沈會芳，楊祁云，蒲小明，張景欣，孫大元，林 偉，陳雨生，林壁潤，李曉剛

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室，廣州 510640；2湛江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣東 湛江 524094；3雷州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東 湛江 524267；4濟南海關(guān)動植物檢疫處，濟南 250002）

0 引言

菠蘿(Ananas comosus)是世界第三大熱帶水果，菠蘿產(chǎn)業(yè)是華南熱區(qū)的特色產(chǎn)業(yè)，是熱區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)之一。黑腐病是菠蘿常見采后病害，在國內(nèi)主要菠蘿產(chǎn)區(qū)廣東、海南、廣西和福建等都有發(fā)生，有的產(chǎn)區(qū)發(fā)病率高達30%～40%[1]。廣州栽培的‘卡因’菠蘿，果實在常溫下貯藏14天后，發(fā)病率高達50%～60%，造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失[2]。因此，評價藥劑對病害的防治效果，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化藥劑防治技術(shù)，可為病害防治提供簡單實用的技術(shù)。菠蘿黑腐病由奇異根串珠霉(Thielaviopsis paradoxa)侵染引起[3-4]。病菌在12～38℃范圍內(nèi)可生長，適溫是25～30℃，生長pH 3～8，最適pH 5～8[5-6]。病菌主要由果實傷口侵入為害[7-8]，菠蘿采收前，天氣溫暖潮濕適于真菌的生長繁殖，潮濕后干旱易導(dǎo)致裂口，為病菌侵入提供有利條件，加重病害發(fā)生。包裝及運輸過程中損傷越大，為病菌提供侵入途徑越多，病害的發(fā)生越重[4]。采前打頂在果實上留下傷口，是采后菠蘿黑腐病發(fā)生危害的重要原因[2]。因此，采前不打頂，采收及運輸時避免機械損傷，均有較好的預(yù)防效果。低溫不利于病菌侵入，12℃低溫貯藏，可顯著減少菠蘿黑腐病的發(fā)生[2]。病菌在38℃以上不能生長，熱水處理可抑制病害發(fā)生，Wijeratnam等[9]用54℃熱水處理菠蘿果實3 min后，10℃貯藏21天，再在室溫下貯藏2天，菠蘿未發(fā)生黑腐病。利用微生物菌劑或植物提取物抑制病害也是研究熱點，Reyes等[10]發(fā)現(xiàn)畢赤酵母(Pichia guilliermondii)可降低黑腐病菌孢子萌發(fā)率、芽管長度和病菌干重，使發(fā)病率減半，對病害防治效果與8～10℃貯藏相當(dāng)。Wijesinghe等[11-12]篩選獲得棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，可抑制菌絲的生長，防控病害，處理后菠蘿在pH、可溶性固形物等方面與對照無顯著差異。Souza等[13]利用苦瓜提取物防控黑腐病，效果與噻菌靈相當(dāng)，對果實采后品質(zhì)無影響。另外，谷會等[14]發(fā)現(xiàn)1%氯化鈣處理可明顯抑制病原菌的產(chǎn)孢，對病害有一定的防治效果。唐友林等[2]報道用蠟乳劑、赤霉素GA3分別加殺菌劑多菌靈、仲丁胺或苯來特浸果處理，可明顯降低貯藏期黑腐病發(fā)生率，但赤霉素GA3的不當(dāng)使用，會誘發(fā)菠蘿另一采后病害黑心病的發(fā)生。采后菠蘿黑腐病危害嚴(yán)重，迫切需要一種能有效控制病害的方法。物理及生物防治技術(shù)還處在實驗室研究階段，無法應(yīng)用于實際生產(chǎn)，至今，化學(xué)防治仍是該病的主要防治技術(shù)。筆者評價新型高效低毒殺菌劑對黑腐病菌的抑殺效果，優(yōu)化其對菠蘿黑腐病使用技術(shù)，旨在為病害防治提供簡單實用的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實驗時間、地點

研究于2017年5月—2020年2月在廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室進行。

1.2 實驗材料

菠蘿黑腐病菌奇異根串珠霉(Thielaviopsis paradoxa)分離自海南省樂東縣菠蘿樣本，保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所。培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)，配方參照文獻[15]。藥劑包括咪鮮胺、代森錳鋅、戊唑醇、嘧菌酯、百菌清、苯醚甲環(huán)唑、甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)樣品購自上海市農(nóng)藥研究所。250 g/L咪鮮胺乳油制劑，蘇州富美實植物保護劑有限公司生產(chǎn)；菠蘿品種為‘卡因’，在菠蘿收獲期，自廣東徐聞菠蘿種植區(qū)采收，菠蘿結(jié)果至采收前未噴施任何農(nóng)藥。

1.3 7種殺菌劑對菠蘿黑腐病菌的生物活性測定

將供試原藥稀釋，取1 mL藥液加入49 mL PDA培養(yǎng)基(45℃)中，使培養(yǎng)基中殺菌劑濃度為實驗所需系列濃度。每50 mL培養(yǎng)基平均倒入3個平皿，制成含藥平板。用直徑6 mm打孔器切取病菌菌絲塊，接入平板中央，每處理5個培養(yǎng)皿，3次重復(fù)，以不加藥為對照，28℃培養(yǎng)，待對照快長滿平皿后，十字交叉法測定菌落直徑，計算藥劑抑制率和線性回歸方程及相關(guān)參數(shù)。

1.4 咪鮮胺對菠蘿黑腐病菌生長發(fā)育的影響

用無菌水洗下PDA平板上病菌分生孢子，制成106個/mL的孢子懸浮液。按1.3方法制備含藥培養(yǎng)基，使咪鮮胺濃度分別為0、0.05、0.005 μg/mL，吸取2 mL含藥培養(yǎng)基涂在無菌玻片上，凝固后滴0.1 mL孢子懸浮液，涂抹均勻。每處理20片玻片，3次重復(fù)。玻片放入培養(yǎng)皿，28℃培養(yǎng)4、8、12、16、20、24 h 時，各處理均取出3片玻片，用顯微鏡觀察孢子萌發(fā)、菌絲生長及孢子形成情況。在培養(yǎng)8 h時，每處理隨機統(tǒng)計300個孢子的萌發(fā)情況，計算孢子萌發(fā)率。

1.5 評價不同濃度咪鮮胺對菠蘿黑腐病的防治效果

將咪鮮胺乳油制劑用清水稀釋至有效成分為0、62.5、125、250、500、1000 μg/mL，將剛采收后菠蘿果實在藥劑中浸泡5 min后取出，自然晾干，置于28℃貯藏，每處理40個果實，3次重復(fù)。處理后16天觀察記錄黑腐病的發(fā)生情況，計算發(fā)病率和病情指數(shù)。

1.6 500 μg/mL咪鮮胺不同浸果時間對菠蘿黑腐病的防治效果

制備500 μg/mL咪鮮胺藥液，將菠蘿果實在藥劑中分別浸泡0、1、2、3、4、5 min后取出自然晾干，置于28℃貯藏，每處理40個果實，3次重復(fù)。處理后16天觀察記錄病害的發(fā)生情況，計算發(fā)病率和病情指數(shù)。

1.7 500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min對菠蘿黑腐病的防治效果

將菠蘿果實在500 μg/ml咪鮮胺藥液中浸泡1 min后自然晾干，置于28℃貯藏，以清水浸泡果實為對照，每處理40個果實，3次重復(fù)。處理后每隔4天觀察記錄菠蘿黑腐病的發(fā)生情況，計算發(fā)病率和病情指數(shù)。

1.8 500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min處理后在菠蘿果實中的殘留

500 μg/ml咪鮮胺藥液浸果1 min后自然晾干，28℃貯藏，取處理后2 h、1天、2天、3天、4天、5天的健康果實送至農(nóng)業(yè)部蔬菜水果質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（廣州），根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水果中咪鮮胺殘留量測定氣相液譜法》(NY/T 1456—2018)檢測樣品中咪鮮胺殘留量，每次取3個果實，3次重復(fù)。

1.9 檢測500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min處理后對果實內(nèi)在品質(zhì)的影響

500 μg/mL咪鮮胺藥液浸果1 min后自然晾干，以清水浸泡果實作為對照，28℃貯藏，分別在4、8、12、16、20天取樣，進行果實品質(zhì)指標(biāo)測定。可溶性固形物含量用手持折光儀測定，可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法，維生素C含量測定采用2,6-二氯靛酚法，總酸度測定采用酸堿中和滴定法[16]，每處理取3個果實，3次重復(fù)。

1.10 病害分級調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)計算及統(tǒng)計

1.10.1 菠蘿果實黑腐病分級調(diào)查標(biāo)準(zhǔn) 0級，果實無黑腐病斑；1級，有黑腐病斑，0%＜黑腐病腐爛面積≤10%；2級，10%＜黑腐病腐爛面積≤30%；3級，30%＜黑腐病腐爛面積≤50%；4級，50%＜黑腐病腐爛面積≤70%；5級，70%＜黑腐病腐爛面積。

1.10.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 用Excel 2007對實驗數(shù)據(jù)進行整理和繪圖，統(tǒng)計用DPS軟件，采用鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種殺菌劑對菠蘿黑腐病菌的生物活性影響

由表1可知，7種殺菌劑對病菌菌絲生長均有抑制作用，其中咪鮮胺對菌絲生長抑制作用最強，EC50為0.01 μg/mL；苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇的抑菌作用次之，EC50分別為0.03、0.05 μg/mL，代森錳鋅、百菌清的抑菌效果較差，EC50分別為 34.61、34.41 μg/mL。因此，選擇研究咪鮮胺對黑腐病菌生長發(fā)育的抑制作用。

表1 殺菌劑對菠蘿黑腐病菌的生物活性影響

2.2 咪鮮胺對菠蘿黑腐病菌生長發(fā)育的影響

用0.005、0.05 μg/mL的咪鮮胺處理病原菌，以加無菌水為對照。培養(yǎng)4 h，對照及2個處理的孢子均開始萌發(fā)。培養(yǎng)8 h，芽管延長，統(tǒng)計孢子萌發(fā)情況，對照及0.005、0.05 μg/mL咪鮮胺處理的孢子萌發(fā)率分別為91.67%、84.50%、74.33%，差異顯著。12 h時，對照芽管伸長為菌絲；0.005 μg/mL咪鮮胺處理芽管伸長，但長度明顯小于對照；0.05 μg/mL咪鮮胺處理芽管未伸長（圖1）。培養(yǎng)16 h和20 h時，對照菌絲迅速伸長，交織成網(wǎng)狀；0.005 μg/mL咪鮮胺處理的芽管伸長成菌絲，交織成網(wǎng)狀，但菌絲量明顯低于對照；0.05 μg/mL咪鮮胺處理的芽管未形成菌絲。24 h時，對照菌絲致密，產(chǎn)生大量孢子；0.005 μg/mL咪鮮胺處理菌絲交織成疏松網(wǎng)狀，未見孢子產(chǎn)生；0.05 μg/mL咪鮮胺處理仍未形成菌絲。結(jié)果表明，0.005 μg/mL咪鮮胺可抑制菌絲生長和孢子形成；當(dāng)濃度增加到0.05 μg/mL時，可抑制芽管分化形成菌絲，從而嚴(yán)重抑制病菌的生長發(fā)育過程。

圖1 咪鮮胺對菠蘿黑腐病菌生長發(fā)育的影響

2.3 不同濃度咪鮮胺對菠蘿黑腐病的防治效果

采用不同濃度咪鮮胺藥劑浸果5 min，實驗結(jié)果見圖2，對照組果實發(fā)病率為53.33%，病情指數(shù)為38.25%。不同濃度咪鮮胺藥劑對病害均有防治效果，果實發(fā)病率和病情指數(shù)隨咪鮮胺濃度的增加而下降。咪鮮胺濃度增加到500、1000 μg/mL時，果實發(fā)病率分別為20.04%、17.43%，病情指數(shù)為8.94%、7.85%，病害防治效果較好，分別為76.62%、79.47%，兩者防治效果差異不顯著。因此，選擇低濃度500 μg/mL作為菠蘿黑腐病的防治濃度。

圖2 不同濃度咪鮮胺藥劑對菠蘿黑腐病的防治效果

2.4 500 μg/mL咪鮮胺不同浸果時間對菠蘿黑腐病的防治效果

由圖3可見，對照菠蘿果實發(fā)病率為51.25%，病情指數(shù)為35.17%。不同浸果時間的黑腐病發(fā)病率和病情指數(shù)均明顯下降，浸泡1、2、3、4、5 min，對黑腐病的防治效果分別為76.51%、71.33%、75.80%、73.78%、77.19%，防治效果差異不顯著。因此選用較短時間1 min作為防治菠蘿黑腐病的浸果時間。

圖3 500 μg/mL咪鮮胺不同浸果時間對菠蘿黑腐病的防治效果

2.5 500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min對菠蘿黑腐病的防治效果

貯藏8、12、16天，咪鮮胺對黑腐病的防治效果均達70%～75%，防治效果穩(wěn)定（表2）。貯藏20天，防治效果為67.44%。貯藏24天，對照組部分菠蘿果實完全腐爛，實驗數(shù)據(jù)不能真實反映咪鮮胺對黑腐病的防治效果，停止調(diào)查。處理組24天的果實發(fā)病率和病情指數(shù)與對照組12天的果實相當(dāng)，表明500 μg/mL咪鮮胺浸泡菠蘿果實1 min，可持續(xù)有效防治菠蘿黑腐病，大幅度延長菠蘿果實貨架期。

表2 500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min對菠蘿黑腐病的防治效果%

2.6 500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min處理后在菠蘿果實中的殘留

咪鮮胺殘留結(jié)果見表3，500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min處理后，2 h取樣分析咪鮮胺原始沉積量，全果為2.142 mg/kg，果肉<0.01 mg/kg，表明咪鮮胺藥劑浸果后，殘留主要集中于菠蘿果皮上，果肉中殘留極低。處理后1、2、3、4、5天的咪鮮胺殘留均低于 GB 2763—2019規(guī)定的咪鮮胺在皮不可食熱帶和亞熱帶水果的7 mg/kg最高殘留限量(MRL)。表明用500 μg/mL咪鮮胺浸泡菠蘿果實1 min后，不影響菠蘿產(chǎn)品安全。

表3 500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min后在菠蘿果實中的殘留檢測結(jié)果 mg/kg

2.7 500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min處理對果實內(nèi)在品質(zhì)的影響

500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min后，28℃貯藏4、8、12、16、20天，取樣檢測咪鮮胺對菠蘿果實內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)，結(jié)果見圖4。與清水處理的對照相比，處理組可溶性固形物、總糖、總酸均差異不顯著，但維生素C的含量在處理后8～20天均明顯高于清水對照組。表明咪鮮胺處理可延緩菠蘿果實采后衰老過程中維生素C含量的降低，保持菠蘿內(nèi)在品質(zhì)。

圖4 500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min后對菠蘿內(nèi)在品質(zhì)的影響

3 結(jié)論

咪鮮胺對菠蘿黑腐病菌有較強的抑殺作用，對菌絲的EC50為0.01 μg/mL。咪鮮胺主要通過抑制芽管分化形成菌絲，從而嚴(yán)重抑制病菌的整個生長發(fā)育過程。用500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min，28℃貯藏8、12、16天時，對黑腐病的防治效果可達70%～75%，防控效果穩(wěn)定，大幅度延長菠蘿貨架期，且可延緩菠蘿果實采后衰老過程中維生素C含量的降低，保持菠蘿內(nèi)在品質(zhì)，處理后咪鮮胺殘留均低于GB 2763—2019規(guī)定的咪鮮胺在皮不可食熱帶和亞熱帶水果的7 mg/kg最高殘留限量(MRL)，不影響菠蘿產(chǎn)品安全。

4 討論

實驗發(fā)現(xiàn)，‘卡因’菠蘿對黑腐病菌較敏感，果實在28℃貯藏16天，黑腐病發(fā)病率在50%以上，嚴(yán)重的可達70%以上。常見栽培品種‘巴厘’在28℃貯藏16天，黑腐病發(fā)病率在35%以上，嚴(yán)重的可達50%以上，損失較大。因此，篩選高效、低毒、低殘留防治藥劑成為當(dāng)務(wù)之急。生物測定表明，咪鮮胺對病菌菌絲生長的抑制作用較強，EC50為0.01 μg/mL；苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇的抑菌作用次之，EC50分別為0.03、0.05 μg/mL，研究結(jié)果與谷會等[6]的報道基本一致。而常用于黑腐病防治的廣譜殺菌劑代森錳鋅和百菌清的抑菌效果較差，EC50分別為34.61、34.41 μg/mL，因此，菠蘿黑腐病防治藥劑的更新?lián)Q代勢在必行。咪鮮胺可抑制病菌孢子萌發(fā)，0、0.005、0.05 μg/mL咪鮮胺處理的病菌孢子萌發(fā)率分別為91.67%、84.50%、74.33%，差異顯著。但咪鮮胺對病菌菌絲生長的抑制作用更加明顯，0.05 μg/mL咪鮮胺處理后，孢子可萌發(fā)形成芽管，但芽管不能正常分化形成菌絲，從而嚴(yán)重抑制病菌的整個生長發(fā)育過程。

500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min后，28℃室溫貯藏12、16、20天時，對菠蘿黑腐病的防治效果均在70%～75%之間，防治效果穩(wěn)定，有效延長了菠蘿貨架期。500 μg/mL是在咪鮮胺防治柑橘、香蕉、芒果等作物貯藏期病害所使用濃度范圍之內(nèi)，只需1次浸果即可有效防治黑腐病。咪鮮胺是英國Boots公司1977年合成的廣譜高效咪唑類殺菌劑，通過抑制麥角幽醇的生物合成，破壞菌體細胞膜功能而起作用[17]，廣泛用于防治尾孢屬、核腔菌屬、喙孢屬、核盤菌屬、鐮孢屬及白粉菌、炭疽菌等多種作物子囊菌和半知菌病害，有顯著的治療和鏟除作用[17-18]。查詢中國農(nóng)藥信息網(wǎng)，咪鮮胺已登記在柑橘、香蕉、芒果等水果上，用于果實采后病害防治及保鮮，在紅毛丹[19]、火龍果[20]、番石榴[21]、荔枝[22]、石榴[23]等水果上也有相關(guān)研究，但尚未有在菠蘿上使用的研究報道。GB 2763—2016未規(guī)定菠蘿的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，但規(guī)定咪鮮胺在皮不可食熱帶和亞熱帶水果上7 mg/kg最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，本研究的殘留檢測表明500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min后，2 h取樣的原始咪鮮胺沉積量為2.142 mg/kg，低于7 mg/kg。鄭雪虹等[24]報道香蕉貯藏采用濃度450 mg/kg咪鮮胺浸果1 min，且浸果1次，2 h后常溫條件下原始沉積量為2.315 mg/kg，低于咪鮮胺在香蕉上的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)5 mg/kg。經(jīng)咪鮮胺處理的菠蘿果實的可溶性固形物、總糖、總酸與對照差異不顯著，但維生素C含量明顯高于對照。巴良杰等[25]也報道咪鮮胺可有效延緩火龍果采后衰老過程中維生素C含量的降低，能較好地保持果實的營養(yǎng)品質(zhì)。本實驗結(jié)果表明，500 μg/mL咪鮮胺浸果1 min后可有效防治菠蘿果實采后黑腐病，延緩菠蘿采后衰老過程中維生素C含量的降低，保持菠蘿果實的品質(zhì)，且不影響菠蘿產(chǎn)品安全。

本研究評價了咪鮮胺對菠蘿黑腐病菌的抑殺效果，提出用500 μg/mL咪鮮胺藥劑浸果1 min以防治黑腐病，該技術(shù)操作簡單，成本較低，防病效果明顯，在菠蘿生產(chǎn)中極具推廣應(yīng)用價值，但咪鮮胺對病害的防治效果還需要在生產(chǎn)上進行驗證，因此下一步工作將通過田間應(yīng)用驗證咪鮮胺對菠蘿黑腐病的防治效果，并進行示范推廣。