王 彬，武亭宇，吳 劍，王博龍

宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院(江西 宜春 336000)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Keen Osteoarthritis，KOA)是臨床常見的膝關(guān)節(jié)慢性退行性病變，主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、變形和疼痛、肢體活動(dòng)受限，隨著病情進(jìn)展，嚴(yán)重者可致殘致畸[1]。因經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及術(shù)后并發(fā)癥的影響，西醫(yī)治療KOA主要采用非甾體類抗炎藥物、糖皮質(zhì)激素類藥、生物制劑等保守治療，雖可暫緩患者臨床癥狀，但難以恢復(fù)關(guān)節(jié)功能[2]。中醫(yī)學(xué)將KOA歸屬于痹證、筋痹、骨痹等范疇[3]。肝主筋，腎主骨，肝腎虧虛，寒濕之邪乘虛內(nèi)侵，氣血運(yùn)行不暢，筋脈不得濡養(yǎng)，故不榮則痛[4-5]。因此，KOA證屬本虛標(biāo)實(shí)，肝腎虧虛筋骨失養(yǎng)是其內(nèi)因，氣滯血瘀風(fēng)寒濕邪痹阻經(jīng)絡(luò)為其外因。本文基于關(guān)聯(lián)規(guī)則挖掘KOA內(nèi)服方劑的用藥規(guī)律及核心藥物，并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法解析核心藥物的作用機(jī)制，為臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源與篩選從知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫收集治療KOA的內(nèi)服方劑，要求處方完整、劑量準(zhǔn)確、療效確切，檢索期從建庫起至今。剔除動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、中成藥、中藥提取物、中藥貼劑，注射劑治療等文獻(xiàn)。

1.2數(shù)據(jù)錄入?yún)⒖?020版《中華人民共和國(guó)藥典》[6]統(tǒng)一方劑中的中藥名稱，如“生地”統(tǒng)一為“生地黃”。采用雙人雙錄入的方法將所收集方劑的中藥錄入Microsoft Excel 2010表格中，并由雙人進(jìn)行數(shù)源審查、核對(duì)，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確無誤。

1.3數(shù)據(jù)分析根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》判定每味中藥的性味、歸經(jīng)及功效。應(yīng)用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行用藥頻次、性味、歸經(jīng)分析以及聚類分析。應(yīng)用Clementine 12.0的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析挖掘核心藥物。

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)篩選核心藥物成分及靶點(diǎn)，將成分靶點(diǎn)與在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)獲得的KOA靶點(diǎn)找重，得到核心藥物治療KOA炎的靶點(diǎn)。采用DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行KEGG通路富集分析，最后通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)KOA內(nèi)服方劑所用127味中藥的性味歸經(jīng)，結(jié)果如圖1所示，四氣以溫性最多，使用頻次為225次，其次為平性，使用頻次為129次；五味以甘味最多，使用頻次為233次，其次為辛味和苦味，使用頻次分別為214次和208次。歸經(jīng)以肝經(jīng)最多，使用頻次為230次，其次為腎經(jīng)和脾經(jīng)，使用頻次分別為201次和197次。

圖1 藥物性味歸經(jīng)雷達(dá)圖

2.2用藥頻次統(tǒng)計(jì)頻次統(tǒng)計(jì)顯示，50首方劑的127味中藥累計(jì)使用460次，其中使用頻次≥10的高頻中藥由高到低分別為牛膝、甘草、川芎、當(dāng)歸、獨(dú)活、杜仲、白芍、秦艽等14味，見表1。

表1 KOA中藥頻數(shù)分析

2.3關(guān)聯(lián)規(guī)則分析使用Clementine 12.0軟件對(duì)高頻中藥進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，根據(jù)Apriori算法設(shè)定支持度為10%，置信度為60%，二聯(lián)對(duì)藥的最大前項(xiàng)數(shù)為1，按照置信度高低進(jìn)行降序排列，三聯(lián)角藥最大前項(xiàng)數(shù)為2，按照支持度高低進(jìn)行降序排列。由表2可見主要藥對(duì)20個(gè)，其中支持度最大的為川芎-牛膝、當(dāng)歸-牛膝、川芎-當(dāng)歸(38%)。由表3可見主要角藥10個(gè)，其中支持度最大的為川芎、牛膝-當(dāng)歸(32%)。利用Clementine 12.0構(gòu)建治療KOA高頻中藥的網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖。如圖2所示，每味中藥物所連接線條越多代表其關(guān)聯(lián)規(guī)則越多，所連線條越粗代表該關(guān)聯(lián)規(guī)則越強(qiáng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)性多且高的中藥有牛膝、獨(dú)活、甘草、杜仲、當(dāng)歸、川芎、白芍、茯苓、細(xì)辛。

表2 治療KOA中藥二聯(lián)規(guī)則分析

表3 治療KOA中藥三聯(lián)規(guī)則分析

圖2 治療KOA中藥的網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖

2.4聚類分析利用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行聚類分析，如圖3所示，治療KOA中藥按功效可分為4類。第1類：川芎、細(xì)辛、當(dāng)歸、杜仲、桑寄生、牛膝、獨(dú)活。第2類：甘草、白芍、黃芪。第3類：茯苓、白術(shù)、熟地黃。第4類：薏苡仁。

圖3 治療KOA中藥聚類分析的樹狀圖

2.5核心中藥成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)由關(guān)聯(lián)規(guī)則分析可知，川芎-牛膝、當(dāng)歸-牛膝、川芎-當(dāng)歸3個(gè)藥對(duì)的支持度(38%)最高；而角藥中川芎、牛膝-當(dāng)歸角藥的支持度(32%)最高。因此選擇川芎、牛膝、當(dāng)歸作為核心中藥。應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，查尋TCMSP數(shù)據(jù)庫得到川芎、牛膝、當(dāng)歸的活性成分靶點(diǎn)323個(gè)，選取GeneCards數(shù)據(jù)庫中KOA前1 000個(gè)疾病靶點(diǎn)，通過映射匹配得到共有靶點(diǎn)81個(gè)，即確定為川芎、牛膝、牛膝治療KOA的靶點(diǎn)。將81個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行KEGG通路富集，得到KOA主要通路20個(gè)。圖4為川芎-牛膝-當(dāng)歸治療KOA的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，一共有110個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中成分節(jié)點(diǎn)9個(gè)，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)81個(gè)，通路節(jié)點(diǎn)20個(gè)。

注：紫色代表成分，橙色代表靶點(diǎn)，綠色代表通路。圖4 川芎-牛膝-當(dāng)歸治療KOA的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

KOA臨床證型常見肝腎虧虛證、脾腎陽虛證、瘀血閉阻證、寒濕凝滯證、濕熱阻絡(luò)證等，多采用補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、活血化瘀等方法[7]。所服中藥有經(jīng)典古方、名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方、院內(nèi)制劑等，上述方藥的多樣性、復(fù)雜性和不確定性，對(duì)于KOA中藥用藥規(guī)律的闡明帶來了諸多困惑。本研究基于數(shù)據(jù)挖據(jù)，分析了50首KOA內(nèi)服方藥的127味中藥，發(fā)現(xiàn)它們藥性多以溫、平為主，味多甘、辛，歸經(jīng)以肝、腎、脾經(jīng)為主。眾所周知溫性藥能夠散寒除濕；而甘味能緩、能和、能補(bǔ)，可緩急止痛，補(bǔ)養(yǎng)氣血；辛味能行能散，可活血行氣，祛風(fēng)散寒?！稄埵厢t(yī)通》云：“膝為筋之府……膝痛無有不因肝腎虛者”，肝藏血主筋，肝血不足則諸筋失養(yǎng)；腎藏精主骨，腎虛則髓海不充骨骼失養(yǎng)，故多數(shù)中藥歸屬肝、腎經(jīng)。用藥頻次統(tǒng)計(jì)顯示牛膝、甘草、川芎、當(dāng)歸、獨(dú)活、杜仲、白芍、丹參、防風(fēng)、茯苓、秦艽、熟地黃、細(xì)辛、薏苡仁為高頻使用中藥，它們的二聯(lián)規(guī)則分析顯示置信度排名前5的藥對(duì)有防風(fēng)-牛膝、細(xì)辛-川芎、獨(dú)活-牛膝、桑寄生-牛膝、白芍-甘草，其中川芎-牛膝、當(dāng)歸-牛膝、川芎-當(dāng)歸三個(gè)藥對(duì)的支持度(38%)也最高；三聯(lián)規(guī)則分析仍以川芎、牛膝-當(dāng)歸的支持度(32%)最高。因此本研究認(rèn)為川芎、牛膝、當(dāng)歸是KOA中藥組方的核心藥物。

聚類分析發(fā)現(xiàn)治療KOA中藥主要分為4類。第1類藥物活血止痛、補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨，包括川芎、細(xì)辛、當(dāng)歸、杜仲、桑寄生、牛膝、獨(dú)活。其中川芎、當(dāng)歸行氣開郁、活血止痛；細(xì)辛、獨(dú)活祛風(fēng)止痛；杜仲、桑寄生、牛膝補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨，并且牛膝為川牛膝，川牛膝苦酸平，偏于活血祛瘀通絡(luò)，又可以引諸藥下行?！侗静菡x》曰：“牛膝屈而能達(dá)，無微不至，逐邪者，固倚為君，養(yǎng)正者，亦賴以輔佐，所以痿弱痹著，骨痛痙攣諸證，皆不可一日無此也”。此外，治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅，當(dāng)歸、川芎、牛膝諸藥合用活血，意在使風(fēng)邪得祛，氣血充盈，肝腎得補(bǔ)，扶正祛邪，標(biāo)本同治[8]。第2類藥物清熱解毒、益氣養(yǎng)陰，包括甘草、白芍、黃芪。由表2也可以看出“白芍-甘草”藥對(duì)置信度和支持度都較高?！鞍咨?甘草”藥對(duì)著眼于氣血的調(diào)理，根據(jù)虛與實(shí)的輕重不一，酌情調(diào)整其補(bǔ)瀉的配伍，其中藥物又多以溫補(bǔ)、平補(bǔ)為特點(diǎn)，以歸脾經(jīng)、肝經(jīng)為主，補(bǔ)瀉兼顧，以補(bǔ)為主，反映了“健脾氣、養(yǎng)肝血”的構(gòu)方理念[9]。黃芪常用于氣虛乏力半身不遂，痹痛麻木。因此，“白芍-甘草”與黃芪聯(lián)用治療氣血兩虛證、氣滯血瘀證、風(fēng)寒濕凝滯筋骨證、肝腎虧虛證、肝郁血虛證[10]。第3類藥物利水滲濕、健脾益氣，包括茯苓、白術(shù)、熟地黃。白術(shù)苦而性燥，味甘補(bǔ)脾，能助脾胃之健運(yùn)以促生化之源，為健脾益氣、燥濕除痹、消食除痞之要藥。茯苓和熟地黃具有滋腎健脾、通絡(luò)止痛的功效。三味藥物聯(lián)用適用于骨痹疼痛，病性虛實(shí)夾雜，脾腎兩虛，疼痛相對(duì)較緩者[11]。第4類藥物為薏苡仁，可清熱祛濕舒筋，主治下焦?jié)駸嶂畠勺懵轲裟[痛[12]。

數(shù)據(jù)挖掘顯示核心藥物治療KOA的主要靶點(diǎn)有TNF、IL-6、PTGS2、JUN、AKT1、BAX等，而研究[13]表明IL-6是TNF作用的重要中介物質(zhì)，能放大和延續(xù)KOA的疾病進(jìn)程，炎癥因子TNF可通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，引起MMPs表達(dá)增加，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡、軟骨破壞等反應(yīng)，兩者的協(xié)同作用可加速KOA的發(fā)展。郭靜[14]、張其亮[15]發(fā)現(xiàn)PTGS2不僅影響體內(nèi)前列腺素水平，還會(huì)增加血管通透性，促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并可通過NF-KB通路激活并誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。羅淦[16]發(fā)現(xiàn)JUN能夠阻斷一氧化氮的誘導(dǎo)從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡。程亮[17]發(fā)現(xiàn)AKT1在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，對(duì)調(diào)控細(xì)胞的調(diào)亡發(fā)揮著重要作用。

KEGG通路富集表明PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-KB信號(hào)通路、Toll-樣受體信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等是核心藥物治療KOA的主要途徑。張媛媛[18]發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt通路的激活，可使Akt蛋白高度表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游靶蛋白，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax表達(dá)，從而抑制軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生，降低炎癥因子水平，延緩軟骨細(xì)胞的衰老退變，保護(hù)并改善關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)，達(dá)到預(yù)防和治療KOA的目的。王瑀譞[19]發(fā)現(xiàn)NF-KB信號(hào)通路以雙向方式調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)和退化，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答，細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)等。NF-KB信號(hào)通路過度激活，可持續(xù)刺激IL-1β、TNF等促炎因子產(chǎn)生，反作用于NF-KB信號(hào)通路，進(jìn)一步導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨破壞，加速KOA發(fā)展[20]。ADEREM[21]等發(fā)現(xiàn)Toll樣受體活化后可通過一系列反應(yīng)，參與識(shí)別PAMPs和DAMPs，誘導(dǎo)多種炎性介質(zhì)和因子的合成與釋放，誘發(fā)或加重KOA。Yudoh[22]發(fā)現(xiàn)在軟骨形成的過程中，HIF-1信號(hào)通路能夠保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，提升軟骨細(xì)胞的表型以及增加軟骨細(xì)胞對(duì)于缺氧環(huán)境的適應(yīng)性。

總之，本研究分析了KOA內(nèi)服方劑的用藥規(guī)律及其核心藥物，并揭示了核心藥物川芎、牛膝、當(dāng)歸多靶點(diǎn)、多通路治療KOA的作用機(jī)理，為治療膝骨關(guān)節(jié)炎用藥組方提供了理論參考。