顧毓艷，蔣 晶，張雅心，陳育堯，陳奕澔，江偉豪，黃志勇，周鳳華

1南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510515；2南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院耳鼻喉科，廣東 廣州 510630

心腦血管疾病目前已成為世界范圍內的主要死亡原因，動脈粥樣硬化（AS）是其主要病理基礎［1］。內皮細胞功能障礙和損傷是粥樣硬化病變的始動因素，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是心血管穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)劑，在調節(jié)內皮細胞功能中具有重要作用［2］。血管緊張素轉換酶2（ACE2）可將血管緊張素II（Ang Ⅱ）代謝為無活性的血管緊張素（1-7）（Ang（1-7））［3］。ACE2和Ang（1-7）能降低內皮細胞分泌的細胞黏附分子濃度，減輕AngⅡ誘導炎癥反應，從而抑制AS 早期病變形成［4,5］，因此ACE2可能是防治AS性疾病的重要靶點［6］。

他汀類藥物是目前AS臨床治療的一線用藥，但其引起的肝腎損傷和肌肉溶解等副作用明顯降低患者生存質量［7,8］。課題組前期發(fā)現(xiàn)，中藥從心論治方（CXLZF）在體內可減輕小鼠高脂血癥［9］，在體外能減輕ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷［10］，但其是否能抗AS作用不清。因此，本研究擬采用高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立AS 模型，從ACE2 途徑探討CXLZF防治AS藥理機制，為CXLZF臨床應用提供必要的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性8周齡SPF級ApoE-/-小鼠30只和6只同周齡C57BL/6小鼠，體質量19～21 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXΚ（京）2016-0006。SPF級成年雄性SD大鼠30只，體質量約200 g，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級，室溫22～24 ℃，相對濕度為50%，12 h光/暗循環(huán)。本實驗經(jīng)南方醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物

CXLZF由黃連15 g（批號：HX18D01）、丹參15 g（批號：HX18D01）、酸棗仁20 g（批號：HX18F01）、靈芝10 g（批號：HX18D01）組成，全部藥物購自南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院。

1.3 動物模型及給藥

小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，以6只C57BL/6小鼠作為對照組，30 只ApoE-/-小鼠隨機分為模型組（HFD）、CXLZF 低、中、高劑量組（CL、CM、CH）及辛伐他汀組（S），6只組。除對照組給予普通飼料外，其于組均給予高脂飼料。高脂飲食12周成功復制AS模型后［11］，分別給予CXLZF低、中、高劑量（4.5、9、18 g·kg-1·d-1）、辛伐他汀（5 mg·kg-1·d-1）灌胃，對照組、模型組以等體積生理鹽水灌胃，1次/d，每周5 d，連續(xù)12周。末次給藥后禁食12 h，給予10%水合氯醛麻醉小鼠后眼球取血、收集組織。

1.4 CXLZF含藥血清制備

制備終質量濃度為2.31 g/mL的CXLZF水煎液；30只雄性SD大鼠隨機分為實驗組（n=20），對照組（n=10）；實驗組大鼠每日早晚各灌胃2 mL CXLZF藥液，對照組灌胃同體積生理鹽水，連續(xù)7 d。末次灌胃1 h后，麻醉動物行腹主動脈取血，分離血清。滅菌后-20 ℃保存。

1.5 細胞培養(yǎng)、實驗分組

人臍靜脈內皮細胞（HUⅤECs，ZQ00446）購自上海中喬生物科技公司。采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于飽和濕度、5%CO2濃度及37 ℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)，細胞長滿至培養(yǎng)皿80%～90%時，用0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)增長期細胞進行實驗。細胞分為：對照組（10%對照組大鼠血清）、模型組100 μg/m L 氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），CXLZF含藥血清低中高劑量組（分別用5%，10%，20%含藥血清孵育2 h，加入ox-LDL干預24 h）。

1.6 試劑及儀器

油紅O（ORO）染色試劑盒、Masson染色試劑盒、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠ACE2 抗體、小鼠E-selection 抗體（Proteintech 中國公司）；小鼠血管緊張素（1-7）ELISA試劑盒（南京卡米洛生物工程有限公司）；熒光顯微鏡（廣州市德真科技有限公司），化學發(fā)光法成像系統(tǒng)（廣州譽維生物科技儀器有限公司）。

1.7 病理切片染色

收集小鼠主動脈根部、主動脈、肝臟制備切片。按照制造商指示方案進行ORO、Masson、蘇木素伊紅（HE）染色，封片后病理顯微鏡觀察拍照。

1.8 葡萄糖、胰島素耐受試驗

在第24周，小鼠接受胰島素耐受試驗（ITT），禁食6 h后，以0.75 U/kg體質量腹腔注射胰島素。分別檢測胰島素注射前（0 min）和胰島素注射后15、30、60 和120 min時小鼠血糖。

1.9 ELISA

根據(jù)試劑盒說明書進行操作檢測小鼠血清Ang（1-7）水平，步驟如下：在標準孔中加入標準品及小鼠血清（10倍稀釋），37 ℃孵育60 min，洗滌后依次加入檢測抗體Ang（1-7）、生物熒光色標記抗體、鏈霉親和素HRP，分別在37 ℃孵育30 min。加入顯色液避光顯色15 min，終止液終止，450 nm波長檢測吸光度。

1.10 Western blotting

采用RIPA裂解液（含10%PMSF）提取小鼠主動脈蛋白，BCA法測定蛋白濃度。60μg蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后轉膜，采用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，采用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗（ACE2、E-selection，1∶500）4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3×5 min，辣根過氧化酶標記二抗（1∶3000）室溫孵育1 h，TBST洗膜3×5 min。ECL法發(fā)光顯色，Image J軟件分析。

1.11 免疫熒光

冰凍切片采用多聚甲醛固定15 min，0.25%Triton X-100 通透10 min，10 %山羊血清封閉1 h 后，一抗（ACE2，1∶250）4 ℃孵育過夜；再用DyLight 549 熒光二抗（1∶400）室溫避光孵育2 h，采用DAPI 染色10 min，以防熒光淬滅劑封片。切片在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.12 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。若符合正態(tài)分布和方差齊性，使用單因素方差分析和T檢驗。方差不齊時，使用Welch方差分析和Welch校正T檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CXLZF減輕AS小鼠主動脈斑塊損傷

與對照組相比，模型組小鼠有明顯AS斑塊形成（圖1）。CXLZF干預后顯著減小斑塊面積，其中高劑量組效果更顯著。CXLZF組與辛伐他汀組相比無顯著差異。此外，CXLZF可增加AS斑塊膠原纖維含量（圖2），提示斑塊更穩(wěn)定。結果表明，CXLZF可顯著減輕AS斑塊損傷。

圖1 主動脈竇ORO染色Fig.1 Oil red O staining of the aortic root in different groups(Original magnification:×40).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.

圖2 主動脈竇Masson染色Fig.2 Masson staining of the aortic root in different groups (×40).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.

HE染色顯示（圖3），與對照組相比，模型組主動脈厚薄不均，內皮下可見有沉著的脂滴及泡沫狀細胞，動脈壁結構破壞，彈力纖維斷裂，平滑肌數(shù)量減少，CXLZF能改善AS小鼠主動脈病理改變。

圖3 主動脈HE染色Fig.3 HE staining of the aortic tissue in different groups (×100).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.

2.2 CXLZF 改善AS小鼠血糖和血脂

ITT結果顯示（表1），與對照組相比，模型組血糖濃度明顯升高（P＜0.05），CXLZF可降低血糖，在胰島素注射第120 min時高劑量作用明顯（P＜0.05）。

表1 小鼠ITT結果Tab.1 Results of ITT in mice(Mean±SD,n=6)

與對照組相比，模型組體質量顯著增加（P＜0.01），而CXLZF可明顯抑制小鼠體質量增長，中、高劑量組效果最佳（P＜0.01，表2）。此外，與對照組相比，模型組小鼠TG、TC、LDL-C濃度分別增加5.03、7.72、3.06倍（P＜0.05），HDL-C濃度下降無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。CXLZF能顯著降低小鼠TG、TC、LDL-C濃度（P＜0.05），且呈劑量依賴性改變。

表2 小鼠血脂水平Tab.2 Blood lipid levels of the mice(Mean±SD,n=6)

2.3 CXLZF改善AS小鼠肝損傷

肝臟病理染色顯示（圖4），與對照組相比，模型組肝索排列紊亂，大量肝細胞嚴重脂肪變性，細胞結構模糊，胞核固縮或碎裂，壞死區(qū)和肝竇內可見大量炎細胞浸潤。CXLZF及辛伐他汀均能顯著減輕肝臟脂肪樣性及炎性細胞浸潤。ORO結果顯示（圖5），與對照組相比，模型組脂質沉積明顯，CXLZF干預能顯著減少肝臟脂質沉積。

圖4 肝臟HE染色Fig.4 HE staining of the liver tissue in different groups (×200).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.

圖5 肝臟ORO染色Fig.5 Oil red O staining of the liver tissue in different groups (×400).A:Control group.B:Model group.C:Simvastatin group.D:Low-CXLZF dose group.E:medium-CXLZF dose group.F:High-CXLZF dose group.

與模型組相比，CXLZF 組小鼠肝臟指數(shù)降低（P＜0.05）。此外，模型組血清ALT、AST濃度顯著高于對照組（P＜0.01），CXLZF 和辛伐他汀均可明顯降低ALT、AST水平（P＜0.05）。由此可見，CXLZF可有效改善HFD誘導肝臟損傷（表3）。

表3 小鼠肝功指標Tab.3 Index of liver function of the mice(Mean±SD,n=6)

2.4 CXLZF可上調AS小鼠ACE2表達

如圖6A所示，與對照組相比，模型組小鼠ACE2明顯降低（0.64倍，P＜0.05），CXLZF可上調ACE2蛋白水平，高劑量作用最為明顯（2.27 倍，P＜0.05）；此外，CXLZF還可降低E-selectin濃度（P＜0.05）。

免疫熒光顯示（圖7），在AS斑塊內，ACE2蛋白表達主要位于胞漿。與模型組相比，CXLZF組斑塊胞漿內紅色熒光顯著增加，提示中藥可上調ACE2蛋白表達。ELISA結果顯示（圖6B），CXLZF可上調AS小鼠血清Ang（1-7）濃度，但結果無統(tǒng)計學意義。

圖6 各組主動脈ACE2、E-selectin，血清Ang（1-7）水平Fig.6 Protein expressions of ACE2,E-selectin and Ang (1-7) in different groups.HFD:Model group,CL:Low-CXLZF dose group,CM:Medium-CXLZF dose group,CH:High-CXLZF dose group.#P＜0.05;*P＜0.05 vs model group.

圖7 主動脈斑塊ACE2免疫熒光染色Fig.7 Immunofluorescence staining ofACE2 in the aortic root in different groups(×200).

2.5 CXLZF 上調ox-LDL 干預HUⅤEC 細胞的ACE2表達

如圖8A所示，與對照組相比，模型組HUⅤEC細胞中ACE2蛋白表達明顯降低（0.83倍，P＜0.05），CXLZF可上調ACE2蛋白水平，中劑量作用最為明顯（2.27倍，P＜0.05）；此外，CXLZF含藥血清干預可顯著上調ox-LDL干預引起Ang基因表達量下降（圖8B，P＜0.05）。

圖8 CXLZF上調ox-LDL干預HUⅤEC細胞的ACE2表達Fig.8 CXLZF up-regulates the protein of ACE2 (A) and the mRNA of Ang (B) expression in HUVECs.ox-LDL:model group,CL:Low-CXLZF dose group,CM:medium-CXLZF dose group,CH:high-CXLZF dose group.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs model group.

3 討論

本研究旨在探討CXLZF對高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠AS損傷的影響及機制。我們發(fā)現(xiàn)，CXLZF可明顯減輕小鼠斑塊損傷，改善小鼠血糖血脂水平及肝臟脂肪變性。在RAS系統(tǒng)中，CXLZF可增加主動脈ACE2蛋白含量，減少黏附分子表達。我們推測，ACE2可能是CXLZF改善小鼠AS損傷的靶點之一。

CXLZF由黃連、丹參、酸棗仁、靈芝組成，來源于南方醫(yī)院中醫(yī)科治療冠心病的經(jīng)驗方定心方。AS的中醫(yī)辨證實為痰濕瘀毒互結之證，治則以祛濕解毒活血為要，CXLZF君藥為入中焦脾胃肝膽經(jīng)之黃連，取其清熱祛濕解毒功效，臣以入心、肝經(jīng)之丹參活血化瘀消癰，佐以酸棗仁養(yǎng)心補肝，寧心安神。以靈芝滋補強壯為使藥，緩和君藥黃連之苦寒。四味藥材共奏清熱祛濕、活血解毒、扶正益氣之功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，CXLZF在體內可改善小鼠高脂血癥［10］，在體外能減輕ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷［10］。

ApoE是血液中脂蛋白的重要組分，在膽固醇和脂蛋白代謝調節(jié)中起主要作用，ApoE基因敲除小鼠可自發(fā)形成AS，且在病理及組織學形態(tài)上與人類極其相近，HFD喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠是目前研究AS的常用動物模型之一［12,13］。HFD喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠后可誘導血管內皮細胞激活，促進單核細胞和血管平滑肌細胞吞噬脂質形成泡沫細胞。泡沫細胞在動脈內膜中堆積形成脂質斑塊［14,15］，斑塊面積可反映AS 損傷程度。我們發(fā)現(xiàn)，CXLZF可減小ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積。此外，斑塊穩(wěn)定性也是評估AS損傷程度的重要指標［16,17］，膠原纖維含量越多，斑塊越穩(wěn)定。與模型組相比，CXLZF顯著增加斑塊中膠原纖維含量。提示CXLZF能顯著減輕AS損傷，其作用可能與方中主要成分黃連素、丹參酮ⅡA和靈芝多糖等有關。已有研究表明，以上活性成分均具有改善AS斑塊損傷作用［16,17］。

AS與脂質代謝紊亂密切相關，血脂升高是AS發(fā)病的重要危險因素［17］。其中，低密度脂蛋白能增加動脈壁膽固醇內流和沉積，促進AS形成，高密度脂蛋白能通過抑制固醇內流和沉積阻止AS發(fā)生發(fā)展［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，CXLZF可明顯改善AS小鼠血脂水平，包括降低TC、TG、LDL-C，但對HDL-C調節(jié)作用不明顯。血糖升高也是AS發(fā)病的重要危險因素，CXLZF能改善AS小鼠血糖，可能主要與君藥黃連降糖作用有關［21-23］。可見，CXLZF能有效調節(jié)AS小鼠血糖血脂水平，延緩AS進展。

HFD誘導肝臟脂質積累能加重小鼠AS損傷［24,25］。本研究中，高脂喂養(yǎng)24周后ApoE-/-小鼠肝臟出現(xiàn)明顯脂肪變性，ALT與AST水平顯著升高，而CXLZF能顯著改善小鼠肝臟損傷。提示CXLZF抗AS損傷可能主要與減輕HFD誘導的斑塊形成及肝臟病變有關。

內皮細胞功能障礙是AS病變的始動因素，RAS在內皮細胞功能調節(jié)中具有重要作用，其主要成員ACE2可通過改善內皮功能、局部炎癥、脂質沉積等抗AS損傷［26,27］。我們發(fā)現(xiàn)，CXLZF可顯著上調AS小鼠主動脈ACE2蛋白表達，同時，CXLZF含藥血清可上調ox-LDL干預HUⅤEC細胞的ACE2蛋白表達，ACE2增加可下調E-selectin蛋白水平，其是炎癥早期出現(xiàn)的黏附分子，也是血管內皮細胞受損的標志［28-30］。此外，ACE2可上調Ang（1-7）水平，其可通過保護血管內皮細胞、減輕炎癥反應及氧化應激等發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用［28,31-34］。本實驗中，CXLZF可使AS小鼠血清中Ang（1-7）含量呈增長趨勢，CXLZF含藥血清可上調ox-LDL干預HUⅤEC細胞中Ang基因表達。因此我們推測，CXLZF可能通過ACE2蛋白調節(jié)RAS系統(tǒng)、減少黏附分子表達，從而減輕AS損傷。

綜上所述，中藥CXLZF能有效減輕HFD誘導的ApoE-/-小鼠AS損傷，改善小鼠血糖血脂水平及肝功能，機制可能與調節(jié)ACE2蛋白表達有關，但如何調控還需進一步研究。