高亞東，朱 安，李璐迪，張 濤，王 碩，單丹萍，李盈姿，王 旗,2,3,△

(1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系，北京 100191；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥配伍減毒重點(diǎn)研究室，北京 100191；3.食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

吳茱萸(Evodiaefructus)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為臨床常用的傳統(tǒng)中藥，具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽(yáng)止瀉的功效。吳茱萸有小毒[1]，臨床上常因服用生品吳茱萸、未制透的吳茱萸或超劑量服用而中毒，研究表明肝臟是吳茱萸的主要毒性靶器官[2-3]，但尚未闡明其毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及毒性機(jī)制。吳茱萸堿(evodiamine，EVO)屬色胺吲哚類生物堿，是吳茱萸主要生物堿成分之一，具有抗腫瘤[4]、抗炎[5]、抑菌[6]、鎮(zhèn)痛[7]、神經(jīng)保護(hù)[8]等藥理作用。EVO可能是吳茱萸肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，其可降低人正常肝細(xì)胞L-02存活率，升高谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate amino-transferase，AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性[9]，但其肝毒性機(jī)制尚不明確。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吳茱萸肝毒性機(jī)制與氧化損傷相關(guān)[10]，可導(dǎo)致ALP活性和總膽紅素(total bilirubin，TBIL)含量升高[3]，并促使肝細(xì)胞凋亡[11]。HepG2細(xì)胞具有許多肝臟特異性相關(guān)功能，是目前用于評(píng)估肝毒性的人源細(xì)胞模型之一，廣泛應(yīng)用于藥物肝毒性及分子機(jī)制研究[12]，因此，本研究用HepG2細(xì)胞研究EVO的肝細(xì)胞毒性作用特點(diǎn)，從脂質(zhì)過氧化損傷、凋亡和膽汁淤積三方面初步探討其毒性機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞系

HepG2細(xì)胞由北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系趙鵬老師惠贈(zèng)。

1.2 藥物及主要試劑

EVO由北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系楊秀偉教授提供，純度≥98%。細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，ALT、AST、LDH、ALP和TBIL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司，線粒體膜電位熒光探針(superior alternative to JC-1，JC-10)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，小鼠抗人β-actin抗體(TA-09)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(ZB-5301)和辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人caspase-9(ab25758)、caspase-3(ab32351)、膽鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP，ab155421)和多耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2，ab172630)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 主要儀器

HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Sscientific公司，F(xiàn)LUOstar Omega多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)BMG公司，CytoFLEX流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司，Mini-PROTEAN Tetra Cell小垂直板電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)中，置于37 ℃、95%濕度、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱，2～3 d傳代一次。

1.4.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞(1×105/mL)接種于96孔板，每孔100 μL。24 h細(xì)胞貼壁后棄上清液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌一次，加入含EVO(0、0.04、0.2、1、5和25 μmol/L)無(wú)血清培養(yǎng)基，分別處理24、48和72 h，0 μmol/L組作為對(duì)照組，其他劑量組作為EVO實(shí)驗(yàn)組。處理結(jié)束后向每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃水浴30 min，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處光密度值，計(jì)算細(xì)胞存活率和半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.4.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST、LDH、ALP活性和TBIL含量檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞(2×105/mL)接種于24孔板，每孔0.5 mL。24 h細(xì)胞貼壁后棄上清液，PBS洗滌一次，加入含EVO(0、0.2、1和5 μmol/L)無(wú)血清培養(yǎng)基處理48 h。吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，600×g離心5 min取上清液，按照ALT、AST、LDH、ALP和TBIL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用多功能酶標(biāo)儀分別檢測(cè)相應(yīng)的光密度值，計(jì)算ALT、AST、LDH、ALP活性和TBIL含量。

1.4.4SOD活性和MDA含量檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞(2×105/mL)接種于6孔板，每孔2 mL。EVO處理HepG2細(xì)胞方法同第1.4.3小節(jié)。用裂解液裂解細(xì)胞后，于4 ℃、14 000×g離心5 min，取上清液并用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid assay，BCA)測(cè)定其總蛋白濃度，按照SOD和MDA試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定SOD活性和MDA含量。

1.4.5分子對(duì)接 用SYBYL-X 2.0軟件，將EVO與凋亡相關(guān)蛋白caspase-9和caspase-3、自噬相關(guān)蛋白選擇性自噬接頭蛋白(sequestosome-1，SQSTM1/p62)、Beclin-1和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain-3，LC3)和鐵死亡相關(guān)蛋白谷胱甘肽過氧化酶4(glutathione peroxidase 4，Gpx4)進(jìn)行分子對(duì)接。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(protein data bank，PDB)獲取。對(duì)接前先對(duì)蛋白進(jìn)行處理，獲得能量最小化的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。對(duì)EVO進(jìn)行能量最小化計(jì)算。選擇高精度模式，提取配體分子，生成蛋白結(jié)合活性口袋，進(jìn)行半柔性分子對(duì)接[13]。對(duì)接結(jié)果采用總得分值進(jìn)行評(píng)價(jià)，總得分值大于5即認(rèn)為EVO可與靶蛋白結(jié)合，且得分越高代表結(jié)合越強(qiáng)。采用PyMOL2.7 和LigPLOT軟件將EVO與靶蛋白對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4.6線粒體膜電位檢測(cè) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)以及EVO處理細(xì)胞方法同第1.4.4小節(jié)。胰酶消化后收集細(xì)胞，加入JC-10染色工作液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃避光孵育20 min，用JC-10染色緩沖液(1×)洗滌2次，經(jīng)300目細(xì)胞篩制成單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅、綠熒光強(qiáng)度，計(jì)算紅、綠熒光相對(duì)比例。

1.4.7Annexin V-FITC/PI探針檢測(cè)細(xì)胞凋亡 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)以及EVO處理細(xì)胞方法同第1.4.4小節(jié)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次，用不含Ca2+、Mg2+的乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)胰酶消化后收集細(xì)胞，800×g離心5 min，棄上清液，PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取(5～10)×104細(xì)胞，600×g離心5 min后棄上清液，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，再分別加入0.2 μL Annexin V-FITC和2.5 μL PI染色液，室溫避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V-FITC的綠色熒光和PI的紅色熒光，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4.8Western blot檢測(cè)凋亡蛋白及膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)量 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3.5×106個(gè)HepG2細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，EVO處理細(xì)胞方法同第1.4.4小節(jié)。提取總蛋白，并用BCA法測(cè)定其濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液后，沸水浴7 min使蛋白變性。20 μg等量蛋白上樣，40 mA、100 min進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，隨后使用聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)印跡膜300 mA電轉(zhuǎn)90 min，6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉溶液封閉2 h，含吐溫20的Tris緩沖鹽溶液(tris-buffered saline with tween-20，TBST)清洗三次，每次10 min，4 ℃孵育一抗過夜。TBST清洗三次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h。TBST清洗三次，每次10 min，加極超敏化學(xué)發(fā)光試劑曝光成像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EVO對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，EVO實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞存活率均降低，且呈劑量和時(shí)間依賴性，其中0.2、1和5 μmol/L EVO處理HepG2細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率分別為87.3%、81.1%和73.3%；處理48 h，細(xì)胞存活率分別為84.3%、63.1%和55.8%；處理72 h，細(xì)胞存活率分別為62.7%，55.1%和52.9%。EVO處理HepG2細(xì)胞24、48和72 h的IC50分別為85.3、6.6和4.7 μmol/L。

n=3.# P<0.01,compared with control group at the same time.EVO,evodiamine.圖1 不同濃度和時(shí)間下的EVO對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Figure 1 Effects of EVO on viability of HepG2 cells at different concentrations and time

基于EVO處理HepG2細(xì)胞的IC50，考慮吳茱萸藥材中EVO含量和人體攝入量，選擇0.2、1、5 μmol/L為EVO低、中、高劑量處理細(xì)胞48 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

2.2 EVO對(duì)HepG2細(xì)胞肝功能生化指標(biāo)的影響

如表1所示，與對(duì)照組相比，不同濃度EVO處理HepG2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST、LDH、ALP活性和TBIL含量均不同程度升高，且ALT、AST和ALP升高在5 μmol/L EVO組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，LDH升高在0.2、1和5 μmol/L EVO組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TBIL升高在1和5 μmol/L EVO組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 EVO處理HepG2細(xì)胞48 h對(duì)肝功能生化指標(biāo)的影響Table 1 Effects of EVO on biochemical indicators in HepG2 cells for 48 n=3)

2.3 EVO對(duì)SOD活性和MDA含量的影響

如圖2所示，0.2、1和5 μmol/L EVO處理HepG2細(xì)胞48 h后，SOD酶活性從對(duì)照組的32.17 U/mg蛋白分別降低至30.96、24.95和24.47 U/mg蛋白，且在1和5 μmol/L EVO組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MDA含量從對(duì)照組的1.91 μmol/g蛋白分別升高至2.34、2.83和3.45 μmol/g蛋白，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。上述結(jié)果表明，EVO可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷。

A,SOD activity;B,MDA content. n=3.HepG2 cells were treated with EVO for 48h.# P<0.01,compared with control group.EVO,evodiamine;SOD,superoxide dismutase;MDA,malondialdehyde.圖2 EVO對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的影響Figure 2 Effects of EVO on lipid peroxidation damage in HepG2 cells

2.4 EVO與凋亡、自噬和鐵死亡相關(guān)蛋白的對(duì)接

如表2和圖3所示，EVO可與凋亡相關(guān)蛋白caspase-9和caspase-3直接結(jié)合，總得分值均高于5，結(jié)合力主要是氫鍵，此外還有弱相互作用參與。與自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin-1和LC3，以及鐵死亡相關(guān)蛋白Gpx4無(wú)法結(jié)合，總得分值均低于5，提示EVO的肝細(xì)胞毒性作用可能涉及細(xì)胞凋亡。

表2 EVO與凋亡、自噬和鐵死亡相關(guān)蛋白對(duì)接Table 2 Molecular interactions between EVO and apoptosis,autophagy or ferroptosis-associated proteins

A,the 3D model of caspase-9;B,the 2D model of caspase-9;C,the 3D model of caspase-3;D,the 2D model of caspase-3.EVO,evodiamine.圖3 EVO與人源凋亡相關(guān)蛋白相互作用Figure 3 Molecular interaction between EVO and human apoptosis-associated proteins

2.5 EVO對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

如圖4所示，0.2、1和5 μmol/L EVO處理HepG2細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組(87.2%)比較，紅、綠熒光相對(duì)比例分別降低至 71.9%，63.7%和72.6%，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明EVO可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的下降。

n=3.HepG2 cells were treated with EVO for 48 h.# P<0.01,compared with control group.EVO,evodiamine.圖4 EVO對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響Figure 4 Effects of EVO on mitochondrial membrane potential in HepG2 cells

2.6 EVO對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

如圖5所示，0.2、1和5 μmol/L EVO處理HepG2細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組(4.9%)比較，細(xì)胞凋亡比例分別升高至6.8%、8.0%和11.3%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A,apoptosis was evaluated by Annexin V-FITC and PI staining;B,quantitative statistical results of the proportion of apoptotic n=3.HepG2 cells were treated with EVO for 48h.# P<0.01 compared with control group.FITC,fluorescein isothiocyanate;PI,propidium iodide;EVO,evodiamine.圖5 EVO對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響Figure 5 Effects of EVO on apoptosis rate in HepG2 cells

2.7 EVO對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

如圖6所示，EVO處理HepG2細(xì)胞48 h后，0.2、1和5 μmol/L EVO組的caspase-9剪切蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.1、1.2和1.8倍，caspase-3剪切蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.3、1.5和2.2倍，在1和5 μmol/L EVO組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，caspase-3前體蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的87.2%、78.0%和50.4%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，上述結(jié)果表明EVO可引發(fā)HepG2細(xì)胞凋亡。

A,relative protein expression levels by Western blot;B,semi-quantitative analysis. n=3.HepG2 cells were treated with EVO for 48 h.* P<0.05,# P<0.01,compared with control group.EVO,evodiamine.圖6 EVO對(duì)HepG2細(xì)胞caspase-9和caspase-3蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effects of EVO on the protein expressions of caspase-9 and caspase-3 in HepG2 cells

2.8 EVO對(duì)BSEP和MRP2蛋白表達(dá)的影響

BSEP和MRP2是重要的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，如圖7所示，0.2、1和5 μmol/L EVO處理HepG2細(xì)胞48 h后，BSEP蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的94.0%、84.8%和61.8%，MRP2蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的91.2%、63.5%和51.1%，在1和5 μmol/L EVO組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明EVO可抑制HepG2細(xì)胞膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體BSEP和MRP2，使膽汁酸外排受阻從而導(dǎo)致膽汁淤積的發(fā)生。

A,relative protein expression levels by Western blot;B,semi-quantitative analysis. n=3.HepG2 cells were treated with EVO for 48 h.* P<0.05,# P<0.01,compared with control group.EVO,evodiamine;BSEP,bile salt export pump;MRP2,multidrug resistance-associated protein 2.圖7 EVO對(duì)HepG2細(xì)胞BSEP和MRP2蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Effects of EVO on the protein expressions of BSEP and MRP2 in HepG2 cells

3 討論

EVO是吳茱萸重要的藥理活性成分，也可能是其潛在的肝毒性成分。李文蘭等[14]采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)EVO是吳茱萸肝毒性部位化學(xué)成分及入血成分之一，且EVO可降低L-02細(xì)胞存活率，升高ALT、AST、LDH和ALP活性[9]，因而推測(cè)EVO可能是吳茱萸肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

藥物引起的肝損傷是多因素作用的結(jié)果，主要涉及脂質(zhì)過氧化損傷、膽汁淤積、線粒體功能失調(diào)、免疫損傷、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及凋亡、壞死和自噬等肝細(xì)胞死亡機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，吳茱萸水提組分肝毒性機(jī)制與氧化損傷有關(guān)[10]，可引起ALP和TBIL升高[3]，促使肝細(xì)胞凋亡[11]。本研究中分子對(duì)接結(jié)果顯示EVO可與凋亡相關(guān)蛋白結(jié)合，因而我們從脂質(zhì)過氧化損傷、細(xì)胞凋亡和膽汁淤積方面探究EVO的肝細(xì)胞損傷機(jī)制。

本研究中，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EVO可降低HepG2細(xì)胞存活率，且呈時(shí)間和劑量依賴性。ALT主要存在于肝細(xì)胞中，具有較好的組織特異性，AST存在于肝臟、腎臟、心臟和骨骼肌中，當(dāng)肝細(xì)胞受損導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，ALT和AST會(huì)被釋放出來(lái)，使血清或肝細(xì)胞培養(yǎng)液中的酶活力增高，通常結(jié)合這兩種酶來(lái)判斷肝損傷情況。LDH是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的酶，可以通過測(cè)定釋放出的LDH活性評(píng)價(jià)細(xì)胞膜的完整性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，EVO處理HepG2細(xì)胞48 h可顯著升高上清液中ALT、AST和LDH活性，提示EVO可破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致ALT和AST釋放增加，對(duì)肝細(xì)胞具有損傷作用。

某些藥物可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)活性氧堆積和氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，引發(fā)氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而激起自由基的連鎖增殖反應(yīng)，與膜磷脂的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化損傷。SOD是清除超氧自由基的關(guān)鍵抗氧化酶[16]，在氧化應(yīng)激時(shí)，其活性降低。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要分解產(chǎn)物，通常作為多不飽和脂肪酸過氧化的經(jīng)典標(biāo)志物[17]。本研究中，EVO可以降低HepG2細(xì)胞SOD活性，升高M(jìn)DA含量，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)的氧化/抗氧化平衡被打破，EVO可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷。

分子對(duì)接解析了EVO與凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、caspase-3，自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin-1、LC3和鐵死亡相關(guān)蛋白Gpx4的結(jié)合情況，結(jié)果表明EVO可結(jié)合凋亡相關(guān)蛋白，但無(wú)法與自噬和鐵死亡相關(guān)蛋白結(jié)合，提示EVO所致HepG2細(xì)胞毒性作用機(jī)制可能涉及細(xì)胞凋亡，而與細(xì)胞自噬和鐵死亡關(guān)系不大。

MMP下降作為凋亡的早期指征，是評(píng)價(jià)線粒體功能的敏感指標(biāo)。MMP下降可促使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，使細(xì)胞色素C從線粒體釋放至胞漿，與凋亡蛋白酶活化因子-1結(jié)合為多聚體，活化caspase-9前體并進(jìn)一步激活凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]。本研究通過JC-10熒光探針染色檢測(cè)到MMP下降，采用Annexin V-FITC/PI熒光探針染色檢測(cè)到細(xì)胞凋亡率升高，表明EVO可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。通過Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-9和caspase-3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)EVO可下調(diào)caspase-3前體蛋白表達(dá)，并上調(diào)caspase-9和caspase-3剪切蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明細(xì)胞凋亡介導(dǎo)了EVO所致的HepG2細(xì)胞毒性。

膽汁淤積性肝損傷是藥物性肝損傷中的重要類型。肝細(xì)胞至腸道的膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)受阻時(shí)，可導(dǎo)致膽汁酸在肝臟中蓄積，引發(fā)肝細(xì)胞線粒體損傷、氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡[19]。ALP主要經(jīng)膽汁代謝，當(dāng)藥物引起肝損傷時(shí)，膽汁排泄受阻，可引起血清ALP升高，而當(dāng)肝損傷引起膽紅素代謝降低時(shí)，可引起血中TBIL的濃度升高，因而ALP和TBIL是反映膽汁淤積型肝損傷的重要標(biāo)志物。EVO處理HepG2細(xì)胞48 h可致ALP活性和TBIL含量升高，提示EVO可能引起膽汁淤積性肝損傷。BSEP和MRP2位于肝細(xì)胞膽管側(cè)膜上，是介導(dǎo)游離或結(jié)合型膽汁酸外排的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體[20]，其中BSEP是關(guān)鍵的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，已有多種藥物因抑制BSEP功能誘發(fā)肝毒性從而導(dǎo)致黑框警告或撤市[21-22]。歐洲藥品管理局和國(guó)際運(yùn)輸聯(lián)盟已建議在臨床前或臨床研究過程中需對(duì)藥物是否抑制BSEP進(jìn)行評(píng)估[23]，可見評(píng)估對(duì)BSEP的抑制作用對(duì)預(yù)測(cè)藥物是否誘導(dǎo)膽汁淤積型肝損傷具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)EVO顯著降低HepG2細(xì)胞中BSEP和MRP2蛋白表達(dá)水平，提示EVO可抑制HepG2細(xì)胞BSEP和MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)，使肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度升高，產(chǎn)生膽汁淤積性肝損傷。

綜上所述，本研究表明EVO可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞毒性，其肝細(xì)胞毒性機(jī)制涉及脂質(zhì)過氧化損傷、細(xì)胞凋亡和膽汁淤積。