施韜關(guān)靜李進(jìn)趙翠 蘭蘭王大勇 王洪陽(yáng)王秋菊*

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與信息工程學(xué)院（杭州 310053）

2 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部，國(guó)家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，解放軍耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100853）

PCDH15變異導(dǎo)致Usher綜合征1型（USH1）或常染色體隱性遺傳性耳聾23型（DFNB23）。USH1是一種以進(jìn)行性視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pig‐mentosa,RP）和先天性感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失為特征的常染色體隱性疾病，伴有先天性前庭功能障礙，運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、難以保持平衡[1-4]。USH1在視力異常表型出現(xiàn)之前，與非綜合征型耳聾（Non-syn‐dromic hearing loss,NSHL）表型相同，也被稱(chēng)為擬非綜合征型耳聾（mimics NSHL）[5]。因此，當(dāng)臨床中發(fā)現(xiàn)PCDH15變異的患者，需監(jiān)測(cè)隨訪以鑒別是否可能為USH1。

目前，已報(bào)道的PCDH15變異位點(diǎn)為144個(gè)（http://www.hgmd.cf.ac.uk/,Update 2020/04），大多為國(guó)外報(bào)道，且很少有針對(duì)PCDH15變異患者的描述，國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道更少。本研究通過(guò)新一代測(cè)序技術(shù)，在4個(gè)家系中檢出PCDH15復(fù)合雜合變異，并分析4個(gè)家系的基因型及表型特征。

1 研究對(duì)象

研究對(duì)象為2016年3月-2019年6月在解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科就診的4個(gè)漢族耳聾家系（圖1），共18人，6名患者均為先天性極重度感音神經(jīng)性耳聾，男性2名、女性4名，分別來(lái)自河北、北京、河南、山東；其中3名兒童，3名成人。收集先證者及其父母或家屬血樣，共18份。所有研究對(duì)象均已簽署知情同意書(shū)，未成年子女由其父母簽署同意書(shū)。

圖1 PCDH15變異相關(guān)耳聾患者家系及聽(tīng)力圖。B1：+/+表示c.3441 del A/c.2528 C＞A；A2：患者9月左側(cè)植入CI后助聽(tīng)聽(tīng)閾；B2：患者29歲雙耳聽(tīng)閾；C2：患者11月雙耳聽(tīng)閾；D2：患者10月齡右側(cè)植入CI后雙耳聽(tīng)閾。Fig.1 Pedigrees of deafness families related to variants of PCDH15.B1:+/+mean by c.3441 del A/c.2528 C＞A;A2:The patient’s left hearing threshold after left cochlear implant in 9 months ago;B2:The patient’s binaural hearing threshold in 29 years old;C2:The patient’s binaural hearing threshold in 11 months old;D2:The patient’s binaural hearing threshold after right cochlear implant in 10 months ago.

2 研究方法

2.1 臨床資料收集

采用項(xiàng)目組自主設(shè)計(jì)的問(wèn)卷調(diào)查表，記錄患者病史，完成家系調(diào)查并繪制家系圖。對(duì)患者進(jìn)行聽(tīng)力學(xué)檢查，包括純音測(cè)聽(tīng)、聲導(dǎo)抗、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（distortion product otoacoustic emissions,DPOAE），對(duì)嬰幼兒進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)（auditory brainstem re‐sponse,ABR）、40Hz聽(tīng)覺(jué)事件相關(guān)電位（40 Hz au‐ditory event related potential,40Hz AERP）及聽(tīng)覺(jué)穩(wěn)態(tài)反應(yīng)（auditory steady state responses,ASSR）檢查。聽(tīng)力損失程度根據(jù)500、1k、2k、4kHz平均聽(tīng)閾分類(lèi)，分為26-40dB HL輕度、41-55 dB HL中度、56-70 dB HL中重度、71-90 dB HL重度以及＞90 dB HL極重度聽(tīng)力損失。對(duì)患者進(jìn)行眼科檢查及影像學(xué)檢查，包括眼底鏡檢查、顳骨CT、內(nèi)聽(tīng)道MRI，評(píng)估患者眼部是否存在異常。對(duì)患者進(jìn)行1-3年電話(huà)隨訪及復(fù)診，對(duì)遲發(fā)性眼部臨床表型進(jìn)行長(zhǎng)期的關(guān)注。

2.2 基因測(cè)序

采集的血樣提取基因組DNA，試劑盒由天根生物科技（北京，中國(guó)）提供。將DNA片段化及末端修復(fù)之后，構(gòu)建DNA文庫(kù)。運(yùn)用新一代測(cè)序技術(shù)，對(duì)其中2名患者進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域測(cè)序（Targeted Regions Sequencing,TES），2名患者全外顯子測(cè)序（Whole exome sequencing,WES）。通過(guò)生物信息分析方法，確定可疑致病基因變異，先證者及其親屬均進(jìn)行變異位點(diǎn)的Sanger驗(yàn)證。

2.3 致病性分析

得到變異位點(diǎn)后，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)（The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）指南將變異分為致病變異、疑似致病變異、意義不明的變異以及良性變異[6-8]。對(duì)于拷貝體變異（Copy number variations,CNVs），同樣參考ACMG指南[9]。

3 研究結(jié)果

3.1 聽(tīng)力臨床表型

1707699 （圖1-A1：III.1），女，8歲，2月齡ABR檢測(cè)，雙耳氣骨導(dǎo)在100dB nHL均無(wú)反應(yīng)；ASSR檢測(cè)，雙耳100dB nHL均無(wú)反應(yīng)；40Hz AERP檢測(cè)，雙耳100 dB nHL均無(wú)反應(yīng)。

1707867 （圖1-B1：II.3），女，29歲，先天性聾，右耳平均聽(tīng)閾96.25dB HL，左耳平均聽(tīng)閾103.75 dB HL，聲導(dǎo)抗正常。II.2先天性聾，右耳平均聽(tīng)閾105dB HL，左耳平均聽(tīng)閾107.5 dB HL。

1808120 （圖1-C1：III.3），男，3歲，7月齡ABR檢測(cè)，雙耳氣導(dǎo)在100dB nHL均無(wú)反應(yīng)；ASSR檢測(cè)，雙耳100dB nHL均無(wú)反應(yīng)；DPOAE檢測(cè)，雙耳各頻率均未引出；聲導(dǎo)抗顯示雙耳A型。

1908312 （圖1-D1：II.1），女，4歲，10月齡ABR檢測(cè)，雙耳氣導(dǎo)在95dB nHL均無(wú)反應(yīng)；ASSR檢測(cè)，雙耳平均聽(tīng)閾均為116dB nHL；DPOAE檢測(cè)，雙耳各頻率均未引出?；純河?0月齡右側(cè)植入人工耳蝸（cochlear implant,CI），助聽(tīng)后右耳平均聽(tīng)閾23.75dB HL。

四名先證者顳骨CT檢查正常，提示無(wú)內(nèi)耳畸形。

3.2 基因檢測(cè)結(jié)果

家系1707699和1908312的先證者及父母進(jìn)行WES檢測(cè)，家系1707867和1808120的先證者進(jìn)行TES檢測(cè)，共檢測(cè)出7種PCDH15變異（NM_033056.3），2種無(wú)義變異，2種剪接位點(diǎn)變異，1種錯(cuò)義變異，1種移碼變異，1種CNV（表1）。7種變異中，c.733C＞T為已報(bào)道的致病變異位點(diǎn)[2]，c.2528C＞A為已報(bào)道的意義不明的變異位點(diǎn)[10]，根據(jù)該家系表型及ACMG指南建議（PM2+PP1+PP3,PM表示證據(jù)強(qiáng)度中等，PP表示輔助證據(jù)），考慮該變異位點(diǎn)為疑似致病。其余均為新發(fā)現(xiàn)的變異。

表1 基因檢測(cè)結(jié)果及分析Table 1 Summary and analysis of genotype

對(duì)先證者父母及家族成員（12人）進(jìn)行Sanger驗(yàn)證，結(jié)果顯示所有親屬均為PCDH15變異單雜合攜帶者。家系1707699中，III.1為EX19-21del和c.1997+1G＞A復(fù)合變異遺傳模式，EX19-21長(zhǎng)度約為27kb，III.2檢測(cè)結(jié)果為EX19-21 del單雜合攜帶。家系1707867中，II.3為c.3441 del A和c.2528C＞A復(fù)合雜合變異，II.1和II.2與II.3的變異位點(diǎn)相同。家系1808120中，II.3為c.733C＞T和c.157+1G＞A，家系1908312中，II.1為c.733C＞T和c.2756del T，均攜帶c.733C＞T這個(gè)變異位點(diǎn)。所有先證者均符合常染色體隱性遺傳模式。

3.3 隨訪結(jié)果

得到變異位點(diǎn)后，為明確患者病因，需對(duì)患者及攜帶者進(jìn)行隨訪，告知有可能存在遲發(fā)性RP表型的可能性，強(qiáng)調(diào)視力方面檢查的重要性（表2）。

表2 先證者表型匯總Table 2 Summary of phenotype of probands

1707699 （圖1-A1：III.1）于9月齡時(shí)左側(cè)植入CI，植入后左耳平均聽(tīng)閾為41.25dB HL，3歲時(shí)為31.25dB HL（圖2-B）。雙音節(jié)言語(yǔ)識(shí)別率為100%，語(yǔ)句識(shí)別為95%?；純?8月齡能獨(dú)立行走，雙眼遠(yuǎn)視、散光，5歲時(shí)眼底鏡檢查正常（圖2-A）。III.2為EX19-21del雜合攜帶者，目前三歲，聽(tīng)力正常，言語(yǔ)發(fā)育可。

圖2 170769眼底鏡檢查與助聽(tīng)后聽(tīng)閾變化。A為患者眼底鏡檢查結(jié)果（正常）；B為患者植入CI聽(tīng)閾變化。Fig.2 Ophthalmofundoscopy and threshold change after CI of 170769.A:result of ophthalmofundoscopy(normal);B:threshold change after CI.

1707867 （圖1-B1：II.3），主訴無(wú)眩暈、走路不穩(wěn)等前庭相關(guān)功能異常，視力在正常范圍之內(nèi)。II.1和II.2臨床表型與其相同，II.1目前33歲，13歲時(shí)右側(cè)植入CI，使用兩年后效果不佳，后未再佩戴。II.2和II.3均雙側(cè)佩戴助聽(tīng)器，自述交流能力一般。III代子女聽(tīng)力均正常，視力在正常范圍之內(nèi)，年齡10月-13歲。

1808120 （圖1-C1：III.3），11月齡左側(cè)植入CI，交流能力尚可。患兒確診為運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，走路和下樓梯經(jīng)常性的摔倒。由于年齡限制，無(wú)法進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖檢查，家長(zhǎng)拒絕進(jìn)行眼底鏡檢查。

1908312 （圖1-D1：II.1），10月齡右側(cè)植入CI，交流能力尚可。18月齡獨(dú)立行走，視力雙眼遠(yuǎn)視及散光，存在夜晚外出困難的癥狀，由于年齡限制，無(wú)法進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖檢查，家長(zhǎng)拒絕進(jìn)行眼底鏡檢查。

4 討論

PCDH15與鈣粘蛋白23是內(nèi)耳毛細(xì)胞靜纖毛頂連接（tip-link）的重要組成部分，內(nèi)耳毛細(xì)胞是一種機(jī)械-電傳感器，完成聲電轉(zhuǎn)換，幫助產(chǎn)生聽(tīng)覺(jué)和平衡知覺(jué)[11,12]。毛細(xì)胞頂端存在靜纖毛，靜纖毛的擺動(dòng)可以通過(guò)tip-link的控制打開(kāi)機(jī)械門(mén)控通道[13,14]。PCDH15變異改變蛋白結(jié)構(gòu)域的空間形態(tài)，機(jī)械門(mén)控通道出現(xiàn)異常，引起USH1F或DF‐NB23[1,2,1517]。Alagramam等在成人和胎兒視網(wǎng)膜及內(nèi)耳內(nèi)發(fā)現(xiàn)PCDH15的表達(dá)[1]。Ahmed等發(fā)現(xiàn)在人眼的感光細(xì)胞中存在PCDH15，這表明USH1患者在視力方面存在缺陷，將出現(xiàn)進(jìn)行性RP[16]。因此，USH1臨床表型包括耳聾、前庭功能障礙和RP。

表3 在不同種族中PCDH15導(dǎo)致的USH1Table 3 USH1 caused by PCDH15 in different races

PCDH15變異導(dǎo)致的USH1是一種典型的mimics NSHL，患者在早期僅表現(xiàn)出耳聾特征，而RP是遲發(fā)性的。通常，患者10歲左右將會(huì)出現(xiàn)夜盲和隧道視覺(jué)等RP早期癥狀，隨后視野進(jìn)行性向心性縮小，直至完全失明[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，患者在21歲時(shí)才出現(xiàn)RP早期癥狀[3]。1908312已出現(xiàn)夜盲的癥狀，并且其與1707699均為遠(yuǎn)視及散光。有研究表明在NSHL兒童中USH1發(fā)生率為1.3-2.2%[22]。在Vonam等的研究中，新一代測(cè)序能使USH1的診斷年齡早于視力損失的發(fā)病年齡[24]，為USH1家庭帶來(lái)許多即時(shí)和長(zhǎng)期的幫助[17]。本研究通過(guò)基因檢測(cè)后的隨訪，3名最初診斷為NSHL的兒童，在檢測(cè)出PCDH15變異后，隨訪發(fā)現(xiàn)視力及前庭的異常表型。

PCDH15是導(dǎo)致USH1的主要致病基因，在德系猶太人中PCDH15是最常見(jiàn)的致病基因，c.733C＞T在該人群中存在始祖效應(yīng)，占據(jù)USH1的比例為50%-60%，c.733C＞T的攜帶率為0.79%-2.48%[2,20]。在本研究中，2名患者均有c.733C＞T致病位點(diǎn)，考慮將其作為中國(guó)人群PCDH15熱點(diǎn)變異進(jìn)行下一步研究。

PCDH15變異導(dǎo)致的USH1，除了可以通過(guò)單核苷酸變異致病，CNV同樣也是關(guān)鍵致病變異類(lèi)型。CNV與遺傳性耳聾關(guān)系密切[25]。1707699外顯子19-21缺失，長(zhǎng)度約為27kb，CNV是指大于1kb的DNA片段的缺失/重復(fù)[26]。大多數(shù)已報(bào)道的CNV集中在PCDH15前5個(gè)外顯子及第20外顯子附近，在本研究中檢測(cè)出的EX19-21 del包含在已報(bào)道的CNV范圍內(nèi)（表4）。由此可見(jiàn)，PCDH15基因除了點(diǎn)變異，CNV也是的主要變異類(lèi)型。

表4 PCDH15已報(bào)道的拷貝體變異Table 4 CNVs has been reported in PCDH15

PCDH15表達(dá)于毛細(xì)胞靜纖毛間的tip-link，其變異影響耳蝸的機(jī)電轉(zhuǎn)換，CI是通過(guò)手術(shù)，將電極片植入內(nèi)耳，直接作用于螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，繞過(guò)耳蝸的機(jī)電轉(zhuǎn)換，進(jìn)而幫助患者感知聲音[35-37]。在本次研究中，通過(guò)隨訪發(fā)現(xiàn)，3例兒童CI植入效果較好，1707699植入后雙音節(jié)詞言語(yǔ)識(shí)別率達(dá)到100%。1707867的哥哥在13周歲時(shí)才植入CI，效果不佳，佩戴兩年后未再使用。通過(guò)這些發(fā)現(xiàn)，PCDH15變異的耳聾患者均存在先天性重-極重度聽(tīng)力損失，早期植入CI，可以讓兒童在言語(yǔ)發(fā)育關(guān)鍵期接受更多的聲音刺激，言語(yǔ)發(fā)育更好，后期兒童可以通過(guò)視力閱讀唇語(yǔ)，配合聽(tīng)覺(jué)康復(fù)來(lái)獲得更好地言語(yǔ)發(fā)展[2-3,38]。

PCDH15變異是導(dǎo)致DFNB23和USH1的重要原因，USH1在臨床上表現(xiàn)為雙耳先天性重-極重度聽(tīng)力損失、運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩及進(jìn)行性RP。本研究為4個(gè)極重度感音神經(jīng)性聾家系明確了分子病因，發(fā)現(xiàn)均為PCDH15復(fù)合雜合變異，其中有7個(gè)變異位點(diǎn)，包括2種無(wú)義變異，2種剪接位點(diǎn)變異，1種錯(cuò)義變異，1種移碼變異，1種CNV，5個(gè)為新發(fā)變異位點(diǎn)；考慮c.733C＞T為熱點(diǎn)變異位點(diǎn)，需進(jìn)一步研究；通過(guò)隨訪，分析PCDH15致病患者聽(tīng)力、視力、前庭功能的臨床表型，及CI佩戴效果，發(fā)現(xiàn)對(duì)于PCDH15基因變異導(dǎo)致的先天性極重度聾的患兒，在早期植入CI言語(yǔ)發(fā)育尚可，為PCDH15變異導(dǎo)致的USH1及DFNB23的分子診斷及治療干預(yù)提供參考意見(jiàn)，USH1作為mimics NSHL的一種，早期診斷及干預(yù)至關(guān)重要。