曹莎莎，段麗娟，周福有

(安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院/河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院 a.中心實(shí)驗(yàn)室；b.胸外科，河南 安陽(yáng) 455000)

食管癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別居全世界惡性腫瘤的第8位和第6位[1]。由于早期診斷率低，確診時(shí)多數(shù)患者已經(jīng)發(fā)生了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，食管癌患者的5 a生存率低于20%[2-3]。因此，尋找與食管癌臨床特征和預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物，探究食管癌的發(fā)病機(jī)制，對(duì)食管癌的早期診斷、開發(fā)新的治療靶點(diǎn)、延長(zhǎng)患者生存期具有重要意義。ABRACL蛋白，又稱HSPC280蛋白，位于人類染色體6p24.1上，長(zhǎng)14 kb，編碼81個(gè)氨基酸，其保守的疏水槽可以與其他蛋白相互作用來(lái)增加肌動(dòng)蛋白動(dòng)力和細(xì)胞活動(dòng)性[4-5]。研究表明，ABRACL在乳腺癌[6]、子宮內(nèi)膜癌[7]、胃癌[8]中的表達(dá)水平均升高。目前還未有報(bào)道研究ABRACL在食管癌中的表達(dá)情況及意義。本研究通過(guò)下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)信息，分析ABRACL在食管癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測(cè)并比較22對(duì)食管鱗癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中ABRACL的表達(dá)水平，以期為食管癌的早期診斷和治療提供新的分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 TCGA和GEO原始數(shù)據(jù)下載及分析通過(guò)TCGA和GEO官方數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站下載食管癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及相應(yīng)臨床信息。包括食管癌組織樣本164例和正常食管組織樣本1 032例。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后通過(guò)基因作圖進(jìn)行注釋和篩選。TCGA和GEO數(shù)據(jù)分析方法分別基于R軟件的edgeR包和limma包進(jìn)行表達(dá)差異分析。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中依據(jù)ABRACL基因的中位表達(dá)水平(84)將食管癌患者分為低表達(dá)組(≤84)和高表達(dá)組(>84)，其中低表達(dá)組81例，高表達(dá)組80例。

1.2 組織樣本選取2016年6月至2017年6月于安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院/河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院胸外科接受食管癌根治術(shù)的22例患者作為研究對(duì)象，其中男13例，女9例，年齡56～80歲，中位年齡67歲。患者通過(guò)病理檢查確診且術(shù)前均未接受放化療或其他免疫治療。手術(shù)中切取癌組織和距癌組織腫塊邊緣大于5 cm的癌旁組織標(biāo)本分別作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。組織離體后立即置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT-qPCR驗(yàn)證對(duì)提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用SYBR Green法進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，以actin為內(nèi)參基因。RT-qPCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：20×SYBR Green 0.3 μL、10×PCR Buffer 2 μL、10 μmol·L-1正向引物和反向引物各0.5 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL、1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、5 U·μL-1的DNA聚合酶0.2 μL 。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 60 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)，通過(guò)擴(kuò)增曲線判斷PCR的擴(kuò)增效率，通過(guò)溶解曲線檢測(cè)PCR產(chǎn)物的特異性。RT-qPCR檢測(cè)中每孔均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均Ct值作為該樣本的最終Ct值。actin作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt值作為ABRACL的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 基因集富集分析采用GSEA軟件進(jìn)行分析，利用GSEA網(wǎng)站MsigDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲得gmt數(shù)據(jù)集，按缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法進(jìn)行富集分析，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1 000次。以ABRACL的表達(dá)水平作為表型標(biāo)記。利用P值和標(biāo)準(zhǔn)化富集評(píng)分對(duì)每個(gè)表型的富集途徑進(jìn)行排序。

1.5 調(diào)控ABRACL表達(dá)的上游miRNA預(yù)測(cè)采用Targetscan、miRDB、miRMap和miTarBase 4種線上工具分析ABRACL的上游miRNA。為了提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，把以上4種工具分析出來(lái)的miRNA繪制韋恩圖以便清晰觀察交叉miRNA。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用R軟件分析數(shù)據(jù)。利用survival工具包進(jìn)行生存分析，采用Kaplan-Meier法分析ABRACL表達(dá)水平與生存期的關(guān)系。運(yùn)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比及其95%置信區(qū)間。使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，使用Student雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組組織RT-qPCR之間的差異比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABRACL在食管癌中的表達(dá)TCGA數(shù)據(jù)顯示ABRACLmRNA在164例食管癌組織中的表達(dá)水平高于1 032例正常食管組織(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。GEO數(shù)據(jù)顯示GSE100942_GPL570中ABRACLmRNA在食管癌組織中的表達(dá)水平高于正常食管組織(P<0.05)，而GSE75241_GPL5175和GSE92396_GPL6244中食管癌組織和正常食管組織中的ABRACLmRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1B。

A為TCGA數(shù)據(jù)集；B為GEO數(shù)據(jù)集。

2.2 ABRACL在食管癌組織中表達(dá)水平升高對(duì)22例患者組織樣本進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示癌組織中ABRACL表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.05)，與數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致。見(jiàn)圖2。

圖2 RT-qPCR檢測(cè)組織ABRACL的表達(dá)水平

2.3 單因素回歸分析結(jié)果TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)臨床信息單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示N分期、M分期、淋巴結(jié)數(shù)目和ABRACL均可以作為食管癌潛在的預(yù)后因素(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 食管癌患者單因素Cox回歸分析結(jié)果

2.4 Kaplan-Meier生存分析生存分析結(jié)果顯示，ABRACL表達(dá)水平與食管癌患者的總生存期相關(guān)(P<0.05)，其表達(dá)水平越高，總生存期越短，預(yù)后越差。見(jiàn)圖4。

圖4 ABRACL低表達(dá)和高表達(dá)食管癌患者總生存分析

2.5 ABRACL的功能基因集富集分析ABRACL高表達(dá)樣本主要富集在三羧酸循環(huán)和呼吸電子傳送通路、剪接體通路、呼吸電子傳送、mRNA剪切、PCP蛋白不對(duì)稱定位、前復(fù)制混合物組裝通路。見(jiàn)圖5。

2.6 ABRACL的上游miRNA調(diào)控和基因拷貝數(shù)變異情況采用Targetscan、miRDB、miRMap和miTarBase在線分析工具分析上游調(diào)控miRNA，得出的miRNA交集有3個(gè)，分別為hsa-miR-1200、hsa-miR-145-5p和hsa-miR-4324，見(jiàn)圖5A。對(duì)ABRACL基因拷貝數(shù)與基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ABRACL基因雜合狀態(tài)下表達(dá)量最低，見(jiàn)圖5B。

A為三羧酸循環(huán)和呼吸電子傳送通路；B為剪接體通路；C為呼吸電子傳送通路；D為mRNA剪切通路；E為PCP蛋白不對(duì)稱定位通路；F為前復(fù)制混合物組裝通路。標(biāo)準(zhǔn)化富集評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)化的富集分?jǐn)?shù)；NOM-p value為標(biāo)準(zhǔn)化的P值；FDR q val為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率q值。

A.Targetscan、miRDB、miRMap和miTarBase 4種軟件分析調(diào)控ABRACL的miRNA檢索情況韋恩圖；B.ABRACL基因拷貝數(shù)變異與其表達(dá)情況圖。

3 討論

食管癌是惡性程度較高的消化道腫瘤之一。由于早期癥狀隱匿，不易被發(fā)現(xiàn)，且缺乏特異性分子診斷標(biāo)志物，絕大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)，預(yù)后較差。HSPC280蛋白是從胎兒肝和CD34+干細(xì)胞中克隆的C6ORF115基因編碼的一個(gè)蛋白[9]。Wang等[8]對(duì)GEO和TCGA數(shù)據(jù)平臺(tái)上下載的臨床樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ABRACL在胃癌組織中的表達(dá)明顯增高，且高表達(dá)患者的預(yù)后差，總生存期短，且發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)TCGA和GEO數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)ABRACLmRNA表達(dá)水平在食管癌中明顯上升，22例食管癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織RT-qPCR結(jié)果顯示癌組織中的ABRACL表達(dá)水平高于癌旁組織，與數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致。同時(shí)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)ABRACL表達(dá)和食管癌患者預(yù)后生存之間存在明顯相關(guān)性，ABRACL高表達(dá)患者總生存期短且預(yù)后差，表明ABRACL可能為潛在的食管癌預(yù)后標(biāo)志物。對(duì)下載的臨床樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素回歸分析，結(jié)果顯示N分期、M分期、淋巴結(jié)數(shù)目和ABRACL均為食管癌潛在的預(yù)后因素。

進(jìn)一步通過(guò)GSEA探究ABRACL表達(dá)增高時(shí)參與食管癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。結(jié)果表明，ABRACL高表達(dá)的食管癌樣本主要富集在三羧酸循環(huán)呼吸電子傳送通路、剪接體通路、呼吸電子傳送、mRNA剪切、PCP蛋白不對(duì)稱定位、前復(fù)制混合物組裝通路等相關(guān)基因集上。

腫瘤發(fā)生經(jīng)常伴隨著RNA剪接異常。越來(lái)越多證據(jù)表明，異常剪接參與了腫瘤細(xì)胞的增殖[10]、凋亡[11]、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]及侵襲轉(zhuǎn)移[13-14]。本研究GSEA分析結(jié)果顯示，ABRACL表達(dá)增高的癌組織中富集通路有剪接體通路和mRNA剪切通路與患者預(yù)后差密切相關(guān)，與TCGA臨床數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。

人類基因組上廣泛存在著多種遺傳變異形式與DNA多態(tài)性[15]。目前有很多文章報(bào)道了基因拷貝數(shù)變異與食管癌發(fā)生的相關(guān)性[16-17]。本研究通過(guò)ABRACL基因拷貝數(shù)變異分析，發(fā)現(xiàn)ABRACL基因雜合狀態(tài)下表達(dá)量最低。

本研究分析和檢測(cè)了ABRACL在食管癌中的表達(dá)情況，其高表達(dá)預(yù)示患者總生存期短，預(yù)后差，且單因素回歸分析顯示N分期、M分期、淋巴結(jié)數(shù)目和ABRACL均可以作為食管癌潛在的預(yù)后因素。ABRACL可作為評(píng)估食管癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。