā)病發(fā)生發(fā)展過程中.目前認(rèn)為：ACHE是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中抗AD最常用的藥物靶點(diǎn)之一，ACHE的表達(dá)產(chǎn)物為乙酰膽堿酯酶(AChE).臨床上常使用AChE抑制劑治療AD，其作用機(jī)制主要是抑制AChE以減少突觸間隙中乙酰膽堿的失活，從而提高乙酰膽堿水平，促進(jìn)膽堿能神經(jīng)的傳遞，以此改善AD患者的認(rèn)知功能[21].在首烏藤有效成分中SWT1、SWT2、SWT5、SWT6、SWT8、SWT9、SWT11、SWT14均可對ACHE基因產(chǎn)生影響.因此，通過抑制AChE可能是首烏藤防治AD的作用機(jī)制之一.

腺苷是人體內(nèi)重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，近年研究表明：腺苷的受體功能失衡參與了AD的發(fā)病.在AD患者腦中腺苷A1受體(ADORA1)表達(dá)減少而腺苷A2A受體(ADORA2A)過度表達(dá)，且ADORA1介導(dǎo)的抑制作用減弱，ADORA2A介導(dǎo)的興奮作用增強(qiáng)，通過各自的信號通路引起相應(yīng)神經(jīng)病理變化，從而導(dǎo)致AD的發(fā)生[22].首烏藤可能從降低ADORA2A的表達(dá)進(jìn)而恢復(fù)受體功能失衡這一層面影響并發(fā)揮了治療AD的發(fā)生.

ESR2基因編碼能產(chǎn)生雌激素受體β(ERβ).而ERβ與其另外一個亞基雌激素受體α(ERα)在人體內(nèi)分布有差異，其發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)也不完全相同.研究表明：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中ERβ有較高豐度的表達(dá)，而ERα低表達(dá)或無表達(dá)[23-24].在中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的局部雌激素與AD的發(fā)生密切相關(guān)，其功能可能為促進(jìn)大腦海馬區(qū)樹突棘的發(fā)育、拮抗毒性Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)元毒性以及影響Tau的磷酸化水平進(jìn)而延緩AD的發(fā)生發(fā)展[25].因此，首烏藤可能通過影響ESR2基因表達(dá)，進(jìn)而提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部ERβ的豐度從而達(dá)到治療AD的作用.

在AD的發(fā)病機(jī)制中，毒性Aβ除了可聚集形成老年斑之外，還參與到其他多條發(fā)病機(jī)制當(dāng)中.如毒性Aβ可作用于神經(jīng)細(xì)胞膜，引發(fā)鈣超載，細(xì)胞內(nèi)Ca2+大量增多會激活單胺氧化酶A(MAO-A)，MAO-A可產(chǎn)生過氧化物和自由基，造成對神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損害[26].因此，針對MAO-A的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)以減少氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的神經(jīng)損傷可能是首烏藤治療AD的可能機(jī)制之一.

KEGG通路富集分析篩選后得到3條重要通路，即血清素能突觸信號通路、Ca2+信號通路以及神經(jīng)配體-受體相互作用信號通路.神經(jīng)配體-受體相互作用信號通路與AD的發(fā)生密切相關(guān)，該通路的調(diào)節(jié)主要利用5-HT、ACh、多巴胺、GABA等神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)作為前體物質(zhì)，進(jìn)而影響后續(xù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[27].

血清素即5羥色胺(5-HT)，血清素能系統(tǒng)與AD的發(fā)病也密切相關(guān).研究表明，5-HT4及5-HT6受體(即5-HT receptor 6, 5-HTR6)參與了Tau蛋白過度磷酸化的過程[28].而5-HTR6與配體結(jié)合可激活M1R介導(dǎo)的信號通路，以減少毒性Aβ的沉積.此外，長期使用5-HT4受體的激動劑可使AD模型小鼠腦內(nèi)毒性Aβ沉積減少，神經(jīng)纖維纏結(jié)與老年斑形成下降，Aβ導(dǎo)致的氧化應(yīng)激所帶來的損傷也相應(yīng)得到緩解[29].而5-HT7受體的激活能對海馬神經(jīng)元的凋亡產(chǎn)生抑制作用，并使突觸的可塑性增強(qiáng)[30].進(jìn)一步探索首烏藤是否能通過激活血清素能受體從而延緩AD的發(fā)生也是一個重要的思路.

Ca2+信號通路與機(jī)體各種疾病的發(fā)生發(fā)展都密切相關(guān).在AD中，Ca2+能與毒性Aβ協(xié)同促進(jìn)AD發(fā)生，而毒性Aβ導(dǎo)致的鈣超載能刺激細(xì)胞產(chǎn)生更多的氧自由基，加重神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷.同時，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的失衡還會加速毒性Aβ的聚集，進(jìn)一步促進(jìn)AD的發(fā)生[31].經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)首烏藤有12種有效成分都能通過鈣信號通路來達(dá)到治療AD的目的.

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探索了首烏藤治療AD的作用靶點(diǎn)及其可能的作用機(jī)制，證明了中草藥首烏藤具有多種活性成分，能通過影響多個靶點(diǎn)、多條信號通路的方式作用于AD疾病發(fā)生過程中的各個病理生理學(xué)過程，從而達(dá)到治療AD或延緩其發(fā)生發(fā)展的作用.其具體機(jī)制可能主要與上調(diào)ACh水平、抑制Aβ形成、抑制鈣超載與氧化應(yīng)激、增強(qiáng)突觸可塑性等有關(guān).本文可為后續(xù)的實驗設(shè)計和研究思路提供一定的理論依據(jù)和研究思路，所分析的首烏藤治療AD重要靶點(diǎn)基因及其重要信號通路，還需進(jìn)一步的細(xì)胞實驗和動物實驗進(jìn)行驗證.