余 平 李葉子 萬少兵

(湖北省武漢市第三醫(yī)院急診科，武漢市 430060，電子郵箱：y94eay@163.com)

心肌纖維化又稱心肌鈣化，是由心臟代謝異常、心肌缺血以及冠狀動脈硬化等多種因素引起的一種疾病，呈持續(xù)性或反復加重，可逐漸發(fā)展為心力衰竭，即慢性缺血性心臟病[1-2]。同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高是發(fā)生心肌纖維化的重要原因之一，其可以直接或間接導致血管內皮細胞損傷，增強血小板功能，從而促進血栓形成[3-4]。故本實驗使用Hcy誘導CF以建立心肌纖維化細胞模型。沉默信息調節(jié)因子(sirtuin，SIRT)1為哺乳動物SIRT家族成員之一，可以使多個蛋白質去乙?；淖兤浠钚裕ㄟ^調節(jié)SIRT1可以調控細胞能量代謝、氧化應激等多種生物作用[5]。p53蛋白的主要作用包括阻滯細胞周期、促進細胞凋亡等[6]。有研究表明，SIRT1可通過將p53蛋白的第382位賴氨酸殘基乙?；?，降低p53蛋白與DNA順式元件的結合能力，從而抑制細胞凋亡[7]。本實驗旨在研究抑制SIRT1/p53通路對Hcy誘導的心肌纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts,CF)購于中科院上海細胞庫(批號：234015)；Hcy購自武漢博士德生物工程有限公司(批號：780346)；SIRT1/p53通路抑制劑EX527購自北京四季青生物科技有限責任公司(批號：2220216)；杜氏改良伊戈爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購于美國Abcam公司(批號：10247、55930、77380)；細胞計數(shù)檢測(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒購于北京鼎國科技有限公司(批號：2300089)；膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)試劑盒購于天津百賽斯生物科技有限公司(批號：1113076)；TRIzol試劑盒、反轉錄試劑盒購、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購于日本TaKaRa公司(批號：2340754、3476208、2502179)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物購于上海生工生物工程股份有限公司(批號：7990376)；二喹啉甲酸試劑盒、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)凝膠配置試劑盒、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)購于上海碧云天生物技術研究所(批號：31349、20169、1154269)；SIRT1抗體、乙?；痯53(acetylated p53,Ac-p53)抗體、Ⅰ型膠原α1鏈(collagen type Ⅰ alpha 1 chain,COL1A1)抗體、Ⅲ型膠原α1鏈(collagen type Ⅲ alpha 1 chain,COL3A1)抗體、肌動蛋白α2(actin alpha 2,Acta2)抗體、β-肌動蛋白(β-actin)抗體購于美國Santa Cruz公司(批號：33345670、36309270、32013452、340983457、22456983、55309718)；二抗購于美國Sigma公司(批號：34075217)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、處理和分組：采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)CF，培養(yǎng)條件為5% CO2和37℃。每2 d換一次培養(yǎng)液，當細胞融合度達80%～90%時，加0.25%胰蛋白酶消化傳代，收集第3～5代細胞進行實驗。取對數(shù)期CF接種于6孔板中(2×105個/孔)，將細胞分為3組進行實驗，即NC組、Hcy組、EX527+Hcy組。NC組為正常培養(yǎng)的CF；Hcy組的細胞長滿85%以上時，換含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入10 μL濃度為0.5 mmol/L的Hcy刺激細胞，培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗；EX527+Hcy組細胞在給予10 μL濃度為0.5 mmol/L濃度的Hcy刺激后立即加入10 mL的SIRT1/p53通路抑制劑EX527(1 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測CF增殖能力：調整CF密度至4×105個細胞/mL，接種于96孔板(2×103個細胞/孔)，培養(yǎng)24 h后，向每個待測孔加入10 μL的CCK-8試劑，37℃孵育2 h，使用酶標儀(無錫集佳智能科技有限公司，型號：ZG-660)在490 nm波長下檢測細胞的光密度值(A)，計算細胞存活率，細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞術檢測CF凋亡率：收集各組CF，重懸于500 μL 1×結合緩沖液中。按照凋亡檢測試劑盒依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光染色30 min。1 h內上流式細胞儀(德國Partec公司，型號：CyFlow? Space)檢測細胞凋亡率。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測COL1A1、COL3A1、Acta2 mRNA相對表達水平：使用TRIzol試劑提取各組CF的總RNA，然后使用反轉錄試劑盒生成cDNA，利用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ在熒光定量PCR儀(美國Agilenti公司，型號：Mx3005P)上進行反應。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增。反應體系為10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補足體系至25 μL。反應條件為95℃預變性60 s，95℃變性60 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。COL1A1正向引物5′-CTGGTCCTGTTGGAAGTCGT-3′，反向引物5′-CAGATGCACCTGTTTCTCCA-3′； COL3A1正向引物5′-CTGGCGGCTTTTCACCATAT-3′，反向引物5′-TCTCCGCTCTTGAGTTCAGG-3′；Acta2正向引物5′-CTGTGCTATGTCGCTCTGGA-3′，反向引物5′-ATAGGTGGTTTCGTGGATGC-3′；GAPDH正向物5′-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′，反向引物5′-CCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.5 蛋白免疫印跡實驗檢測COL1A1、COL3A1、Acta2、SIRT1、Ac-p53蛋白相對表達水平：使用二喹啉甲酸蛋白提取試劑盒提取各組CF的總蛋白，檢測蛋白濃度后進行變性處理，取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE反應，轉到PVDF，封閉，分別加入一抗稀釋液(1 ∶1 000)，4 ℃孵育24 h，TBST洗滌，分別加入二抗稀釋液(1 ∶2 000)，室溫孵育1 h，暗室內曝光顯影，應用Image J軟件分析各條帶灰度值。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示， 多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3組CF存活率的比較 與NC組比較，Hcy組CF存活率升高(P<0.05)；與Hcy組比較，EX527+Hcy組細胞存活率降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組CF存活率 的比較(x±s，%)

2.2 3組CF凋亡率的比較 與NC組比較，Hcy組CF凋亡率降低(P<0.05)；與Hcy組比較，EX527+Hcy組細胞增殖率升高(P<0.05)。見表2和圖1。

表2 3組CF凋亡率的比較(x±s，%)

圖1 各組細胞凋亡情況

2.3 3組CF中纖維化相關因子的mRNA和蛋白相對表達水平的比較 與NC組比較，Hcy組CF中COL1A1、COL3A1和Acta2 mRNA和蛋白相對表達水平均升高(均P<0.05)；與Hcy組比較，EX527+Hcy組CF中COL1A1、COL3A1和Acta2 mRNA和蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)。見表3和圖2。

表3 3組CF中纖維化相關因子mRNA和蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖2 3組CF中纖維化相關因子的蛋白表達情況

2.4 3組CF中SIRT1/p53通路相關蛋白相對表達水平的比較 與NC組比較，Hcy組CF細胞中SIRT1蛋白相對表達水平升高，而Ac-p53蛋白相對表達水平降低(均P<0.05)；與Hcy組比較，EX527+Hcy組細胞中SIRT1蛋白相對表達水平降低，而Ac-p53蛋白相對表達水平升高(均P<0.05)。見表4和圖3。

表4 3組CF中SIRT1/p53通路相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖3 3組CF中SIRT1/p53通路相關蛋白的表達情況

3 討 論

心肌纖維化是高血壓所致心肌重構的重要病理特征，是發(fā)生心律失常的基礎，也是心力衰竭的潛在危險因素[8]。CF能夠合成應力纖維、纖維化相關基因子COL1A1、COL3A1和Acta2的基因和蛋白，心肌纖維化是CF形成并活化的過程[9-10]。Hcy是一種含硫氨基酸，Hcy升高是造成心肌纖維化的主要原因。動物實驗表明，Hcy可誘導大鼠心肌微血管內皮細胞損傷[11]，而降低Hcy表達水平可以延緩酒精性心肌病大鼠的心肌纖維化[12]。王潔文[13]的研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性高血壓患者血漿Hcy水平與心肌纖維化關系密切。因此，本實驗使用Hcy誘導CF以模擬心肌纖維化，并以CF中纖維化相關因子COL1A1、COL3A1和Acta2等[14]作為觀察指標，結果顯示，經Hcy誘導后CF的增殖率升高，而凋亡率降低，細胞中COL1A1、COL3A1和Acta2的 mRNA和蛋白相對表達水平均升高，提示成功建立心肌纖維化模型。

SIRT1與p53的相互作用可抑制細胞凋亡[7]，兩者對多種心血管病變均具有改善作用。龐明[15]的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1對Hcy誘導的血管內皮細胞衰老起到保護作用；鄔云斌等[16]研究表明，白藜蘆醇對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用與SIRT1/p53通路有關系。此外，抑制SIRT1表達水平對乳鼠CF的活性有明顯的抑制作用[17]。S-腺苷同型半胱氨酸可在S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosine homocysteine hydrolase,SAHH)的作用下可分解為腺苷和Hcy。糖尿病心肌病的病因之一是由糖基化的膠原沉積所致心肌間質纖維化，而SAHH和Hcy水平升高可能是大鼠早期糖尿病心肌病發(fā)生和發(fā)展的重要機制，而SIRT1水平升高可抑制SAHH水平從而緩解的糖尿病心肌病[18]。本實驗結果顯示，給予SIRT1/p53通路抑制劑EX527干預后，EX527+Hcy組SIRT1蛋白相對表達水平降低，Ac-p53蛋白相對表達水平升高，提示EX527成功抑制SIRT1/p53通路；EX527+Hcy組CF增殖率降低，細胞凋亡率升高，細胞中的COL1A1、COL3A1和Acta2 mRNA和蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)，這表明抑制SIRT1/p53通路可以減輕Hcy誘導的心肌纖維化程度。

綜上所述，Hcy可促進CF增殖而抑制其凋亡，從而誘導心肌纖維化的發(fā)生，而抑制SIRT1/p53信號通路可以減輕Hcy誘導的心肌纖維化。