熊唯琛，柴金為，吳潔娜，田茂林，盧萬成，徐學(xué)清

南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515

致病菌的耐藥性已經(jīng)對人類的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅，因此發(fā)現(xiàn)一類不容易產(chǎn)生抗性的新型抗生素至關(guān)重要，抗菌肽（AMPs）則是最有希望的候選者之一［1,2］。從細(xì)菌到哺乳動物產(chǎn)生的各種天然AMPs是宿主防御的先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，這些通常由少于100個氨基酸組成的AMPs已顯示出對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、病毒和真菌等具有殺滅能力［3,4］。兩棲動物的皮膚是AMPs的重要來源，迄今已從兩棲動物皮膚中分離并鑒定出約100種抗菌肽家族［5］。Brevinins家族是最為常見的AMPs之一，具有線性、兩親性和陽離子等特性，這些特性使得多肽可以與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，導(dǎo)致膜功能障礙，最終抑制細(xì)菌生長或使其死亡［6］。然而，由于AMPs的靶標(biāo)位于細(xì)胞膜上，它們有時也會攻擊宿主細(xì)胞，這也是其觀察到細(xì)胞毒性和溶血活性的主要原因［7］。如從Hylarana guentheri中鑒定的brevinin-1GHa和從Amolops hainanensis中分離得到的brevinin-1H具有強(qiáng)大的廣譜抗菌活性，但同時也具有較強(qiáng)的溶血作用［8,9］。因此從brevinins家族中發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性且細(xì)胞毒性較低的AMPs對臨床應(yīng)用具有重要意義。

澤陸蛙是一種分布廣泛的兩棲動物，但目前僅從中發(fā)現(xiàn)了一種凝集素樣多肽Fejerlecin，因此還有更多具有生物活性的多肽有待發(fā)掘［10］。本研究構(gòu)建了澤陸蛙皮膚cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)其中包含兩棲動物brevinins家族的brevinin-2子家族抗菌肽Brevinin-2GHk（BR2GΚ）。BR2GΚ 的截短肽被報道具有有效的抗菌活性，但BR2GΚ的活性和作用機(jī)制尚未明確［11］。本研究測試發(fā)現(xiàn)BR2GΚ具有較強(qiáng)的體外抗菌活性，且無溶血作用。此外還對其作用機(jī)制進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成具有更強(qiáng)抗菌活性和更低細(xì)胞毒性的抗菌肽提供了指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 抗菌肽與菌株

澤陸蛙皮膚cDNA文庫由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建與保存；抗菌肽BR2GΚ由上海吉爾生化有限公司合成，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）純化，純度≥95%，相對分子質(zhì)量由快原子轟擊質(zhì)譜法確定。大腸桿菌（Escherichia coli,E.coli,ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus,ATCC 25923）、痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes,P.acnes,ATCC 6919）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis,B.subtilis,CMCC 63501）和白色念珠菌（Candida albicans,C.albicans,ATCC 10231）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

戊二醛，多聚甲醛，脂多糖（LPS,Sigma），SDS、NaCl（Macklin），細(xì)胞活性測定試劑盒（Thermo Fisher Scientific），總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS和FRAP法）、一氧化氮檢測試劑盒（Beyotime）。

1.3 圓二色譜測定

Jasco-810圓二色譜儀用于分析BR2GΚ在溶劑環(huán)境中的二級結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。將BR2GΚ分別經(jīng)下述條件處理：用不同濃度的SDS溶液（0、30、60、90、120 mmol/L）或60 mmol/L的SDS溶液和不同濃度的NaCl（0、100、200、400 mmol/L）分別溶解多肽，然后測定CD光譜；用60 mmol/L SDS溶解BR2GΚ，然后在不同溫度（25、37、50、70、90 ℃）下孵育1 h，然后測定CD光譜。上述多肽的終濃度均為100 μmol/L，每個樣品連續(xù)掃描3次取均值，并減去溶劑信號。CD數(shù)據(jù)用平均殘留橢圓度（θ）表示，單位為deg·cm2·dmol-1。

1.4 BR2GΚ抗菌活性測定

如前所述，采用二倍稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）［12］。96孔板中加入50 μL系列稀釋的多肽，并加入等體積的濃度為106CFU/mL的細(xì)菌。37 ℃培養(yǎng)12 h后，使用酶標(biāo)儀測定600 nm處吸光度A600nm以確定多肽的MIC。分別取培養(yǎng)后96孔板中培養(yǎng)液10 μL涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，無菌落生長濃度為MBC。

1.5 膜滲透性和形態(tài)變化分析

通過共聚焦激光掃描顯微鏡（LSCM）和掃描電子顯微鏡（SEM）探索BR2GΚ對幾種細(xì)菌可能的作用機(jī)制。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌與終濃度為4×MIC的多肽在37 ℃下孵育30 min。將細(xì)胞活性測定試劑盒中的SYTO9和碘化丙啶（PI）添加到處理過的細(xì)胞中，并在室溫下避光保存30 min。使用共聚焦激光掃描顯微鏡（Leica TCS SP5；Leica Microsystems）對染色的細(xì)胞進(jìn)行觀察。具有完整膜的活細(xì)菌被SYTO9染色，并發(fā)出綠色熒光，而膜受損的死細(xì)菌被PI染色，發(fā)出紅色熒光。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌與終濃度為4×MIC的BR2GΚ在37 ℃下孵育30 min，1000 r/min離心10 min，棄上清，細(xì)菌沉淀用6%戊二醛固定4 h，乙醇梯度脫水并真空干燥過夜，鍍金后通過S-4800掃描電子顯微鏡（Hitachi）對樣品進(jìn)行分析。

1.6 BR2GΚ對紅細(xì)胞作用的測定

使用2%的小鼠紅細(xì)胞和U型96孔板測定BR2GΚ對紅細(xì)胞的作用。二倍稀釋的BR2GΚ（0.3125～40μmol/L）與2%的紅細(xì)胞懸液在室溫下孵育2 h后進(jìn)行觀察。PBS、刀豆蛋白A（ConA）和Triton X-100分別作為空白、凝集和溶血對照。

1.7 等溫滴定量熱（ITC）實(shí)驗(yàn)

BR2GΚ 和LPS 溶解在pH 7.2 的50 mmol/L PBS中，真空脫氣。滴定針中的BR2GΚ（1 mmol/L）在25 ℃下分37次注射到樣品池中的LPS（50 μmol/L）溶液中，滴定1 μL/次，每次注射持續(xù)時間為2 s，中間間隔90 s，攪拌速度為1000 r/min，選擇高反饋模式。使用MicroCal PEAQ-ITCAnalysis軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.8 表面等離子共振成像（SPRi）分析

將BR2GΚ（2 mmol/L）點(diǎn)樣到gold SPRi芯片表面，4 ℃孵育過夜，然后用5%脫脂牛奶封閉過夜。使用不同濃度的LPS（25、50、100 μmol/L）流經(jīng)芯片表面。每次結(jié)合解離過程結(jié)束后，使用重生液沖洗芯片表面。所得數(shù)據(jù)在Plexera SPRi系統(tǒng)上通過SPR Ⅴ3軟件進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測分析與實(shí)時監(jiān)控。

1.9 BR2GΚ體外抗氧化活性測定

參照文獻(xiàn)方法檢測BR2GΚ 的總抗氧化能力（FRAP 法）、NO 清除能力、DPPH 自由基清除能力和ABTS自由基清除能力，按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行測定。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用One-way ANOⅤA分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽BR2GΚ的合成

BR2GΚ的成熟肽序列為含33個氨基酸的短肽，并包含一個由兩個半胱氨酸構(gòu)成的二硫鍵（圖1A）。理論等電點(diǎn)和相對分子質(zhì)量分別為9.79和3.39 kDa。多肽經(jīng)HPLC純化，質(zhì)譜法確定（圖1B，C），并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 BR2GΚ的鑒定和表征Fig.1 Identification and characterization of BR2GK.A:cDNA and deduced amino acid sequence of BR2GK.The signal peptide is shaded in gray and followed by an acidic spacer domain with KR residues at the end(in red bold).The stop codon is indicated with an asterisk(*),and the sequence of mature fejerlectin is boxed.B:Purity of synthesized BR2GK detected by HPLC.C:Relative molecular mass of synthesized BR2GK confirmed by mass spectrometry.

2.2 圓二色譜分析

為確定不同溶液環(huán)境對BR2GΚ結(jié)構(gòu)的影響，測定BR2GΚ 在不同溶液中的圓二色譜。溶解在水中BR2GΚ的圓二色譜在200 nm處有一個負(fù)峰（圖2A），顯示BR2GΚ在水中呈現(xiàn)無規(guī)則螺旋構(gòu)象。而溶解在模擬細(xì)胞膜環(huán)境的SDS溶液中的BR2GΚ的圓二色譜在195 nm處有明顯的正峰，并在208和222 nm處有雙負(fù)峰，顯示此時多肽的二級結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋，且在60～120 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，隨著SDS濃度的增加，圖譜變化較小。同樣，在60 mmol/L SDS 中，即使還存在400 mmol/L NaCl，BR2GΚ 的主要α-螺旋結(jié)構(gòu)仍然保留。然而在不同溫度處理下，BR2GΚ的圓二色譜顯示出了較大的差異（圖2）。

2.3 抗菌活性測定

通過測定MIC和MBC研究BR2GΚ的抗菌作用，結(jié)果顯示，BR2GΚ對所測試的革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌均表現(xiàn)出有效的抗菌活性，其中，BR2GΚ對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，MIC為2.76 μmol/L（表1）。

表1 BR2GΚ的抗菌活性Tab.1 Antimicrobial activities of BR2GK

2.4 BR2GΚ對細(xì)胞膜的影響

通過LSCM和SEM觀察BR2GΚ對細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響，結(jié)果顯示，完整的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌被SYTO9染成綠色，受損的細(xì)胞則被PI染成紅色，與未經(jīng)處理的對照組相比，BR2GΚ處理90 min后，紅色細(xì)菌數(shù)量明顯增加（圖3A）。與SYTO9和PI染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，SEM觀察顯示，BR2GΚ處理后的細(xì)菌與未經(jīng)處理的對照組形態(tài)具有顯著區(qū)別。對照組大腸桿菌和金黃色葡萄球菌顯示出正常的形態(tài)和光滑的表面，在給藥組中則觀察到明顯的細(xì)菌腫漲、收縮和變形，并觀察到從膜中滲出大量內(nèi)容物（圖3B）。對紅細(xì)胞作用的測定顯示BR2GΚ對紅細(xì)胞具有一定的凝集活性而不會導(dǎo)致溶血（圖3C）。

圖3 BR2GΚ對細(xì)胞膜的影響Fig.3 Effect of BR2GK on cell membrane of E.coli and S.aureus.A:Confocal laser scanning microscopy of E.coli and S.aureus.B:Scanning electron microscopy of E.coli and S.aureus.C:Effect of BR2GK on erythrocyte membrane.The first row shows the effect of BR2GK on erythrocyte membrane at concentrations between 40 and 0.3125 μmol/L.The third row shows the hemagglutination activity of the control drug ConA at concentrations between 125 and 0.9766 μg/mL.The fourth row shows the hemolytic activity of Triton X-100 at concentrations between 1‰-0.0078‰.

2.5 BR2GΚ的結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用I-TASSER 服務(wù)器預(yù)測了BR2GΚ 的結(jié)構(gòu)（圖4A），該模型顯示BR2GΚ 具有高度螺旋結(jié)構(gòu)，與圓二色譜的結(jié)果相一致。通過TM-align 模塊識別，BR2GΚ 的結(jié)構(gòu)與PBD 數(shù)據(jù)庫中的三聚體TolC 蛋白（PBD ID:1TQQ）中的一段序列具有較高的相似度（圖4B）。

圖4 BR2GΚ的結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of BR2GK.A:3D structure prediction of BR2GK using I-TASSER program.B:Similar structure of BR2GK(red)to TolC(green).

2.6 BR2GΚ與LPS結(jié)合

使用ITC檢測BR2GΚ與LPS的結(jié)合親和力和熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果顯示，開始滴定時，顯示出了較大的信號，隨著滴定的進(jìn)行，信號有明顯減小的趨勢，并最終趨于平穩(wěn)，且始終為負(fù)值（圖5A），另外BR2GΚ和LPS相互作用過程的ΔG＜0。通過平衡解離常數(shù)測定的結(jié)合親和力ΚD為18.2±0.8 μmol/L，顯示兩者具有較強(qiáng)的相互所用。與之相一致，SPRi的結(jié)果進(jìn)一步證明了BR2GΚ和LPS的結(jié)合反應(yīng)（圖5B）。

圖5 BR2GΚ和LPS的結(jié)合Fig.5 Binding of BR2GK to LPS.A:ITC analysis of binding of BR2GK to LPS in 10 mmo/L PBS at 25 ℃.The upper panel displays thermal changes of each injection as a function of time.The lower panel displays a plot of enthalpy change per injection as a function of ligand/target molar ratio.B:SPRi analysis of direct binding of LPS to immobilized BR2GK.

2.7 BR2GΚ的體外抗氧化活性

使用FRAP 法測定總抗氧化活性結(jié)果顯示，BR2GΚ以濃度依賴的方式表現(xiàn)出有效的抗氧化活性（P＜0.01，圖6A）。測定BR2GΚ對NO的清除能力結(jié)果顯示，BR2GΚ同樣以濃度依賴的方式清除NO（P＜0.01，圖6B）。BR2GΚ對ABTS和DPPH自由基清除的反應(yīng)快速，當(dāng)濃度為40 μmol/L 時，在1 min 內(nèi)分別清除了73.51%的ABTS和90.32%的DPPH（圖6C，D）。

圖6 BR2GΚ的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activities of BR2GK.A:Total antioxidant capacity of BR2GK assessed using the FRAP method.B:Effect of BR2GK on NO scavenging.C:ABTS radical scavenging activity of BR2GK.D:DPPH radical scavenging activity of BR2GK.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group.

3 討論

本研究從澤陸蛙皮膚cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)并合成了brevinin-2家族抗菌肽BR2GΚ。陽離子抗菌肽通常通過靜電相互作用吸附到細(xì)菌細(xì)胞膜表面，隨后在細(xì)胞膜環(huán)境中形成穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是抗菌肽發(fā)揮作用的關(guān)鍵。BR2GΚ帶5個正電荷，且圓二色譜結(jié)果表明其在SDS溶液環(huán)境中能形成穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)，符合抗菌肽的特征。抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)BR2GΚ具有廣譜的抗菌活性。

進(jìn)一步的作用機(jī)制研究表明BR2GΚ能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性，這可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子和營養(yǎng)物質(zhì)外滲或抗菌肽進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致菌體裂解死亡［15,16］。在通過I-TASSER服務(wù)器預(yù)測BR2GΚ的結(jié)構(gòu)時，TM-align模塊顯示BR2GΚ與TolC的一段位于脂質(zhì)雙分子層中的序列具有較高的相似度，TolC是位于大腸桿菌脂質(zhì)雙分子層的長孔狀三聚體蛋白，為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的流入和流出提供通道［17］。這也印證了BR2GΚ可能像TolC一樣插入細(xì)菌細(xì)胞膜中從而使其裂解。靶向細(xì)胞膜的多肽普遍具有細(xì)胞毒性和溶血活性等副作用，大量的研究嘗試了在保留多肽活性的同時盡可能的消除其毒副作用，如對多肽的氨基酸進(jìn)行突變或截短、采用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法對多肽進(jìn)行從頭設(shè)計(jì)或在多肽中引入金屬離子等［18-20］。然而本研究測試結(jié)果顯示BR2GΚ不會導(dǎo)致溶血，說明其毒性較小，這表明與其他天然來源的多肽相比，BR2GΚ在抗菌活性和毒性之間有著更好的平衡。

脂多糖又稱為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，被認(rèn)為是革蘭氏陰性菌感染導(dǎo)致內(nèi)毒素休克發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵分子［21-23］。這種內(nèi)毒素在細(xì)胞分裂和死亡期間從細(xì)菌中釋放，還會導(dǎo)致膿毒血癥［24］。本研究ITC和SPRi的結(jié)果顯示BR2GΚ與LPS有較強(qiáng)的相互作用，這表明該肽在具有抗菌活性的同時，還能夠有效的結(jié)合并中和LPS，防止細(xì)菌感染導(dǎo)致的內(nèi)毒素休克和膿毒血癥。最后BR2GΚ還具有有效且迅速的抗氧化活性，這可能和兩棲動物皮膚分泌的多肽還需要抵御紫外線輻射等外部有害因素有關(guān)［25］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蛙皮膚來源的多肽BR2GΚ具有廣譜的抗菌活性，并通過與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，改變細(xì)胞膜的通透性和直接破壞細(xì)胞發(fā)揮抗菌活性，并不會導(dǎo)致溶血，此外BR2GΚ還能結(jié)合LPS，并具有有效且迅速的抗氧化活性。本研究結(jié)果對于闡明BR2GΚ的抗菌機(jī)制和以此為模板設(shè)計(jì)合成具有更強(qiáng)抗菌活性和更低細(xì)胞毒性的抗菌肽具有重要的指導(dǎo)意義。