楊張青，李國強，張玉民，蘇偉波，吳建中，段鐵城,3，齊 磊

（1河南省農業(yè)科學院農業(yè)經濟與信息研究所，鄭州 450008；2河南農大迅捷測試技術有限公司，鄭州 450002；3河南農業(yè)大學，鄭州 450002）

0 引言

氮素是作物生長發(fā)育過程中不可缺少的重要營養(yǎng)元素之一[1]。為了使作物保持適宜的氮素水平，在作物不同生育期合理施用氮肥非常重要。適量施用氮肥能提高作物產量、蛋白質含量，并改善加工品質；但過量或不合理施氮不僅不能達到高產、優(yōu)質的目的，還會使作物莖葉徒長，降低氮肥利用率，增加氮肥損失，并造成環(huán)境污染[2-4]。中國農作物化肥使用總量從1980年的1269.4萬t/年增加至2014年的5995.9萬t/年，而且重氮肥輕磷、鉀肥的現(xiàn)象比較嚴重[5]。但中國對氮肥的利用率僅為30%左右，遠低于發(fā)達國家60%～70%的利用率，導致了嚴重的環(huán)境污染[6-8]。

氮化物主要集中在作物生命活動旺盛的區(qū)域，如葉片、分生組織等。植物葉片中70%～80%氮素存在于葉綠體內，所以葉片中葉綠素含量的高低和氮素關系密切[9-10]。植株葉綠素含量傳統(tǒng)分析采用分光光度法，其中普遍使用的是Arnon法[11]，該法在測定時需要采摘并破壞植株葉片，檢測過程操作繁瑣，不利于對植株葉片的田間快速無損監(jiān)測。為了克服上述缺點，近年來作物葉綠素無損診斷技術受到人們青睞，目前多采用高光譜遙感、葉綠素熒光、葉綠素儀等分析技術，其中葉綠素儀分析技術包括透射式和漫反射式葉綠素儀檢測技術[12]。透射式葉綠素檢測技術采用葉綠素指數(shù)或葉色值表征植株葉片葉綠素含量高低，文獻報道中具有代表性的是SPAD-502葉綠素儀[13-15]（Minolta，日本），該葉綠素儀基于朗伯比爾定律原理，采用650 nm和940 nm 2個波長進行檢測，克服了單一波長受植株生物量、環(huán)境背景干擾等的影響，提高了葉綠素光譜診斷的精度[16]。但是該類型的葉綠素儀在應用性研究中還存在一些缺點：（1）由于葉綠素儀依據光透射原理進行設計，在檢測葉綠素含量較高的葉片時光基本透射不過去，導致儀器測值變化不明顯，如當SPAD值超過50時，測量精度顯著降低，而作物SPAD值在生育期達到50的情況很常見，使得其應用推廣受到限制[17-18]。（2）該葉綠素指數(shù)與葉片葉綠素總量雖有顯著相關性，但是尚未實現(xiàn)直接輸出植株葉片葉綠素a和b值，而葉綠素a和b的比值是作物病理診斷和栽培管理的重要參數(shù)之一。漫反射式葉綠素檢測技術基于光學漫反射理論進行檢測系統(tǒng)設計開發(fā)。2015年河南農業(yè)大學的魏凱等[19]探究了葡萄葉片YN-FS-1型便攜式漫反射葉綠素儀測值XJI與全氮的關系。古東東等[20]搭建了三波長檢測裝置，分析了3個品種玉米葉片葉綠素含量與KM值的相關性。本研究將繼續(xù)深入優(yōu)化光路系統(tǒng)結構設計，提高測試結果的準確性；通過漫反射吸光度建立葉綠素a和b數(shù)學模型；進行小麥、玉米和花卉等植株葉片檢測和數(shù)據分析，以期為大田作物、花卉栽培氮素施肥提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

氣浴恒溫振蕩器（金壇市城東新瑞儀器廠）、紫外-可見分光光度計（南京菲勒儀器有限公司）、電子天平（梅特勒托利多集團）、光譜儀定標白板（海洋光學）、透光度75%消光片、25 mL刻度試管、80%乙醇（分析純）、蒸餾水。

1.2 檢測系統(tǒng)工作原理

1.2.1 Kubelka-Munk函數(shù) 基于Kubelka-Munk光學漫反射理論應用于植株葉片葉綠素檢測可概述為：當一束平行光垂直照射到植株葉片時，這一束平行入射光與物體內部組織結構發(fā)生折射、反射、吸收和散射4種現(xiàn)象后，剩余的光攜帶有豐富的葉片內部組織結構信息并在葉子表面產生漫反射現(xiàn)象，利用這一光學現(xiàn)象，借助光電探測器進行漫反射光檢測可間接獲得葉片內部組織結構信息。與漫反射光相比，光透射受液體樣品的濃度、固體樣品厚度等因素影響，因此透射光無法對一定厚度的固體樣品進行定量測定，相反，漫反射不受樣品或待測物厚度的影響，在檢測固相樣本時更為可靠。由于Kubelka-Munk理論的K-M函數(shù)式推導過程是在6個條件同時滿足的理想情況下完成的：（1）一束平行光垂直入射；（2）物體表面無限大；（3）物體厚度無限厚；（4）物體表面粗糙不平，無鏡面反射光；（5）這束光在物體內部和表面產生了完全的散射和吸收；（6）吸收系數(shù)K和散射系數(shù)S均為常數(shù)。因此，基于漫反射光學理論的應用性研究，還需要在理論指導下根據實際情況進行拓展性應用。在實際應用中，為了保證反射率不受物體厚度改變而變化，測量都是在該物體厚度足夠厚的層上進行，實際測量中物體厚度約1 mm厚就能滿足該條件。因此，用R∞代表物體反射系數(shù)，計算見公式(1)。

其中，F(xiàn)(R∞)稱為Kubelka-Munk(K-M)函數(shù)或者remission函數(shù)。

由公式(1)可推導出R∞的公式(2)。

1.2.2 漫反射吸光度 漫反射吸光度A定義為公式(3)。

1.3 檢測系統(tǒng)設計

該檢測系統(tǒng)主要圍繞光電檢測、信號轉化、數(shù)據處理和人機交互4個功能開發(fā)。其中，光路系統(tǒng)由光源、傳感器、反射板、定位板、避光組件等組成；選用內置A/D轉化器的單片機為數(shù)據采集和處理器，由模擬信號轉化為數(shù)字信號并輸出顯示，以數(shù)據組的形式存儲至SD卡，并實現(xiàn)USB接口與電腦通訊。檢測系統(tǒng)示意圖和電氣圖分別如圖1和圖2所示。

圖1 檢測系統(tǒng)示意圖

圖2 檢測系統(tǒng)電氣圖

1.3.1 光路系統(tǒng) 光路系統(tǒng)采用3光源3光束垂直照射植株葉片的設計思路，使得3束光在葉片上呈現(xiàn)的光斑實現(xiàn)最大面積的重疊，重疊區(qū)的信號比例達到最大。光路組件側面45°陷阱式結構設計，如圖3所示，在陷阱內、檢測器前端安裝透鏡對漫反射光進行匯聚，以增強信號采集。光電傳感器將采集到的光信號進行對數(shù)運算并放大后送給A/D轉化，經A/D轉化后的數(shù)字信號由液晶顯示實現(xiàn)漫反射光強值輸出。光路組件密封性要求達到避免外界光干擾的目的，加工材質選用黑色ABS，組件分為光源發(fā)射、探測部分和漫反射白板內陷及固定部分，兩部分之間用硅膠墊密封，避免夾住葉片時漏光。漫反射光路示意圖如圖3所示。

圖3 漫反射光路系統(tǒng)結構圖

1.3.2 光電檢測及數(shù)據采集 第一波長為峰值波長645 nm的LED光源，第二波長為峰值波長663 nm的LED光源，第三波長為峰值波長940 nm的LED光源。以下分別簡稱第一波長、第二波長和第三波長。光電檢測在封閉暗室中進行，不能受到外界光或太陽光的干擾，由于第一波長和第二波長分別是葉綠素b和a的最大吸收波長，葉片顏色深淺不同而產生不同程度的吸收，光電傳感器接收到的漫反射光信號強弱與葉片葉綠素含量高低呈現(xiàn)高度一致性。檢測系統(tǒng)開機：（1）分別調整第一、二和三波長的限流電阻使得AD輸出值接近滿量程且3個波長的值基本一致，滿足要求后不得再調整限流電阻；（2）先夾住漫反射標準白板，分別獲取第一、二和三波長的AD輸出值作為原始值；再檢測3個光源均熄滅時系統(tǒng)的暗電流值，每次測量均扣除該本底值；然后夾住葉片進行測量，第三波長的漫反射值為動態(tài)參照值，用于扣除葉脈、葉片表面狀況和內部生物組織結構等因素的影響。

2 結果與分析

2.1 檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性和重復性

以透光度75%的消光片為標準，對該檢測系統(tǒng)進行穩(wěn)定性和重復性測試和評價，評價參數(shù)為3個波長的光強值。（1）系統(tǒng)穩(wěn)定性檢測方法：以透光度(T)75%的消光片水平放置檢測窗口固定位置20次檢測，記錄第一波長、第二波長和第三波長的光強值Is1、Is2和Is3。（2）系統(tǒng)重復性檢測方法：以透光度75%的消光片重復水平放置至檢測窗口進行20次檢測，記錄第一波長、第二波長和第三波長的光強值Is1、Is2和Is3。該檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性檢測RSD≤0.39%，n=20；重復性檢測RSD≤0.59%，n=20。數(shù)據詳見表1。

表1 檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復性(n=20)

2.2 植株葉片葉綠素a和b測定

2.2.1 試驗方案 選取生長季節(jié)舒展開的第1、2、3片葉子，葉色均勻，盡量避開主葉脈、蟲斑、病害斑，破損部位。同時進行Arnon法和葉綠素檢測系統(tǒng)無損測定方法（以下簡稱漫反射法）進行葉綠素測定。

（1）漫反射法。按壓儀器檢測頭夾住植株代表性葉片，按“確定”鍵進行測定，并記錄葉綠素a和葉綠素b單位面積含量值(mg/cm2)。

（2）Arnon法（又稱阿爾諾法，常規(guī)法）。從植株上選取有代表性的葉片（避開粗大葉脈、病蟲害部位和灰塵特別多的葉片）打孔取樣，打孔器半徑為7 mm，準確稱取0.2 g樣本，用鑷子夾住放入25 mL離心管中，然后量取80%乙醇25 mL，蓋蓋子60℃空氣浴提取，或者室溫25℃下避光放置24 h，顏色較深葉片視情況而定，至葉片全部褪綠為止。以80%乙醇為參比溶液，在紫外-可見分光光度計上機測定，記錄波長663、645 nm處測定的吸光度值，計算見公式(7)～(10)。

式中，Ca為葉綠素a的濃度(mg/L)，Cb為葉綠素b的濃度(mg/L)，a為葉綠素a的含量(mg/cm2)，b為葉綠素b的含量(mg/cm2)，S為選取代表性葉片的葉面積(cm2)。

2.2.2 2種檢測方法的對比分析 共采集小麥樣本50個，玉米樣本95個，9種花卉樣本344個。分別進行葉綠素a和葉綠素b的漫反射法和Arnon法直線回歸，兩者的相關性均達到極顯著水平，用***表示。詳見表2。

表2 11種植株樣本2種測定方法的數(shù)據分析

2.2.3 玻璃翠葉片的測定 選取玻璃翠葉片10片，進行漫反射法和Arnon法的對比實驗，葉綠素a和葉綠素b值詳見表3。

表3 玻璃翠葉片2種測定方法葉綠素a和葉綠素b值 mg/cm2

對2種檢測方法的Chl a和Chl b分別進行回歸分析。Chl a為y=0.570x+1.189，r=0.966***；其中x表示漫反射法Chl a單位面積含量值，y表示Arnon法葉綠素a值。Chl b為y=0.299x+0.671，r=0.939***；其中x表示漫反射法葉Chl b單位面積含量值，y表示Arnon法Chl b值。漫反射法和Arnon法的Chl a和Chl b均達到極顯著相關，該檢測系統(tǒng)適用于玻璃翠花這類特殊厚度葉片的檢測。

3 結論與討論

3.1 討論

植株葉綠素無損診斷技術在作物氮素營養(yǎng)診斷及推薦施肥中具有重大意義，其中Chl a和Chl b的比值是作物病理診斷和栽培管理的重要參數(shù)之一。依據儀器工作原理葉綠素儀分為透射式和漫反射式。因其小巧、便攜，便于農業(yè)科研田間使用，該儀器具有較好的市場前景。其中，透射式葉綠素儀在國內外農業(yè)科研領域使用較多，但由于其檢測葉綠素含量較高葉片時光基本透射不過去，導致儀器測值變化不明顯，該缺陷致使其應用受限。為了解決該問題，國內以河南農業(yè)大學段鐵城教授為首的研究團隊率先進行了漫反射式葉綠素檢測技術研究，古東東等設計的3波長檢測裝置用于玉米葉片葉綠素含量與KM值相關性研究取得了重大進展，但是尚未實現(xiàn)直接輸出植株葉片葉綠素a和b值。為了實現(xiàn)該目的，同時，進一步提高測試準確度，本研究從2個方面進行了深入研究：（1）光路設計上采用陷阱式3光源3光束垂直照射，實現(xiàn)3束光投射在葉片上光斑最大面積重疊，從根本上提高重疊區(qū)信號采集率，解決測試精度問題。（2）在數(shù)據建模上引入漫反射吸光度計算公式和良好線性區(qū)間，以國際上通用的Arnon法為參照，借助偏最小二乘法、矩陣等分析法，進行了漫反射和Arnon 2種檢測方法吸光度值的回歸分析。（3）以巨厚型玻璃翠葉片為樣本，測試了葉片厚度對檢測結果的影響，結果表明漫反射法在葉片測試時不受葉片厚度的影響，本研究基本上解決了透射式葉綠素儀的使用缺陷?；诠鈱W漫反射理論的植株葉片葉綠素無損診斷技術極具發(fā)展前景。

3.2 結論

本研究基于光學漫反射理論構建3光束垂直入射和側面45°陷阱式光電傳感器數(shù)據采集的光路設計，研究檢測系統(tǒng)設計中的關鍵技術，初步建立了植株葉片葉綠素a和葉綠素b的數(shù)學預測模型。采集小麥、玉米和花卉等植株葉片進行漫反射法與Arnon法葉綠素a和b值檢測，分別進行2種檢測方法的Chl a和Chl b測值回歸分析，兩者的相關性均達到極顯著水平。大田作物、花卉等葉片厚度一般不超過1.2 mm，但一些特殊花卉如玻璃翠的葉片厚度可達3.0 mm以上，為了檢驗漫反射法是否適應對于這類厚度特殊的花卉，選取玻璃翠葉片進行2種檢測方法的測定，結果理想。