張志華，王 蘭，周霄穎，鄭必霞，林 謙*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院消化科，2兒科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029

肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyltrans?ferase 1A，CPT1A）缺乏癥（OMIM#255120）是一種長鏈脂肪酸氧化障礙的常染色體隱性遺傳疾病，由CPT1A 基因（OMIM#600528）變異導(dǎo)致。CPT1A 是長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化的限速酶。當(dāng)CPT1A缺乏癥患者長期禁食或處于病理狀態(tài)時(shí)，糖原貯備不足，肝臟線粒體脂肪酸β氧化提供能量被抑制，出現(xiàn)低血糖、肝性腦病等多系統(tǒng)癥狀［1］。該疾病罕見，到目前為止，人類基因組突變數(shù)據(jù)庫（Human Genome Mutation Database，HGMD）僅收錄了41種突變（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=CPT1A），多為點(diǎn)突變，本文首次報(bào)道了中國人群中1例外顯子4～5純合缺失的變異類型，豐富了該基因變異譜，并結(jié)合qPCR進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 病例資料

患兒，男，2歲10個(gè)月。因“肝功能異常3周”入院?；純? 周前因“低血糖暈厥”于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院治療，查丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）173.0 U/L，予美能、谷胱甘肽保肝治療3周，復(fù)查肝功能，ALT 250 U/L，遂來就診。入院查體：肝臟右肋下3 cm，質(zhì)中。余查體無異常。父母體健，否認(rèn)家族史。入院診斷：肝功能損害。

基因測(cè)序：采集患兒及其父母靜脈血3 mL（EDTA 抗凝）送至北京全譜醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，外周血標(biāo)本DNA 抽提前，患兒監(jiān)護(hù)人填寫知情同意書，本研究獲南京兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)將正常對(duì)照樣本與先證者及父母樣本進(jìn)行同組熒光定量PCR檢測(cè)，以ALB基因?yàn)閮?nèi)參基因，對(duì)目標(biāo)基因CPT1A 的4～5 外顯子的拷貝數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)（用熒光定量PCR法）。計(jì)算公式為2-ΔΔCt。qPCR所用引物序列見表1。

表1 CPT1A基因外顯子4～5 qPCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

入院后輔助檢查結(jié)果：ALT 206 U/L，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）154 U/L，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）348 U/L，血糖4.11 mmol/L；凝血功能無異常；血氨、銅藍(lán)蛋白、噬肝病毒、傳染病4項(xiàng)無異常。彩超示肝臟右肋下38 mm，肝臟形態(tài)增大，腹部CT 示肝臟實(shí)質(zhì)密度彌漫性減低。肝組織光鏡病理：肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)空亮，廣泛脂肪變性，匯管區(qū)纖維組織中度增生伴少量淋巴細(xì)胞浸潤（圖1）；肝組織電鏡病理：肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見大量脂滴沉積，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體增多，線粒體局灶可見腫脹及空泡變性等改變，糖原顆粒輕度增多。遺傳代謝血液篩查示游離肉堿（C0）顯著升高，多種?；鈮A（C16、C18）降低，C0/（C16+C18）為2 609.78（正常值2.50～54.00）。以上檢查結(jié)果高度提示患兒為遺傳代謝性疾病，進(jìn)一步采用全外顯子組測(cè)序進(jìn)行基因檢測(cè)以明確診斷。

圖1 先證者肝臟穿刺活檢組織光鏡病理

基因診斷：全外顯子組測(cè)序結(jié)果提示患兒CPT1A基因外顯子4～5純合缺失，患兒父親、母親為該突變雜合攜帶者。CPT1A基因的純合或復(fù)合雜合型突變可以導(dǎo)致CPT1A缺乏癥。進(jìn)一步采用qPCR的方法驗(yàn)證該患兒CPT1A基因外顯子4～5純合缺失變異。

將正常對(duì)照樣本與先證者及父母樣本進(jìn)行同組qPCR檢測(cè)，以ALB基因?yàn)閮?nèi)參基因，對(duì)目標(biāo)基因CPT1A 4～5外顯子的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。由圖2結(jié)果可見，先證者CPT1A 基因4～5 外顯子的拷貝數(shù)與正常對(duì)照的比值約為0，提示先證者CPT1A 基因4～5外顯子存在純合缺失，先證者父母CPT1A 基因4～5外顯子的拷貝數(shù)與正常對(duì)照的比值約為0.5，提示先證者父母CPT1A 基因4～5 外顯子存在雜合缺失。qPCR檢測(cè)結(jié)果與全外顯子組測(cè)序結(jié)果一致。

圖2 CPT1A基因外顯子4～5純合缺失突變qPCR驗(yàn)證結(jié)果

2 討論

CPT1A 缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳代謝性疾病，屬于長鏈脂肪酸氧化代謝紊亂類疾病，由11q13染色體上的CPT1A基因上的純合或復(fù)合雜合型突變所致。該疾病由Bougnères 等［2］于1981 年首次報(bào)道，具有種族特異性，在阿拉斯加、加拿大、格陵蘭島和西伯利亞東北地區(qū)發(fā)病率較高［3-5］，其他地區(qū)較罕見，目前中國人群的患病率未知。

CPT1A 缺陷患者臨床表現(xiàn)差異較大，在正常生理情況下沒有明顯的臨床表現(xiàn)，當(dāng)糖原儲(chǔ)備顯著減少時(shí)，出現(xiàn)低血糖、嘔吐、腹瀉、抽搐、肝腫大、肝性腦病等典型的臨床特征［6］，一些個(gè)體可出現(xiàn)腎小管性酸中毒表型［7-8］。也有個(gè)案報(bào)道以黃疸為首發(fā)癥狀［9］。心臟或骨骼肌受累并不常見［1］。實(shí)驗(yàn)室檢查可顯示低酮型低血糖、肝酶升高、高血氨等，實(shí)驗(yàn)室診斷的重要依據(jù)是脂酰肉堿的合成顯著減少，C0水平升高。本例患兒2 歲10 個(gè)月時(shí)因低血糖暈厥起病，肝功能持續(xù)異常，肝臟腫大，C0/（C16+C18）約為正常上限值的50倍，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)存在大量脂滴沉積，線粒體增多且線粒體局灶可見腫脹及空泡變性等改變，臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查支持CPT1A 缺乏癥，我們采用全外顯子組測(cè)序進(jìn)行基因檢測(cè)以進(jìn)一步明確了診斷。

CPT1A缺乏癥的致病基因CPT1A位于11q13染色體上，包含20 個(gè)外顯子，編碼大小為773 個(gè)氨基酸殘基的CPT1A［10-11］。目前HGMD數(shù)據(jù)庫中收錄了41種CPT1A基因突變，多為錯(cuò)義突變、無義突變、剪切突變及插入缺失突變，以點(diǎn)突變?yōu)橹?。全外顯子檢測(cè)顯示本例患兒CPT1A基因4～5外顯子存在純合缺失，父母為該雜合突變攜帶者，qPCR 結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果一致。在正常人群數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)該變異，未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。CPT1A 基因的4～5 外顯子連續(xù)缺失屬于基因水平中型變異，造成開放閱讀框大片段缺失，從而影響蛋白功能，結(jié)合該患兒的臨床表現(xiàn)，CPT1A基因外顯子缺失變異是本例患兒發(fā)病的分子機(jī)制。

CPT1A 缺乏癥患者出現(xiàn)急性低血糖癥時(shí)，應(yīng)盡快提供足量10%葡萄糖注射液以糾正低血糖，并防止脂肪分解和隨后脂肪酸向線粒體的動(dòng)員。血糖濃度正常后應(yīng)繼續(xù)葡萄糖輸注，為糖原合成提供足夠底物。CPT1A 缺乏癥患者在應(yīng)激狀態(tài)下存在神經(jīng)系統(tǒng)損傷、肝功能衰竭、癲癇發(fā)作、昏迷及猝死風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防急性發(fā)病可明顯改善預(yù)后。CPT1A缺乏癥患者應(yīng)經(jīng)常進(jìn)食，嬰兒夜間可予玉米淀粉喂養(yǎng)提供緩慢釋放碳水化合物的恒定來源，以防睡眠期低血糖癥；因?yàn)橹墟溨舅岵恍鐲PT1A協(xié)助即可進(jìn)入線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)化為能量，應(yīng)采用高碳水化合物、減少長鏈脂肪酸攝入、增加中鏈甘油三酯的飲食結(jié)構(gòu)［1］。本例患兒在采取合理飲食結(jié)構(gòu)后，肝轉(zhuǎn)氨酶較前下降，未再出現(xiàn)低血糖等臨床表現(xiàn)。

預(yù)防CPT1A缺乏癥急性發(fā)作、及時(shí)采取干預(yù)措施可明顯改善患者預(yù)后，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合基因檢測(cè)有助于早期診斷。本例患者是國內(nèi)首例外顯子4～5 純合缺失的CPT1A 缺乏癥患者，豐富了該基因變異譜。近年來全外顯子測(cè)序技術(shù)臨床應(yīng)用進(jìn)展很快，可以檢出外顯子缺失和重復(fù)的中型變異，結(jié)合qPCR 或者多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)驗(yàn)證，可以為這類變異的患兒提供精準(zhǔn)的分子診斷。