鐘 華，徐麗玲，白明欣，蘇 茵

(北京大學(xué)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，風(fēng)濕病機(jī)制及免疫診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性破壞性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，其基本病理改變包括關(guān)節(jié)滑膜炎、血管翳及骨破壞等，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1]。我國(guó)RA的患病率為0.28%，患病人數(shù)達(dá)500萬(wàn)。未經(jīng)正規(guī)治療的RA患者3年的致殘率達(dá)75%，是造成勞動(dòng)力喪失的主要原因之一[2-3]。

趨化因子是一類(lèi)相對(duì)分子質(zhì)量為8×103～12×103的多肽物質(zhì)，主要通過(guò)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞與炎性介質(zhì)的定向遷移、活化與發(fā)育發(fā)揮趨化作用，參與RA的組織破壞。有研究顯示，趨化因子可能通過(guò)募集中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用、細(xì)胞骨架重構(gòu)、血管生成及抑制上皮細(xì)胞凋亡等方式促進(jìn)滑膜炎及血管翳的發(fā)生[4]。CXCL9和CXCL10是CXC亞家族的成員，由γ-干擾素(interferon γ,IFN-γ)誘導(dǎo)產(chǎn)生并作用于趨化因子受體CXCR3，主要對(duì)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞具有趨化作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，RA患者的滑膜液和滑膜組織中可檢測(cè)到CXCL9和CXCL10的表達(dá)升高，提示其可能參與RA的發(fā)病[6-9]。然而，CXCL9和CXCL10在RA患者血清中的表達(dá)水平以及其與骨破壞的關(guān)系尚不清楚，值得進(jìn)一步探討。

本研究旨在通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)RA患者以及骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)患者、健康人外周血清中CXCL9、CXCL10的表達(dá)水平，分析其與RA臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的關(guān)系，初步探討其在RA骨侵蝕中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

連續(xù)納入北京大學(xué)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科自2018年1—6月住院的105例RA患者，其中女性81例，男性24例，平均年齡(56.33±14.41)歲。所有患者均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology,ACR)修訂的RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[10]。同時(shí)，選取年齡和性別相匹配的、符合2009年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟OA診斷建議[11]的90例OA患者作為疾病對(duì)照組，選取在北京大學(xué)人民醫(yī)院體檢的健康體檢者25例作為健康對(duì)照組。排除合并惡性腫瘤、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重并發(fā)癥(如心力衰竭或肝腎功能不全)及其他嚴(yán)重的血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的患者。本研究經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021PHB282-001)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 樣本的采集和處理

空腹抽取各組患者及對(duì)照組靜脈血4 mL，離心收集血清并分裝，置-80 ℃冰箱儲(chǔ)存以待檢測(cè)血清CXCL9和CXCL10使用。

1.3 檢測(cè)試劑及方法

采用ELISA法檢測(cè)血清CXCL9和CXCL10水平，試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司(DY392-05、DY266-05)，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 臨床資料采集

詳細(xì)記錄RA患者的病程、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)(swollen joint count,SJC)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)(tender joint count,TJC)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、類(lèi)風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)A、IgG、IgM以及抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibody，ACPA)。

以關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評(píng)分(disease activity score 28,DAS28)評(píng)估RA患者的疾病活動(dòng)度，根據(jù)歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟推薦的定義，DAS28>5.1為高度活動(dòng)；3.2

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布的資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，組間比較根據(jù)是否符合正態(tài)分布，分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)。多組間計(jì)量資料采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，并采用Bonferroni方法對(duì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行校正。相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析，采用單因素及多因素Logistic回歸分析發(fā)生骨侵蝕的相關(guān)因素，將單因素分析中P<0.05的變量、臨床疾病活動(dòng)度和血清ACPA等指標(biāo)共同納入多因素變量模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA患者、OA患者及健康人血清CXCL9和CXCL10水平比較

血清CXCL9和CXCL10水平結(jié)果顯示，RA患者血清CXCL9 [250.02(126.98,484.29)ng/L]和CXCL10 [108.43(55.16,197.17)ng/L]水平均明顯高于OA患者[165.05(75.89,266.37)ng/L,69.00(33.25,104.74)ng/L]及健康對(duì)照者[79.47(38.22,140.63)ng/L,55.44(18.76,95.86)ng/L]，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=26.13,P<0.001；H=20.97,P<0.001；圖1)。

RA,rheumatoid arthritis;OA,osteoarthritis;HC,healthy controls.圖1 RA患者、OA患者及健康人血清CXCL9和CXCL10的水平比較Figure 1 Serum levels of CXCL9 and CXCL10 in RA patients compared with osteoarthritis and healthy control groups

2.2 RA患者血清CXCL9和CXCL10水平與臨床特征及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析

進(jìn)一步分析RA患者血清CXCL9和CXCL10水平與臨床特征及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，血清CXCL9水平與SJC及RF呈正相關(guān)(P<0.05)，血清CXCL10水平與SJC、TJC、CRP、IgA、IgM、RF及ACPA均呈正相關(guān)(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 RA患者血清CXCL9和CXCL10水平與臨床特征及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性Table 1 Correlation between serum CXCL9 and CXCL10 levels with clinical characteristics and laboratory parameters in RA patients

2.3 血清CXCL9和CXCL10水平與RA患者疾病活動(dòng)度的相關(guān)性分析

血清CXCL9和CXCL10水平與RA患者的DAS28評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.301、0.364，P=0.011、0.006，圖2)。高疾病活動(dòng)度組(DAS28>5.1)的RA患者血清CXCL9水平[304.73(236.42,617.51)ng/L]、CXCL10水平[132.86(74.55,201.05)ng/L]分別顯著高于中低疾病活動(dòng)組(DAS28≤5.1)的CXCL9水平[175.39(107.29,481.13)ng/L]和CXCL10水平[60.03(30.84,156.21)ng/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.4 血清CXCL9和CXCL10水平與RA患者骨侵蝕的關(guān)系

將骨侵蝕組與非骨侵蝕組RA患者的臨床特征、血清學(xué)指標(biāo)、疾病活動(dòng)度及趨化因子水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示骨侵蝕組RA患者的病程更長(zhǎng)，且血清CXCL9和CXCL10水平明顯高于非骨侵蝕組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 發(fā)生與未發(fā)生骨侵蝕的RA患者臨床特征及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)Table 2 Clinical and biochemical characteristics of RA patients with or without bone erosion

進(jìn)一步將病程時(shí)間、血清ACPA水平、臨床疾病活動(dòng)度DAS28評(píng)分及血清CXCL9和CXCL10水平納入多因素Logistic回歸模型，分析結(jié)果顯示，長(zhǎng)病程、高疾病活動(dòng)度及高血清CXCL9水平與RA患者發(fā)生骨侵蝕相關(guān)(表3)。

DAS28,disease activity score 28;RA,rheumatoid arthritis.圖2 血清CXCL9和CXCL10與RA患者疾病活動(dòng)度的相關(guān)性Figure 2 Correlation between serum CXCL9 and CXCL10 levels with disease activities in RA patients

表3 血清CXCL9、CXCL10水平與RA骨侵蝕的相關(guān)性分析Table 3 Multiple Logistic regression analysis of factors associated with RA patients with bone erosion

3 討論

RA是一種致殘性、慢性、自身免疫性疾病，早期的組織病理表現(xiàn)包括滑膜細(xì)胞增生、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管翳形成，晚期可出現(xiàn)骨和軟骨組織破壞、最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)活動(dòng)受限、功能喪失和生活質(zhì)量下降。目前，臨床上主要依靠影像學(xué)手段作為臨床評(píng)估患者關(guān)節(jié)破壞的客觀指標(biāo)，雖然隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，關(guān)節(jié)超聲和MRI的應(yīng)用已大大提高了RA患者骨侵蝕的早期檢出率，但經(jīng)影像學(xué)檢查顯示異常的患者即使臨床癥狀和體征緩解，關(guān)節(jié)損傷的進(jìn)程仍會(huì)持續(xù)進(jìn)展。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，RA患者在病程2年內(nèi)的骨侵蝕發(fā)生率高達(dá)90%，且大部分患者在6個(gè)月內(nèi)即開(kāi)始出現(xiàn)骨侵蝕，而在第1年的骨質(zhì)破壞進(jìn)展要明顯快于第2年和第3年[17]。本研究旨在探討血清學(xué)指標(biāo)與骨侵蝕發(fā)生的相關(guān)性，進(jìn)一步探索早期監(jiān)測(cè)RA患者骨關(guān)節(jié)破壞的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)。

趨化因子是一類(lèi)細(xì)胞因子樣分泌蛋白的超家族，包括CXC、CC、C及CX3C四個(gè)亞族，通過(guò)與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合發(fā)揮趨化作用，參與多種生理和病理過(guò)程，包括炎癥、感染、免疫、腫瘤等[18]。既往研究顯示，CXC亞家族在自身免疫性疾病中有明顯的促炎效應(yīng)，CXCL9和CXCL10均是CXC亞家族成員，由IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生，為趨化因子受體CXCR3的配體，兩者結(jié)合后促進(jìn)Th1細(xì)胞方向分化[19-20]。在炎癥細(xì)胞中，單核/巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞是CXCL9和CXCL10的主要來(lái)源。趨化因子選擇性招募及活化炎癥細(xì)胞進(jìn)入滑膜組織中，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，從而在RA骨破壞中發(fā)揮重要作用。

CXCL9的編碼基因位置與CXCL10基因緊鄰[21]，推測(cè)兩者可能具有相似的功能。本研究結(jié)果表明，CXCL9在RA患者外周血中的表達(dá)明顯升高，且與疾病活動(dòng)性相關(guān)，Logistic分析提示CXCL9水平與RA發(fā)生骨侵蝕有關(guān)(OR=1.012,P=0.004)。CXCL9除了作為重要的趨化因子參與自體免疫性關(guān)節(jié)炎發(fā)病之外，也有研究報(bào)道其參與多種感染、腫瘤及免疫性疾病，如人類(lèi)免疫缺陷病毒感染、病毒性肝炎、結(jié)直腸癌、乳腺癌、狼瘡性腎炎、炎癥性腸病及移植物抗宿主病等。目前，關(guān)于CXCL9對(duì)骨破壞的作用機(jī)制研究較少，隨著人們對(duì)骨組織穩(wěn)態(tài)的認(rèn)識(shí)不斷加深，CXCLs/CXCR3趨化軸在RA骨代謝中的作用可以作為未來(lái)進(jìn)一步探索的方向。

與CXCL9相比，CXCL10在RA發(fā)病中的作用研究較多，但目前的觀點(diǎn)并不完全一致。在炎性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的滑膜組織中發(fā)現(xiàn)，CXCL10可通過(guò)刺激核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)在CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)誘導(dǎo)RA骨破壞的發(fā)生，加入拮抗劑后小鼠骨關(guān)節(jié)的破壞程度明顯降低，提示CXCL10可能與骨侵蝕的發(fā)生有關(guān)聯(lián)[22]。但也有研究顯示，并未在受累關(guān)節(jié)中發(fā)現(xiàn)CXCL10表達(dá)上的差異[23]。本研究結(jié)果顯示，RA患者外周血清中CXCL10的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照人群，進(jìn)一步的相關(guān)性分析提示，CXCL10與RF及ACPA滴度呈正相關(guān)，且高、低疾病活動(dòng)度的患者組間CXCL10表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高CXCL10水平組RA患者發(fā)生骨侵蝕的比例更高。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CXCL10可以作為RA患者體內(nèi)炎癥活躍及骨破壞發(fā)生的提示指標(biāo)，然而Logistic回歸分析未證實(shí)這種關(guān)聯(lián)(OR=0.996,P>0.05)。以上結(jié)果的不一致可能與病例選擇的異質(zhì)性有關(guān)，RA是一個(gè)長(zhǎng)病程、多因素參與的復(fù)雜疾病，趨化因子在不同階段發(fā)揮的主要作用會(huì)受到其他細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，因此，CXCL10與骨破壞之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步挖掘。

綜上所述，RA患者血清中趨化因子CXCL9和CXCL10的表達(dá)水平升高，與RA疾病活動(dòng)性及骨侵蝕具有相關(guān)性，可能是參與RA骨破壞的重要因子。本研究尚存在一定的局限性，一方面，橫斷面研究對(duì)因果關(guān)系的分析能力不足，尚不足以論證RA罹患骨侵蝕的危險(xiǎn)因素；另一方面，具有完整影像學(xué)資料的例數(shù)較少且缺少隨訪數(shù)據(jù)。在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并設(shè)計(jì)隨訪隊(duì)列完善對(duì)骨侵蝕的評(píng)估，明確CXCLs/CXCR3趨化軸在RA骨代謝中的作用機(jī)制。