周乃強 趙世元 梁曉坤

廣西壯族自治區(qū)崇左市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西崇左 532200

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種神經(jīng)損傷和黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元進行性損傷導(dǎo)致運動功能障礙的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。帕金森病表現(xiàn)為靜止性震顫、僵硬、運動遲緩和逐漸失去正性反射。左旋多巴是治療帕金森病的主要藥物[1]。在帕金森病中，中腦小膠質(zhì)細胞的過度激活觸發(fā)了毒性和非記憶性介質(zhì)的合成，如誘導(dǎo)型一氧化氮和環(huán)氧合酶-2（COX-2），并釋放自由基，而自由基反過來又導(dǎo)致了人類和動物模型中多巴胺神經(jīng)元的凋亡[2]。在病理條件下，氧化應(yīng)激可刺激細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使單核細胞產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)從而促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在帕金森病發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著炎癥反應(yīng)[3]，因此靶向抗炎治療也可作為治療帕金森病的一種治療策略。

課題組前期實驗表明：石仙桃多糖能抑制大鼠氣道平滑肌細胞增殖[3]。石仙桃多糖對肺炎支原體肺炎模型小鼠有較好治療效果[4]。本研究將在帕金森動物整體模型基礎(chǔ)上，采用電鏡、酶聯(lián)免疫技術(shù)、分子生物學(xué)等技術(shù)，觀察石仙桃多糖抗氧化損傷和神經(jīng)保護作用，為石仙桃多糖開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物（石仙桃多糖）的提取

石仙桃多糖（PCLP）的提取參考文獻[5]。取石仙桃鱗莖，洗凈曬干。1 kg加4 L蒸餾水80℃回流6 h，冷卻后加1倍體積95%乙醇沉淀，用丙酮和乙醚萃取沉淀物3次，Sevag法去除蛋白，用95%乙醇沉淀，再將沉淀物水解、醇沉，用丙酮和乙醚脫水，重復(fù)操作數(shù)次，得石仙桃多糖。經(jīng)高效色譜檢測，在260～280 nm無吸收峰，收集多糖。樣品真空包裝、冰箱冷藏保存。

1.2 實驗動物

120只SPF級雄性SD大鼠，體重200～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（桂）2016-0002。大鼠均飼養(yǎng)在22℃、相對濕度為30%且無病原體環(huán)境下，單籠喂養(yǎng)，自由進食，自由活動。動物適應(yīng)2周后可以進行實驗。實驗嚴(yán)格遵守動物倫理委員會的法律法規(guī)，實驗均符合動物行為規(guī)范。小鼠腹腔注射MPTP 20 mg/kg，每晚1次，連續(xù)5 d。行為測試應(yīng)在最后一次注射MPTP后3天進行。

1.3 主要試劑

6-羥基多巴胺（6-OHDA，美國Sigma公司，批號：20181203）；丙二醛（MDA）試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，批號：2019082101）；一抗酪氨酸羥化酶（TH）多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：20191103）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和核因子κB（NF-κB），以上試劑由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 PD大鼠模型制備、實驗動物分組及石仙桃多糖給藥方法

PD大鼠模型制備參考文獻[6]?？瞻讓φ战M：每只大鼠隔日皮下注射太陽花油10 ml/kg，共9次，每天灌胃生理鹽水5 ml/kg；模型組：每只大鼠隔日皮下注射魚藤酮溶液（用太陽花油溶解，1 mg/kg，共9次），劑量相當(dāng)于10 ml/kg，并在藥物治療的同時每天灌胃生理鹽水5 ml/kg；陽性對照組：每只大鼠隔日皮下注射魚藤酮溶液（1 mg/kg，共9次），每天用左旋多巴灌胃10 mg/kg。石仙桃多糖低劑量組：每只大鼠隔日皮下注射魚藤酮溶液（1 mg/kg，9次）并灌胃石仙桃多糖15 mg/kg；石仙桃多糖中劑量組：每只大鼠隔日皮下注射魚藤酮溶液（1 mg/kg，9次）并灌胃石仙桃多糖20 mg/kg，石仙桃多糖治療高劑量組：每只大鼠隔日皮下注射魚藤酮溶液（1 mg/kg，9次）并每天灌胃石仙桃多糖30 mg/kg。每組動物實驗從第1天開始，最后一次給藥是第18天。給藥期間，觀察大鼠毛發(fā)、進食量、活動情況、精神狀況及對刺激的逃避反應(yīng)。第19天，進行行為學(xué)檢測，步驟如下。1.4.1 滾軸試驗 將大鼠放置滾軸上以4 r/s速度轉(zhuǎn)動，當(dāng)加速到5 r/s開始計時，當(dāng)大鼠掉落滾軸時停止計時，記錄時間。每分鐘檢測一次，共檢測5次，取平均值。

1.4.2 網(wǎng)格試驗 將大鼠置于水平金屬網(wǎng)格（12 cm×12 cm，格間距為1 cm）上，大鼠四腳爪均抓住網(wǎng)格線，180°向下翻轉(zhuǎn)網(wǎng)格裝置并計時，當(dāng)大鼠掉落網(wǎng)格時停止計時，懸掛時間超過180 s時均計為180 s，每隔2分鐘進行測試一次，共測試5次，取平均值。

運動評估完成后1 d，在氯胺酮麻醉下用頸椎脫臼處死大鼠。在大鼠頭骨上開洞，解剖大腦。每個大腦被分成兩個獨立的半球。右半球立即在液氮中冷凍，隨后分離紋狀體，用于生化指標(biāo)檢測。左半球用中性福爾馬林（1∶10 v/v）固定24 h，將標(biāo)本用乙醇脫水，用二甲苯清除，并嵌入聚對苯二甲酸乙二醇。在黑質(zhì)水平切取4 μm厚的切片，用于免疫組織化學(xué)。

1.5 紋狀體多巴胺和丙二醛水平的測定

先用雙縮脲法檢測組織勻漿蛋白，再采用熒光分光光度法測定DA，采用分光光度法檢測MDA，操作按試劑盒產(chǎn)品使用說明書進行。

1.6 PD大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β的表達測定

從紋狀體組織中提取總mRNA，采用Promega結(jié)構(gòu)變異總RNA分離系統(tǒng)進行分離。提取的RNA濃度和純度用貝克曼DU-6400紫外可見分光光度計進行波普掃描，樣本在-80℃下保存。檢測TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達，使用的特定引物如下： ①NF-κB： 5'-CAATGGCTACACAGGACCA -3'and 5'-CACTGTCACCTG GAACCAGA-3'；②TNF-α： 5'-TCTACTGAACTTCGGGGTGATCG -3'、5'- TGATCTGAGTGTGAGGGTCTGGG -3'；③IL-1β：5'-GCTCATCTGGGATCCTCTCC-3' and 5'- CCTGCCTGAAGCTCTTGTTG -3'；④β-actin ：and 5'-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3'and 5'- CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA -3'

使用Promega GoTaq?1步RTqPCR系統(tǒng)進行實時PCR。反應(yīng)混合物包括4 μlRNA模板、1 μl每個引物、10 μl GoTaq?qPCR主混合物、0.4 μl GoScript?RT混合，0.31 μl CXR參考染料，和無核酸酶的水。實時PCR熱循環(huán)儀（StepOnePlus?；應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，MA，USA）用于檢測和收集結(jié)果，在37℃下開始反轉(zhuǎn)錄15 min。

1.7 黑質(zhì)酪氨酸羥化酶的免疫組化研究

將腦組織切片（4 μm）在37℃下放置過夜。每組取兩片，去乙?；?，再水化，用pH=9 Tris-EDTA洗滌。將原代兔多克隆抗磷酸酪氨酸羥化酶（TH）抗體稀釋成1∶800，并用該稀釋液滴到組織切片中，在4℃冰箱中孵育過夜，用生物素化二級抗體染色覆蓋染色60 min，最后用蘇木精復(fù)染。用光學(xué)顯微鏡在×100和×400放大倍數(shù)下，對每個組織切片中黑質(zhì)致密部的邊界進行檢查和成像。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。正態(tài)分布資料以（）表示，并用單因素方差分析（ANOVA）和t檢驗進行分析。不符合正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)用K-W方差分析方法進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 石仙桃多糖對魚藤酮所致PD大鼠行為障礙的影響

模型組大鼠毛發(fā)變黃，活動減少，行動遲緩和震顫，精神不振，對刺激反應(yīng)慢；行為學(xué)檢測結(jié)果，模型組的大鼠掉落滾的時間和掉落網(wǎng)格時間明顯較空白對照組縮短，在5 min內(nèi)表現(xiàn)出更多的停止次數(shù)，交叉方塊數(shù)量較少，活動指數(shù)較低（P＜0.05）。與模型組相比，陽性對照組大鼠活動增強，交叉方塊數(shù)量更多，活動指數(shù)更大，停止次數(shù)更少；石仙桃多糖組表現(xiàn)輕微。石仙桃多糖高劑量組大鼠，行為學(xué)檢測試驗中記錄的交叉方格數(shù)增多、停止次數(shù)減少和活性指數(shù)增加。見圖1。

圖1 石仙桃多糖對PD大鼠活動行為障礙的影響

2.2 石仙桃多糖對魚藤酮所致PD大鼠紋狀體多巴胺和丙二醛的影響

模型組大鼠紋狀體DA水平降低，陽性對照組可增加紋狀體DA水平。石仙桃多糖高劑量組顯著增加紋狀體DA水平，見圖2D。模型組紋狀體MDA含量較高，陽性對照組和石仙桃多糖低、中、高劑量組均顯著降低紋狀體MDA的水平（P＜0.05）。與陽性對照組相比，石仙桃多糖高劑量組對MDA水平的作用明顯優(yōu)于陽性對照組（P＜0.05）。見圖2E。

圖2 石仙桃多糖對魚藤酮所致PD大鼠紋狀體多巴胺和丙二醛的影響

2.3 石仙桃多糖對PD大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表達的影響

定量PCR檢測大鼠紋狀體中的炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β的結(jié)果表明，模型組與空白對照組大鼠相比，表達顯著增加（P＜0.05），陽性對照組大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表達下降（P＜0.05）。與模型組相比，石仙桃多糖低劑量組PD大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表達不顯著，石仙桃多糖中、高劑量組PD大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表達顯著降低（P＜0.05）。石仙桃多糖高劑量組大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β呈低表達（P＜0.05），見表1。

表1 PD大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表達比較（± s）

表1 PD大鼠紋狀體炎癥因子TNF-α、NF-κB和IL-1β表達比較（± s）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與陽性對照組相比，$P＜0.05

組別 TNF-α NF-κB IL-1β空白對照組 2.65±0.35 1.25±0.21 1.86±0.31模型組 19.31±3.56* 24.84±4.25* 17.98±2.84*陽性對照組 7.82±1.26*# 11.25±2.38*# 6.53±1.48*#石仙桃多糖低劑量組 17.85±3.87*$ 22.43±4.56*$ 14.97±1.42*$石仙桃多糖中劑量組 13.26±2.46*# 19.68±3.42*# 10.36±2.48*#石仙桃多糖高劑量組 7.56±1.23*# 6.87±1.47*# 4.24±0.85*#

2.4 石仙桃多糖對PD大鼠紋狀體TH的影響

免疫組織HE染色，圖3a、b為HE染色黑質(zhì)神經(jīng)元的正常外觀；模型組TH陽性細胞數(shù)量減少，胞漿染色模糊，核固縮，見圖3c、d。石仙桃多糖干預(yù)處理相對增加了TH陽性神經(jīng)元的數(shù)量，其具有顯著的胞漿染色反應(yīng)，見圖3e、f。石仙桃多糖高劑量組大鼠的腦切片顯示出對TH的強烈胞漿染色反應(yīng)和較高百分比的TH陽性神經(jīng)元，表明石仙桃多糖具有強烈的神經(jīng)保護作用見圖3g。

圖3 各組大鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酶免疫組化HE染色注：圖a和b：空白對照組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細胞免疫組化HE染色（×10和×40）；圖c和d：模型組TH陽性細胞數(shù)明顯減少（×10）；圖e和f：石仙桃多糖中、低劑量組的TH陽性細胞數(shù)明顯比模型組多（×10和×40）；圖g：石仙桃多糖高劑量組出現(xiàn)較多的TH陽性數(shù)目；圖h：陽性對照組TH高表達（×10和×40）

3 討論

石仙桃屬（Pholidota）是蘭科（orehidaeeae）植物，別名石橄欖、石上仙桃和石上蓮等。石仙桃的主要成分是多糖，含量2.25%[7]。研究發(fā)現(xiàn)多糖具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗凝血、降糖等多方面的生物活性[8]。本課題組采用石仙桃多糖，通過建立肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）肺炎模型BALB/c小鼠模型，通過定量培養(yǎng)肺泡灌洗液（BALF）肺炎支原體、肺組織病理學(xué)評分（HPS）和檢測BALF中IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-12等的表達，探討石仙桃多糖治療肺炎支原體肺炎小鼠的可能作用機制。研究結(jié)果：石仙桃多糖干預(yù)肺炎支原體模型小鼠1～3 d，能迅速調(diào)節(jié)MPP小鼠體內(nèi)的免疫功能，小鼠BALF中IL-1β、IFN-γ、IL-12、TNF-α等細胞因子明顯下調(diào)，輔助性Th1細胞因子明顯降低，小鼠肺部炎癥明顯減少，其作用機制可能參與調(diào)節(jié)肺炎支原體模型小鼠體內(nèi)Th1/Th2細胞有關(guān)[9]。

帕金森病是一種神經(jīng)退行性疾病，主要由紋狀體多巴胺能神經(jīng)元損傷引起。一些與氧化應(yīng)激和炎癥有關(guān)的生化異常也在帕金森病腦中被發(fā)現(xiàn)[10]。臨床和動物研究的數(shù)據(jù)表明，神經(jīng)炎與帕金森病病理學(xué)及神經(jīng)退行性機制相關(guān)[11]。 魚藤酮是一種高親脂性殺蟲劑和除草劑，它容易穿過生物膜，常用于誘發(fā)帕金森病運動功能障礙動物模型。其機制是阻斷復(fù)合體I中的線粒體電轉(zhuǎn)運鏈，從而降低選擇性影響黑質(zhì)神經(jīng)元的氧化磷酸化。魚藤酮作為檢查嚙齒類動物氧化應(yīng)激所致多巴胺能損傷機制的一個有價值的工具，氧化應(yīng)激在帕金森病的病理學(xué)中起著重要作用。應(yīng)用魚藤酮建立的PD動物模型不僅很好地模擬PD突觸核蛋白聚集和路易小體形成，而且還可以復(fù)制PD的所有癥狀[12]。

在本研究中，模型組引起的運動障礙類似于帕金森病，滾軸實驗和網(wǎng)格試驗中，大鼠停止次數(shù)增加，交叉方塊減少，活動明顯減少。與模型組相比，石仙桃多糖高劑量組大鼠這種運動障礙得到改善，其方形數(shù)量增加，停止次數(shù)減少。石仙桃多糖高劑量組紋狀體多巴胺水平高于模型組；石仙桃多糖低、中劑量組處理PD模型導(dǎo)致紋狀體多巴胺水平略有增加，但不足以顯著改善運動行為。

細胞因子在神經(jīng)退化過程中起重要作用。在帕金森病患者中，研究顯示NF-κB向細胞核的易位顯著增加[13]，并伴有誘導(dǎo)的細胞因子轉(zhuǎn)錄[14]。此外，發(fā)現(xiàn)帕金森病患者大腦中IL-1β、IL-6、IL-2和IL-4水平上調(diào)[15]。本研究結(jié)果表明，模型組紋狀體中TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達水平較高。石仙桃多糖高劑量組大鼠上述細胞因子表達大幅下降。與模型組相比，石仙桃多糖高劑量組免疫組化出現(xiàn)的TH神經(jīng)元數(shù)量增加，本研究結(jié)果與Strathern等[16]實驗結(jié)果一致。

綜上所述，本研究表明石仙桃多糖具有顯著的抗氧化、抗損傷和神經(jīng)保護作用。本研究初步認(rèn)為，石仙桃多糖神經(jīng)保護活性可能與其消炎抗菌作用有關(guān)，課題組將在動物實驗基礎(chǔ)上進行深入臨床研究。