馬光宗，楊云海，徐高峰，楊韶松，張付斗，申時才，葉 敏

（1云南農(nóng)業(yè)大學/云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，昆明 650201；2云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)跨境有害生物綠色防控重點實驗室，昆明 650205）

0 引言

植物化感物質(zhì)是主體植物釋放的次生代謝產(chǎn)物，通過自身根系分泌，莖葉雨霧淋溶、揮發(fā)或者殘體分解等多種途徑釋放到自然界中，從而抑制或者促進其他植物生長[1]。目前，田間雜草是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素之一，防控措施以化學除草劑為主，大量除草劑的使用不僅產(chǎn)生了抗藥性，更為嚴重的是其本身高毒、高殘留，難以在生態(tài)環(huán)境中降解[2]。化感作用作為一種環(huán)境友好型的生態(tài)控草方法受到越來越多的關(guān)注。利用作物自身遺傳的防御或抗逆能力，很少產(chǎn)生殘留等環(huán)境危害，對農(nóng)田雜草生態(tài)治理體系具有重要的研究和應用價值[3-4]。因此，研究植物化感作用對植物源除草劑的開發(fā)利用以及實現(xiàn)農(nóng)田雜草生態(tài)管理具有重要意義。

苦蕎(Fagopyrum tataricum)起源于中國和亞洲北部地區(qū)，為蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)一年生雙子葉作物[5]，具有生育期短、耐冷涼、耐貧瘠、適應性較強等特點，常作為山區(qū)、丘陵區(qū)輪作換茬的重要作物之一[6]。作為一種重要的小宗雜糧作物和藥食同源植物，苦蕎在中國主要分布于西南、華北、西北等省區(qū)[7]。苦蕎含有豐富的營養(yǎng)和保健成分，尤其是在預防糖尿病、高血糖、高血脂等方面有重要作用[8-9]。隨著人們對苦蕎保健價值的肯定，其營養(yǎng)價值與藥用價值、種質(zhì)資源與農(nóng)藝性狀、栽培技術(shù)、遺傳多樣性等受到廣泛的研究[10-11]。有研究表明，金蕎麥地上部和地下部不同溶劑提取物對細菌和真菌有一定的抑制作用，抑菌活性成分為一些極性較強的物質(zhì)[12]，苜蓿和蕎麥混播時苜蓿產(chǎn)草與蕎麥播種量和產(chǎn)量呈負相關(guān)[13]，適量的秸稈還田具有良好的雜草抑制效應及苦蕎增產(chǎn)效應[10]，苦蕎不同部位提取物對油菜和苜蓿具有明顯的化感作用[14]。然而，目前關(guān)于苦蕎對農(nóng)田雜草的控制作用、化感作用及其化感物質(zhì)方面研究甚少。

筆者采用水提液溶劑梯度萃取法提取苦蕎化感物質(zhì)，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析鑒定萃取物中的化學成分，并以馬唐(Digitaria sanguinalis)和三葉鬼針草(Bidens pilosa)2種雜草為受體植物測定了萃取物的化感潛力，以期將苦蕎應用于農(nóng)田雜草控制，為其活性物質(zhì)用于新型除草劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

苦蕎于2020年采自云南省曲靖市師宗縣葵山鎮(zhèn)，為村民長期種植的本地品種。

馬唐和三葉鬼針草為云南省部分主要的農(nóng)田惡性雜草種類，2019年在云南省各主要分布區(qū)采集的種子，經(jīng)鑒定后保存于云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 苦蕎萃取物的提取和制備 稱取500 g陰干粉碎后的苦蕎，其中包括地上部分350 g、地下部分150 g。按1:5(w/w)的固液比加入蒸餾水，浸泡24 h，浸泡期間采用超聲波水浴（超聲波頻率35 kHz，功率500 W，溫度25℃）輔助提取，過濾得濾液，再將過濾后的殘渣重復上述操作，合并2次提取所得濾液，得到固液比為1:10(w/w)的苦蕎水浸提液。采用溶劑梯度萃取法，按溶劑極性從小到大的順序用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇將所得的水提液順序萃取4次，合并相應的萃取液，將各有機溶劑萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到相對應的提取物浸膏。將所得到的浸膏分別裝入棕色廣口瓶中，密封保存與4℃冰箱備用。

1.2.2 苦蕎萃取物成分分析 將苦蕎石油醚相和乙酸乙酯相萃取物用乙酸乙酯配制成1000 mg/L的溶液，采用GC-MS進行化學成分分析（氣相色譜儀Agilent7890，四級桿質(zhì)譜儀Agilent5975N）。GC分析條件：HP-5MS石英毛細管柱（內(nèi)徑30 m×0.25 mm，膜厚0.25μm）；進樣口溫度230℃；柱溫初始溫度40℃，保持2 min，以5℃/min的速率升溫至250℃，保持6 min，柱流量為1.0 mL/min；進樣量1.0μL；分流比5:1。MS分析條件：電離方式EI，電離能70 eV，四級桿溫度150℃，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，掃描質(zhì)量范圍 50～550m/z，載氣(He)流速1.0 mL/min，溶劑延遲6 min。2種萃取物GC-MS分析數(shù)據(jù)采用NIST08標準譜庫檢索。

1.2.3 生物活性測定 選取大小一致且無殘缺、籽粒飽滿、發(fā)芽率在90.0%以上的馬唐和三葉鬼針草種子，用10.0%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，蒸餾水漂洗3次，晾干備用。稱取一定量萃取物浸膏，先使用少量丙酮溶解（最終濃度為3.0%，前期試驗表明不影響植物正常生長），然后用蒸餾水稀釋至濃度2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL藥液，分別吸取1 mL藥液均勻倒入放有雙層濾紙鋪的直徑為3 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中均勻放置10粒已消毒的馬唐或三葉鬼針草種子，以加入3.0%丙酮的水溶液為對照，各設置3次重復。置于人工氣候箱中恒溫培養(yǎng)，溫度25℃、相對濕度70.0%、出芽后每天光照12 h。試驗總萌發(fā)時間為7天，試驗結(jié)束時統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)，測量各植株株高、根長。

1.3 數(shù)據(jù)處理

化感作用響應指數(shù)(response index，RI)采用Willamson等[15]的公式計算，如式(1)。

式中，T為處理值，C為對照值。RI>0表示促進作用，RI<0表示抑制作用，RI=0表示既無促進作用也無抑制作用，絕對值的大小與作用強度一致。

采用DPSV 9.50版軟件進行數(shù)據(jù)分析，并采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗，Duncan’s新復極差法進行多重比較，分析不同處理間的差異。采用Excel進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎萃取物成分分析

苦蕎通過水提液溶劑梯度萃取得到石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相3種萃取物，得率分別為0.02%、0.06%和0.24%(w/w)。生物測定結(jié)果表明，正丁醇相中活性物質(zhì)成分含量較低，且多數(shù)為大分子物質(zhì)，因此選擇石油醚相和乙酸乙酯相進行化學成分分析。利用GC-MS分析法從石油醚相中鑒定出24種含量大于0.5%的化學成分，占總出峰面積的98.7%（圖1和表1），主要成分為4-乙基苯酚(26.8%)、5-羥基-6-甲氧基-呋喃并[3，2-g]色烯-7-酮(9.5%)、棕櫚酸(9.0%)、4-甲基吲哚(9.0%)、吲哚(8.2%)，其余含量均低于5.0%。從乙酸乙酯相中鑒定出19種含量大于0.5%的化學成分，占總出峰面積的97.6%（圖2和表2），主要成分為四氫熏衣草醇(20.7%)、異次羊脂酸(12.0%)、正二十八烷(11.3%)、4-乙基苯酚(8.7%)、2-甲基丁酸(7.9%)、偏三甲苯(5.8%)、棕櫚酸(5.1%)，其余含量均低于5.0%。其中，石油醚相和乙酸乙酯相中均鑒定出4-乙基苯酚和棕櫚酸2種成分。

圖1 苦蕎石油醚相總離子流圖

圖2 苦蕎乙酸乙酯相總離子流圖

表1 苦蕎石油醚相的化學成分

續(xù)表1

表2 苦蕎乙酸乙酯相的化學成分

續(xù)表2

2.2 苦蕎萃取物對馬唐和三葉鬼針草種子萌發(fā)的影響

苦蕎萃取物對馬唐和三葉鬼針草種子的萌發(fā)均有不同程度的抑制作用，萃取物濃度顯著影響馬唐和三葉鬼針草的種子萌發(fā)（表3）。隨著供體萃取物濃度的逐漸升高，對受體種子萌發(fā)的抑制作用顯著增強。石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相3種萃取物濃度為1.00和2.00 mg/mL時，馬唐和三葉鬼針草的萌發(fā)率顯著高于對照。濃度為2.00 mg/mL時，乙酸乙酯相處理下馬唐和三葉鬼針草的發(fā)芽率均為0.0%，石油醚相處理下馬唐和三葉鬼針草的發(fā)芽率與對照相比下降了80.0和56.7個百分點，正丁醇相處理下馬唐和三葉鬼針草的發(fā)芽率與對照相比下降了60.0和26.7個百分點，均與對照差異顯著。3種萃取物對馬唐和三葉鬼針草的影響效果因濃度不同而有所差異，低濃度(0.25～0.50 mg/mL)處理下馬唐種子萌發(fā)率均大于或等于三葉鬼針草，而高濃度(1.00～2.00 mg/mL)處理下馬唐種子萌發(fā)率均小于三葉鬼針草。結(jié)合化感響應指數(shù)RI值分析，3種萃取物對馬唐和三葉鬼針草發(fā)芽率的抑制由強至弱表現(xiàn)為乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相。

表3 苦蕎萃取物對2種雜草種子發(fā)芽率的影響

2.3 苦蕎萃取物對馬唐和三葉鬼針草幼苗生長的影響

2.3.1 苦蕎萃取物對馬唐和三葉鬼針草莖長的影響 研究結(jié)果（表4和圖3～4）顯示，經(jīng)萃取物處理的種子生長分化后，馬唐和三葉鬼針草幼莖長度與萃取物濃度總體上呈負相關(guān)，抑制作用為乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相。乙酸乙酯相各濃度處理莖長抑制率均大于石油醚相和正丁醇相（除0.25 mg/mL濃度外），2.00 mg/mL處理濃度下，乙酸乙酯相能完全抑制馬唐和三葉鬼針草幼莖的生長，石油醚相的抑制率分別為81.0%和60.0%，而正丁醇相的抑制率僅為49.0%和22.0%。正丁醇相在低濃度(0.25 mg/mL)處理濃度下對馬唐的莖長化感響應指數(shù)分別為0.10，在0.25～0.50 mg/mL處理濃度下對三葉鬼針草的莖長化感響應指數(shù)為分別為0.03和0.05，其余處理均為負值，具有“低促高抑”的現(xiàn)象。相同處理下馬唐的莖長化感響應指數(shù)均小于三葉鬼針草，說明2種雜草對莖長敏感度馬唐要強于三葉鬼針草。

表4 苦蕎萃取物對2種雜草幼苗生長化感效應指數(shù)的影響

圖3 苦蕎萃取物對馬唐幼莖和幼根生長的影響

圖4 苦蕎萃取物對三葉鬼針草幼莖和幼根生長的影響

2.3.2 苦蕎萃取物對馬唐和三葉鬼針草根長的影響研究結(jié)果表明，苦蕎萃取物處理馬唐和三葉鬼針草種子對其幼根長度的影響不同，抑制效果隨著濃度的增大而增強。其中乙酸乙酯相抑制效果最明顯，濃度大于0.50 mg/mL對2種雜草的抑制率達61.0%以上，2.00 mg/mL濃度處理能完全抑制馬唐和三葉鬼針草幼根的生長。同樣的，石油醚相也具有較好的抑制效果，2.00 mg/mL濃度處理能完全抑制馬唐和三葉鬼針草幼根的生長。正丁醇相效果最差，2.00 mg/mL濃度處理對馬唐和三葉鬼針草幼根僅有53.0%和29.0%的抑制率，且在0.25 mg/mL濃度處理下根長化感響應指數(shù)分別為0.08和0.06，說明低濃度具有促進幼根生長的作用。從3種萃取物對馬唐和三葉鬼針草莖長和根長的化感響應指數(shù)對比看，對根長的抑制作用要大于莖長。

3 討論

3.1 受體植物及評測指標選擇優(yōu)勢

化感物質(zhì)作為植物間的一種重要化學信號物質(zhì)，作用于植物的不同生長發(fā)育階段而對植物產(chǎn)生影響，如影響種子萌發(fā)和植物生長等，最終導致植物種群被抑制[16-17]。因此，利用化感作用可以選擇性地對一些惡性雜草進行防控[18]。馬唐和三葉鬼針草通常為農(nóng)田上的主要雜草，三葉鬼針草為入侵性雜草，而馬唐則為本地惡性雜草[19-20]。2種雜草通常具有種子數(shù)量大、種子萌發(fā)率高、生長速度快等特征，因此在雜草群落中容易形成單一群落或成為優(yōu)勢種群，從而對農(nóng)作物蔬菜、玉米、甘蔗等造成嚴重的危害[19-20]。本研究表明，苦蕎3種萃取物對馬唐和三葉鬼針草種子萌發(fā)、幼苗根長和莖長均有一定的抑制作用，且隨濃度增加而顯著增強。種子萌發(fā)對植物生長發(fā)育至關(guān)重要，化感物質(zhì)對種子萌發(fā)的抑制，會降低種子發(fā)芽速度，延長出苗時間，嚴重影響植物對地上和地下資源的競爭能力[21-22]。因此，苦蕎的種植可以抑制土壤種子庫中馬唐和三葉鬼針草種子的萌發(fā)和幼苗生長，從而降低其種群密度和危害。

3.2 化感作用響應指數(shù)評價

化感作用響應指數(shù)用于度量化感作用的類型和強度[15]，其中對受體植物種子萌發(fā)、根長和莖長的影響通常是衡量化感作用強度最重要的指標。本研究表明，苦蕎不同有機溶劑萃取物對馬唐和三葉鬼針草的種子發(fā)芽率、根長和莖長的化感響應指數(shù)變化趨勢基本一致。3種不同萃取物中，乙酸乙酯相的化感作用響應指數(shù)最低，即對馬唐和三葉鬼針草的化感抑制作用最強，其次是石油醚相，最差的是正丁醇相，這與王力超[23]報道乙酸乙酯萃取物對入侵植物喜旱蓮子草幼苗生長的化感抑制作用最強，其次是石油醚萃取物和正丁醇萃取物相一致。3種不同萃取物對馬唐的抑制作用大于三葉鬼針草，對根長的抑制明顯大于莖長，這與申時才[22]報道的紅薯葉片水浸液對馬唐和三葉鬼針草的種子萌發(fā)和幼苗生長一致。

3.3 苦蕎活性物質(zhì)成分分析

苦蕎中含有豐富的生理活性物質(zhì)，而這些物質(zhì)往往以次生代謝產(chǎn)物為主，主要包括黃酮類、甾體類、有機酸類、酚類、糖類和脂肪酸類[24-29]等。已有研究表明，有機酸類、酚類和黃酮類物質(zhì)為化感活性主要物質(zhì)[29]。本研究中，利用GC-MS分析法分別從石油醚相和乙酸乙酯相中鑒定出24種和19種化學成分，含量均高于0.5%，分別占總出峰面積的98.7%和97.6%。其中石油醚相的主要成分為4-乙基苯酚(26.8%)，乙酸乙酯相的主要成分為四氫熏衣草醇(20.7%)。Jane?等[30]報道苦蕎中的香氣物質(zhì)主要是2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)呋喃酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛、苯乙醛、2-甲氧基-4-乙烯苯酚等。Kim等[31]報道了苦蕎種子中含有綠緣酸、葒草素、異東方蓼黃素、蘆丁和槲皮苷等。汪嘉慶等[32]從苦蕎中鑒定出烏蘇酸、山柰酚、槲皮素、大黃素、糖苷、蘆丁等。這些結(jié)果與本研究的主要成分差異較大，可能由研究目的、苦蕎品種以及提取工藝差異較大所導致。本研究中鑒定出的絕大多數(shù)化學成分尚未有相關(guān)生物活性的報道，因此需要進一步驗證。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，苦蕎水提液的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇相萃取物對2種雜草馬唐和三葉鬼針草的種子萌發(fā)和幼苗生長均表現(xiàn)出不同程度的化感抑制作用，活性依次為乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相，且抑制效果與濃度呈正相關(guān)。萃取物對馬唐的抑制作用總體上大于三葉鬼針草，對根長抑制率大于莖長。利用GC-MS對乙酸乙酯相和石油醚相的化學成分分析表明，乙酸乙酯相和石油醚相中含量大于0.5%的化學成分有41種，其中乙酸乙酯相的主要成分為四氫薰衣草醇、異次羊脂酸、正二十八烷，含量占比分別為20.7%、12.0%、11.3%。石油醚相的主要成分為4-乙基苯酚、5-羥基-6-甲氧基-呋喃并[3,2-g]色烯-7-酮、棕櫚酸、4-甲基吲哚，含量占比分別為26.8%、9.5%、9.0%、9.0%。關(guān)于各種化學成分的化感活性和化感作用機制有待于進一步研究，以找到植物源除草劑先導化合物，為苦蕎大面積的田間替代種植提供理論依據(jù)。