李建華 侯 靜 黃登亮 田美媛 張耀剛 劉 哲 馬艷艷

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種引起肝臟脂肪沉積的疾病，發(fā)生于男性飲酒量<30g/d，女性飲酒量<20g/d的人群[1]。根據(jù)病理診斷，NAFLD可分為單純性脂肪變性和脂肪性肝炎。進(jìn)展型非酒精性脂肪肝，即非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，可導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌[2]。隨著社會經(jīng)濟(jì)水平的提高，不良生活方式和飲食習(xí)慣使得NASH的發(fā)生率顯著提高。NASH影響世界25%人口，已經(jīng)成為世界重大公共衛(wèi)生問題，預(yù)計在2016～2030年期間，與NASH相關(guān)的病死率將增長1倍[3, 4]。研究發(fā)現(xiàn)，部分NASH患者發(fā)展成肝硬化,其風(fēng)險遠(yuǎn)高于單純性脂肪肝[5]。

目前，甘油三酯(triglyceride, TG)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)是臨床上評價肝功能的常用指標(biāo)，NASH引起TG、AST、ALT升高，同時研究也發(fā)現(xiàn)血漿高濃度TG可以引起脂肪變性[6，7]。飽和脂肪酸到單不飽和脂肪酸比率影響細(xì)胞的生長和分化，這一比率的改變可造成肝功能紊亂、小腸炎癥等疾病[8]。油酸屬于單不飽和脂肪酸，是人類飲食中最豐富的脂質(zhì)形式之一，與其他脂肪酸比較，其在循環(huán)中的含量相對較高，常被用來建造非酒精性脂肪肝模型[9～12]。目前NASH的研究主要集中肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)及凋亡，很少有研究報道在NASH肝細(xì)胞中油酸代謝產(chǎn)生的活性氧(ROS)是如何影響細(xì)胞周期及凋亡。

細(xì)胞模型常被用于研究脂肪變性，研究常采用HepG2及L02細(xì)胞系， AML-12是正常小鼠肝臟細(xì)胞，本研究通過油酸處理AML-12細(xì)胞建立NASH細(xì)胞模型，觀察細(xì)胞脂肪變性，分析ROS、周期及細(xì)胞損傷變化，為NASH的發(fā)病機(jī)制及預(yù)防提供理論基礎(chǔ)[10～12]。

材料與方法

1.材料：小鼠AML-12細(xì)胞株購自上海通派生物科技有限公司。油酸(貨號：01008)、油紅O(貨號：00625)、DMSO(貨號：34943)購自美國Sigma公司；DMEM(貨號：2230805)購自美國Gibco公司；ROS檢測試劑盒(貨號：S0033M)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V-PI凋亡試劑盒(貨號：556547)購自美國BD公司；TG(貨號：A110-1-1)、AST(貨號：C010-2-1)、ALT(貨號：C009-2-1)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒(貨號：RN:R11053.9)購自廣州瑞博生物科技有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及處理：小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML-12用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。含有10ml DMEM的100mm培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞1×106個，細(xì)胞貼壁4h后，加入60μg/ml油酸，分別在第24、48、72h測定細(xì)胞上清液TG、ALT、AST含量，同時收集細(xì)胞進(jìn)行凋亡和周期檢測。在含有2ml DMEM的6孔板中接種2×105個細(xì)胞，貼壁4h后，加入60μg/ml油酸，72h后進(jìn)行油紅O、EdU染色。

3.TG、AST、ALT測定：分別收集24、48、72h細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照南京建成TG、AST、ALT檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測。(1)TG檢測原理：TG在脂肪酶的作用下生成甘油及脂肪酸，甘油及ATP在甘油激酶的作用下生成甘油-3-磷酸和ADP，甘油-3-磷酸在3-磷酸甘油氧化酶的作用下生成磷酸羥基丙酮和H2O2，H2O2和4-AAP及對氯酚在過氧化物酶的作用下生成紅色醌化物。通過510nm波長檢測，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求酶活力單位。(2)AST檢測原理：AST能使α-酮戊二酸和天門冬氨酸移換氨基和酮基，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反應(yīng)過程中可自行脫羧成丙酮酸。丙酮酸與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成2,4-二硝基苯腙，在堿性溶液中顯紅棕色。通過510nm波長檢測，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求酶活力單位。(3)ALT檢測原理：ALT在37℃及pH7.4條件下，作用于丙氨酸及α-酮戊二酸組成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。反應(yīng)30min后加入2,4-二硝基苯肼鹽酸溶液，即中止反應(yīng)，同時2,4-二硝基苯肼與酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙。苯腙在堿性條件下呈紅棕色，通過510nm波長檢測，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求酶活力單位。

4.油紅O染色觀察脂滴形成：稱取油紅O粉末溶于異丙醇中，配制成5mg/ml儲存液，避光密封保存。油紅O儲存液∶雙蒸水=3∶2稀釋成工作液，用定性濾紙過濾，室溫放置10min，現(xiàn)配現(xiàn)用。吸取棄掉6孔板中的培養(yǎng)基，用2ml PBS漂洗1遍，加10%中性甲醛固定30min，棄掉甲醛，加入2ml油紅O工作液，染色10min。棄掉油紅O，加入2ml PBS洗1遍，棄掉PBS，加入60%異丙醇脫色，棄掉脫色液，加入2ml PBS在顯微成像儀下觀察脂滴形成情況。

5.EdU染色觀察：EdU染色按照銳博EdU細(xì)胞增殖檢測使用說明書進(jìn)行操作，之后用Cytation5 細(xì)胞顯微成像儀觀察，并用儀器自帶軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

6.ROS流式檢測：每支流式管中加入1×106個細(xì)胞，同時加入10μmol/L的ROS檢測熒光探針，37oC避光孵育20min，加1ml PBS重懸細(xì)胞，450×g離心5min，倒掉上清，加入400μl PBS重懸上機(jī)。

7.細(xì)胞周期流式檢測：每支流式管中加入1×106個細(xì)胞，加入1ml 70%乙醇，渦旋混勻，4oC固定30min，450×g離心5min倒掉上清，加1ml PBS重懸細(xì)胞，450×g離心5min倒掉上清，加100μl PBS，再加入1μl RNase A(10mg/ml)和5μl PI，渦旋混勻，避光孵育15min，加1ml PBS重懸細(xì)胞，450×g離心5min，倒掉上清，加入400μl PBS重懸上機(jī)。

8.細(xì)胞凋亡流式檢測：每支流式管中加入1×106個細(xì)胞，加入PI和Annix V各5μl，渦旋混勻，避光孵育15min，加入400μl Binding buffer 染色緩沖液，渦旋混勻上機(jī)。

結(jié) 果

1.TG、ALT、AST測定：在24、48及72h分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液TG、ALT、AST含量，發(fā)現(xiàn)處理組TG含量在24、48及72h比對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，24、48h 時ALT、AST比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，72h時ALT、AST比對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)上清液TG、ALT、AST柱狀圖A.TG;B.ALT;C.AST

2.油紅O染色脂滴形成情況：72h后，油紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)60μg/ml油酸處理后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見橘紅色脂滴形成，印戒形脂滴形成明顯(圖2中A、B)，經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)處理組油O平均吸光度比對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2C)，說明油酸處理后形成了脂肪變性現(xiàn)象。

圖2 72h脂滴顯微成像及統(tǒng)計圖A.處理組油紅O染色圖(×20)；B.對照組油紅O染色圖(×20)；C.柱狀圖；D.處理組油紅O染色圖(×4); E.對照組油紅O染色圖(×4)

3.EdU染色結(jié)果分析：72h后，EdU染色結(jié)果顯示處理組比對照組陽性高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，因此60μg/ml油酸處理后進(jìn)入S期細(xì)胞增多(圖3)。

圖3 72hEdU染色成像散點圖及柱狀圖(EdU染色，×4)A.處理組成像圖；B.對照組成像圖；C.處理組散點圖；D.對照組散點圖；E.柱狀圖

4.流式ROS結(jié)果分析：油酸處理細(xì)胞72h后，經(jīng)過流式檢測分析發(fā)現(xiàn)，處理組與對照組比較，ROS明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000，圖4)。

圖4 細(xì)胞ROS流式單參數(shù)直方及柱狀圖A.處理組；B.對照組；C.柱狀圖

5.流式周期結(jié)果分析：油酸處理細(xì)胞72h后，經(jīng)過流式檢測分析發(fā)現(xiàn)，處理組與對照組相比G0/G1期細(xì)胞降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，S期細(xì)胞數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，G2/M期沒有變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖5)。

圖5 流式細(xì)胞周期分析圖A.處理組；B.對照組；C.統(tǒng)計圖

6.流式凋亡結(jié)果分析：油酸處理細(xì)胞72h后，經(jīng)過流式檢測分析發(fā)現(xiàn)，處理組細(xì)胞凋亡比對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，處理組壞死比對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖6)。

圖6 細(xì)胞凋亡及壞死散點圖及柱狀圖A.處理組；B.對照組；C.柱狀圖

討 論

NASH是肝功能不全最常見的原因之一，肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積過多是其主要特征之一，主要由高脂飲食引起。長期高脂飲食可以增加血液中的游離脂肪酸(FFA)水平，增強外周脂肪組織的脂肪分解，導(dǎo)致甘油三酯及游離脂肪酸在肝臟中的積累。脂質(zhì)的過氧化、線粒體功能紊亂、炎癥都可能最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和肝纖維化，研究也發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸可降低肝細(xì)胞的存活率并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時NASH患者8-羥基-脫氧鳥苷可引起DNA的氧化損傷，油酸屬于游離脂肪酸在誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝發(fā)生、發(fā)展過程中起了一定作用[13，14]。

潘雪豐等[12]研究發(fā)現(xiàn)60μg/ml油酸處理L02細(xì)胞24、48及72h后，形成橘紅色脂滴較明顯，本研究通過60μg/ml油酸處理AML-12細(xì)胞24、48h后發(fā)現(xiàn)，TG升高，ALT及AST并沒有升高，因此24、48h只是造成脂滴形成，脂肪變性，但并未造成肝細(xì)胞實質(zhì)性損傷，72h后TG、AST、ALT比對照組升高，說明72h后造成了肝細(xì)胞實質(zhì)性損傷。因此，非酒精性脂肪肝造成的損傷是長時間脂代謝障礙引起的，可導(dǎo)致肝臟甘油三酯的異常積累及線粒體功能紊亂。線粒體功能紊亂主要表現(xiàn)在線粒體β氧化和過氧化物酶體β氧化，線粒體β氧化異?？梢鹬舅嵩诟渭?xì)胞基質(zhì)中堆積，當(dāng)肝細(xì)胞中蓄積大量脂肪酸，過氧化物酶體可對中長鏈脂肪酸進(jìn)行氧化，產(chǎn)生大量ROS及細(xì)胞因子，造成肝細(xì)胞損傷及肝臟纖維化[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過60μg/ml油酸處理72h后ROS含量明顯升高，這可能是造成本實驗中肝細(xì)胞損傷的主要原因。丙二醛是脂質(zhì)過氧化的一個產(chǎn)物，能與DNA等新核性生物大分子發(fā)生反應(yīng)，從而使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成損傷[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過60μg/ml油酸處理72h之后，S期細(xì)胞增多，G0/G1降低，G2/M期細(xì)胞不變，通過EdU染色結(jié)果也發(fā)現(xiàn)通過油酸處理后，進(jìn)入S期的細(xì)胞增多，說明油酸參與細(xì)胞代謝后產(chǎn)生的ROS可能使細(xì)胞阻滯在S期，造成肝細(xì)胞的凋亡和壞死，而且流式結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在72h之后，處理組凋亡和壞死細(xì)胞增多，這一現(xiàn)象可能與脂質(zhì)的過氧化產(chǎn)物與DNA等生物大分子發(fā)生反應(yīng)相關(guān)。

綜上所述，在非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型中，油酸代謝產(chǎn)生的ROS可能使細(xì)胞阻滯在S期，同時加快細(xì)胞凋亡和壞死，而且也有研究發(fā)現(xiàn)人肝癌細(xì)胞HepG2中油酸的氧化產(chǎn)物環(huán)氧硬脂酸能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，同時引起細(xì)胞凋亡[17]。除此之外，用油酸處理牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞后G0/G1期細(xì)胞降低，S期細(xì)胞升高，使細(xì)胞阻滯在S期，同時上調(diào)細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)[18]。這也表明不同的疾病模式，油酸對細(xì)胞周期的影響機(jī)制可能不同，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。