田崇梅 趙亞萍 傅利萍

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬紹興中醫(yī)院 浙江，紹興 312000

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，主要病因為高危型人類乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續(xù)感染，常見鱗癌、腺癌和腺鱗癌三種類型，可發(fā)生直接蔓延或淋巴轉(zhuǎn)移[1]。目前臨床上的治療方式主要為手術(shù)治療和放化療，但副作用很大，常引起惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應(yīng)[2]。因此，探究宮頸癌發(fā)病機(jī)制，開發(fā)治療宮頸癌的天然新藥，具有非常重要的臨床意義。

雞血藤是我國的傳統(tǒng)中藥，來源于豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn）的干燥藤莖。中國藥典（2020年版）記載，雞血藤具有活血、補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)、舒筋活絡(luò)等功效，可用于婦科疾病中的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、血虛萎黃等癥。此外，雞血藤具有抗癌作用，能夠誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]，但雞血藤對宮頸癌的作用鮮有報道。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過篩選雞血藤的有效成分，擬闡明雞血藤抗宮頸癌的作用機(jī)制，并通過細(xì)胞分子生物學(xué)實驗進(jìn)行驗證，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件 （1）中藥藥理學(xué)系統(tǒng)分析平臺（Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫：http://tcmspw.com/tcmsp.php；（2）基因組注釋數(shù)據(jù)平臺 （genome annotation database platform，GeneCard）：http://www.genecards.org/；（3）UniProt數(shù)據(jù)庫：https://www.uniprot.org/；（4）Venny工具：http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/；（5）String數(shù)據(jù)庫：https://string-db.org/；（6） 生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）：https://david.ncifcrf.gov/；（7）京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 數(shù)據(jù)庫：https://www.kegg.jp/；（8）R語言繪圖工具。

1.2 細(xì)胞株 宮頸癌Hela細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞庫（ATCC:28365），培養(yǎng)于含10%胎牛血清的洛斯維·帕克紀(jì)念研究所（Roswell Park Memorial Institute 1640，RPMI 1640）培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 藥品和試劑 雞血藤飲片購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠（批號：191201）；胎牛血清購于美國Gibco公司 （批號：10270106）；RPMI 1640培養(yǎng)基購于Hyclone公司（批號：AB216694）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT] 試劑購于美國Sigma公司（批號：1755C459）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒均購于康為世紀(jì)公司（批號：50206、00271508）；胱天蛋白酶3（caspase 3，CASP3）、Bax、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Vimentin、E-cadherin和β-actin抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司 （批號：0001、0013、0031、0002、0011、0015）； 熒光二抗IRDye 800 CM Goat anti-Rabbit抗體和IRDye 680 CM Goat anti-Rabbit抗體均購于美國LI-COR公司（批號：C70426-05、C70124-05）。

1.4 主要儀器 KQ-500DE型超聲儀購于昆山市超聲儀器有限公司；CP153型電子天平為奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；FD-1C-80型冷凍干燥機(jī)購于北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；5427R型高速冷凍離心機(jī)購于德國Eppendorf公司；CO2培養(yǎng)箱和超凈臺均為美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；Synergy H1MFD型多功能酶標(biāo)儀購于美國Biotek公司；LI-COR Odyssey型雙色紅外熒光成像系統(tǒng)購于美國LI-COR公司。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實驗方法

1.5.1 雞血藤成分預(yù)測與篩選 以“雞血藤”作為關(guān)鍵詞，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且 類藥 性 （drug-likeness，DL）≥0.18為條件，篩選雞血藤的有效活性成分。

1.5.2 關(guān)鍵靶點收集 通過Drugbank數(shù)據(jù)庫篩選雞血藤中有效成分的相關(guān)靶點，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行整理歸納；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫輸入“cervical cancer”（宮頸癌），選擇人類基因，得到其相關(guān)靶點，通過Venny工具將二者取交集，得到交集靶點。

1.5.3 關(guān)鍵靶點蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及篩選 通過String數(shù)據(jù)庫對雞血藤有效成分與宮頸癌交集關(guān)鍵靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，選擇物種為人類。篩選平均度值 （degree）≥50的節(jié)點，作為雞血藤治療宮頸癌的關(guān)鍵蛋白節(jié)點。

1.5.4 基因本體（gene ontology，GO）分析 將雞血藤有效成分與宮頸癌交集靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇物種為人類，進(jìn)行GO分析。最終設(shè)定閾值P＜0.05，篩選出具有顯著性差異的生物過程，用GraphPad Prism 5繪圖。

1.5.5 KEGG分析 通過KEGG數(shù)據(jù)庫，搜索KEGG mapping中的Search Pathway，輸入雞血藤有效成分與宮頸癌交集靶點，得到雞血藤治療宮頸癌的信號通路圖。

1.6 細(xì)胞分子生物學(xué)實驗方法

1.6.1 細(xì)胞增殖率檢測 宮頸癌Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，以MTT法檢測不同濃度雞血藤醇提物對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖率的影響。雞血藤醇提物提取條件：藥材粉碎后過4號篩，以80%乙醇，料液比1∶20，功率300W，頻率60kHz，超聲提取25min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并冷凍干燥，獲得凍干粉。

1.6.2 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測 取對數(shù)生長期宮頸癌Hela細(xì)胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，通過電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至活化的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，隨后將膜封閉于5%脫脂奶粉中，一抗4℃孵育過夜，洗膜3次，每次10min，二抗避光孵育2h，最后顯色，通過Image J 1.41軟件計算各蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件及Graph-Pad Prism 7.0繪圖軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，每次實驗重復(fù)3次。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用最小顯著法檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雞血藤有效成分的預(yù)測 通過在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為條件，并刪除靶點≤1的成分，共得到21種化學(xué)成分。見表1。

表1 雞血藤潛在有效成分Tab.1 Potential effective ingredients of Spatholobi Caulis

2.2 作用靶點預(yù)測 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和Drugbank數(shù)據(jù)庫收集到雞血藤有效成分相關(guān)靶點110個，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫分析得到宮頸癌靶點6 662個，通過韋恩圖分析共有100個交互靶點，即得到雞血藤治療宮頸癌的關(guān)鍵靶點。見圖1。

圖1 雞血藤與宮頸癌靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Spatholobi Caulis and cervical cancer targets

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將雞血藤有效成分治療宮頸癌的100個關(guān)鍵靶點制成PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。去掉游離靶點，共涉及97個節(jié)點及1 205條邊，平均degree為24.34。這97個靶點相互作用、相互影響，通過多通道、多方面、多維度協(xié)調(diào)的機(jī)制治療宮頸癌。

圖2 雞血藤治療宮頸癌靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Interaction network of protein targets of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

如圖3所示，根據(jù)連線多少進(jìn)行整合分析，得到前30名連線較靠前的靶點，根據(jù)degree≥50條件得出前9個關(guān)鍵蛋白節(jié)點，關(guān)鍵蛋白分別為蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、原癌基因JUN和MYC、CASP3、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、 白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），這說明以上靶點基因?qū)τ陔u血藤治療宮頸癌具有非常重要的意義，可作為雞血藤有效成分的作用靶點。

圖3 雞血藤治療宮頸癌的關(guān)鍵蛋白Fig.3 Key protein of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

2.4 GO富集分析 細(xì)胞生物過程富集基因數(shù)越多，顏色越紅，表明錯誤檢出率（false discovery rate，F(xiàn)DR）越低，相關(guān)性越強(qiáng)。GO富集分析結(jié)果顯示，雞血藤100個潛在靶點基因中GO分析結(jié)果排名較靠前的生物學(xué)功能如下：蛋白體的活動、近端啟動子序列特異性脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）結(jié)合、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）聚合酶Ⅱ特異性、輔因子結(jié)合、血紅素結(jié)合、泛素樣蛋白結(jié)合、核受體活性等。見圖4。由此表明，雞血藤能夠通過參與多種生物學(xué)過程抗癌。

圖4 雞血藤治療宮頸癌靶點的GO分析Fig.4 GO analysis of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

2.5 KEGG通路富集分析 結(jié)果提示，靶點主要涉及的通路為動脈粥樣硬化晚期糖基化終末化產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）及晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、乙肝、人巨細(xì)胞病毒感染、腫瘤壞死因子和細(xì)胞凋亡信號通路等，提示以上通路可能成為深入研究雞血藤抗宮頸癌的重要靶點，且與前列腺癌、直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌等腫瘤關(guān)系密切。見圖5。由此表明，多成分、多靶點、多通路相互調(diào)節(jié)可能是雞血藤抗宮頸癌的作用機(jī)制。

圖5 雞血藤治療宮頸癌靶點的KEGG通路分析Fig.5 KEGG pathways analysis of potential targets of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

2.6 靶點途徑分析 涉及凋亡的相關(guān)基因為CASP3、CASP8、CASP9、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）、Bcl-2、氨基末端轉(zhuǎn)移酶（N-terminal kinase，JNK）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），這些基因在圖中標(biāo)記為紅色。 見圖6。說明雞血藤抗宮頸癌與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，該結(jié)果能夠為進(jìn)一步細(xì)胞分子生物學(xué)驗證分析提供參考。

圖6 雞血藤治療宮頸癌靶點相關(guān)通路Fig.6 Related pathways of Spatholobi Caulis in the treatment of cervical cancer

2.7 細(xì)胞分子生物學(xué)實驗

2.7.1 雞血藤醇提物對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖抑制

MTT結(jié)果提示，雞血藤醇提物具有抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的作用，伴隨著濃度的增加，增殖抑制率也顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）=62μg·mL-1，提示雞血藤醇提物可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。見圖7。

圖7 雞血藤醇提物對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖抑制的影響Fig.7 Inhibitory effects of ethanolic extract of Spatholobi Caulis on proliferation of Hela cells

2.7.2 雞血藤對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 CASP3、Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子[4]，雞血藤醇提物處理后宮頸癌Hela細(xì)胞CASP3和Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低。見圖8。Bcl-2蛋白能夠抑制細(xì)胞凋亡，而CASP3和Bax蛋白則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，由此可以看出雞血藤醇提物對宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。Vimentin和E-cadherin蛋白是與細(xì)胞遷移相關(guān)的因子，Vimentin能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移，而E-cadherin則抑制細(xì)胞遷移[5]。本研究結(jié)果表明，雞血藤醇提物處理后Vimentin蛋白表達(dá)明顯降低，而E-cadherin的表達(dá)明顯升高。見圖8。因此，雞血藤醇提物通過提高宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制遷移蛋白的激活，從而誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用。

圖8 雞血藤醇提物對宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of ethanolic extract of Spatholobi Caulis on apoptosis protein expression of Hela cells

3 討論

《本草備要》記載雞血藤具有活血補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止痛、舒筋活絡(luò)的功效，用于月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、經(jīng)閉、風(fēng)濕痹痛、麻木癱瘓、血虛萎黃的治療。研究證實，雞血藤能夠通過多種藥理機(jī)制抑制癌癥，包括抑制炎癥、抗氧化應(yīng)激、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)自噬、抗腫瘤轉(zhuǎn)移等[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門重要的新興學(xué)科，能夠篩選中藥中的活性成分以及潛在靶點，這恰好與中國傳統(tǒng)中藥多成分、多靶點、多通路協(xié)同發(fā)揮作用的特性相符[7]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過數(shù)據(jù)庫篩選雞血藤抗宮頸癌的有效成分、關(guān)鍵靶點和作用通路，并通過細(xì)胞分子生物學(xué)實驗驗證雞血藤對宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，闡明雞血藤抗宮頸癌的可能作用機(jī)制。

本研究首先通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出雞血藤中21種活性成分，這可能成為雞血藤抗宮頸癌的物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究報道，雞血藤中的甘草查爾酮A（licochalcone A）和木犀草素（luteolin）對人肺癌A549細(xì)胞具有顯著的抑制作用，能夠通過凋亡通路治療非小細(xì)胞肺癌[8]，這提示雞血藤抗宮頸癌可能與調(diào)節(jié)凋亡通路有關(guān)。本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出9個與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的關(guān)鍵作用靶點，分別為AKT1、MAPK1、EGFR、JUN、MYC、CASP3、VEGFA、IL-6、STAT3。在細(xì)胞凋亡中CASP家族扮演著非常重要的角色，相關(guān)基因有CASP3、CASP8、CASP9、Bcl-2等，其中Bcl-2作為自噬反應(yīng)代表蛋白，參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程[9-10]。為了深入研究雞血藤抗宮頸癌的分子機(jī)制是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)，課題組進(jìn)一步以體外實驗加以驗證。免疫印跡結(jié)果表明，雞血藤能夠調(diào)控宮頸癌Hela細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因CASP3、Bcl-2和Bax，遷移相關(guān)基因Vimentin和E-cadherin的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并抑制其遷移，由此表明雞血藤抗宮頸癌的作用機(jī)制與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，為進(jìn)一步研究提供了新靶點。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究雞血藤抗宮頸癌的作用機(jī)制，闡明雞血藤治療宮頸癌是通過多成分、多靶點和多通路發(fā)揮作用，并通過細(xì)胞分子生物學(xué)實驗證實雞血藤能夠誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果為深入研究雞血藤抗宮頸癌提供了實驗基礎(chǔ)，并為開發(fā)高效低毒的天然抗癌新藥提供了新思路。