楊文山，王一晨，劉 屏，胡 園

（1. 中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心藥劑科，北京 100853；2. 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；3. 82 集團(tuán)軍醫(yī)院門診部，河北 保定 071000）

重度抑郁癥是一種嚴(yán)重威脅全世界人民身心健康的精神類疾病，其主要特征是情緒低落并伴有疲勞、注意力不集中、睡眠障礙和語言障礙的精神障礙綜合征［1］. 盡管人們對重度抑郁癥進(jìn)行了廣泛深入的研究，重度抑郁癥的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)取得了十分顯著的進(jìn)展，例如科學(xué)家發(fā)現(xiàn)單胺類特別是5-羥色胺的缺乏是重度抑郁癥的重要發(fā)病機(jī)制之一［2］。然而越來越多的研究表明，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的改變不足以解釋重度抑郁癥的全部發(fā)病機(jī)制，目前的治療方案對某些抑郁癥患者療效有限甚至是無效。

重度抑郁癥潛在的發(fā)病機(jī)制中，突觸可塑性、表觀遺傳學(xué)和免疫系統(tǒng)起著十分重要的作用。進(jìn)一步研究重度抑郁癥發(fā)病機(jī)制的分子機(jī)制和信號通路，發(fā)現(xiàn)重度抑郁癥新的診斷和治療策略，仍極為重要的。幸運(yùn)的是，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)新的核心基因和信號通路與重度抑郁癥的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)。例如，Jollant 等［3］使用外周血轉(zhuǎn)錄組學(xué)闡明了5-羥色胺和nociceptin 系統(tǒng)與抑郁癥的活動相關(guān)。 Hepgul 等［4］則通過外周血轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)抑郁癥與IFN-α 分子機(jī)制相關(guān)的多條證據(jù)。 Wang 等［5］通過分析mRNA 的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)NFκB 信號通路在重度抑郁癥的發(fā)作和發(fā)展中起重要作用。 Carboni 等［6］發(fā)現(xiàn)大腦海馬轉(zhuǎn)錄因子在抑郁癥患者和具有抑郁癥癥狀的動物模型中生長因子信號傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)均存在失調(diào)現(xiàn)象。 因此，研究重度抑郁癥的關(guān)鍵基因和信號通路，闡明關(guān)鍵基因和信號通路之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，是進(jìn)一步闡明重度抑郁癥發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。為此，本研究旨在通過運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析建立關(guān)鍵基因和信號通路作為重度抑郁癥的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取與差異基因的篩選.

從美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站GEO 公共數(shù)據(jù)庫下載重度抑郁癥腦皮質(zhì)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE101521（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE101521）［7］。此 數(shù) 據(jù) 是 基于Illumina MiSeq 人類平臺GPL15520 的基因表達(dá)數(shù)據(jù)信息。該數(shù)據(jù)集包括：猝死的非精神病個體中收集的29 個大腦背外側(cè)前額葉皮層樣本和重度抑郁癥死亡患者中收集的30 個大腦背外側(cè)前額葉皮層樣本。本研究將GSE101521 數(shù)據(jù)集分為兩組，即正常組和重度抑郁癥組，并提取數(shù)據(jù)。 從GSE101521 數(shù)據(jù)集中選取的counts 數(shù)據(jù)通過edgeR 在networkanalyst（https：//www.networkanalyst.ca/）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并利用networkanalyst 篩選正常組和重度抑郁癥組之間存在差異的基因。篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置如下：| log2Fold Change（FC）| ＞1 并且校正后P值＜0.05。

1.2 Gene Ontology（GO）基因功能注釋和KEGG信號通路富集分析

使 用 Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery（DAVID）在 線 數(shù) 據(jù) 庫（https：//DAVID.ncifcrf.gov/）進(jìn)行Gene Ontology（GO）基因功能注釋富集分析［8，9］。富集分析從生物過 程（biological process，BP），細(xì) 胞 成 分（cellular components，CC）和 分 子 功 能（molecular function，MF）三方面進(jìn)行。此外，使用KOBAS 在線數(shù)據(jù)庫對KEGG 信號通路進(jìn)行分析（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3）［10］，篩 選 標(biāo) 準(zhǔn) 設(shè) 置 為P 值＜0.05。KEGG 是一個在已知生物過程中整合了基因，化合物和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫，并在整體水平分析了基因功能和基因組。

1.3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein interaction，PPI）分析

使 用STRING 11.0 在 線 軟 件（https：//stringdb.org/）［11］進(jìn) 行 差 異 基 因 的PPI 分 析，采 用Cytoscape 3.7.2［12］對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。使用Cytoscape 軟件的MCODE 插件篩選PPI 關(guān)鍵模塊，Cytoscape 的cytohubba 插件篩選PPI 關(guān)鍵基因。關(guān)鍵模塊的篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置如下：Degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，k-core=2 和max. depth =100；關(guān)鍵基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為degree ＞10。對得分最高的關(guān)鍵模塊中的差異基因再次進(jìn)行GO 功能注釋富集分析和KEGG 信號通路分析。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選

根據(jù) 校正后P值＜0.05 和|log2（FC）|＞1 的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出41 個正常組和重度抑郁癥組間見有顯著差異的基因，其中39 個差異基因上調(diào)，2 個差異基因下調(diào)，見圖1、表1。

表1 正常組和重度抑郁組之間差異表達(dá)基因Tab 1 Genes showing significant expressions between the normal and MDD groups.

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig 1 Volcano plot of genes with different expressions

2.2 GO 功能注釋富集分析和KEGG 信號通路富集分析結(jié)果

使用DAVID 在線數(shù)據(jù)庫對41 個顯著差異基因進(jìn)行GO 功能注釋富集分析。在生物過程（BP）方面，差異基因主要富集在炎性反應(yīng)，血管生成的陽性調(diào)節(jié)和細(xì)胞對熱的反應(yīng)，見圖2A。在細(xì)胞成分（CC）方面，差異基因主要富集在細(xì)胞外間隙，細(xì)胞外基質(zhì)和胞液，見圖2B。在分子功能（MF）方面，差異基因主要富集在未折疊蛋白結(jié)合和熱休克蛋白結(jié)合，見圖2C。KEGG 信號通路富集分析結(jié)果顯示，顯著差異基因主要富集在IL-17 信號通路，軍團(tuán)菌病和麻疹，見圖2D。GO 功能注釋富集分析和KEGG 信號通路富集分析結(jié)果顯示，與抑郁最相關(guān)的生物學(xué)功能是炎癥反應(yīng)。

圖2 差異表達(dá)基因GO 功能注釋富集分析和KEGG 信號通路分析Fig 2 GO and KEGG enrichment analyses of DEGs

2.3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein interaction，PPI）分析

為了篩選出了與重度抑郁癥最為相關(guān)的差異基因，本研究使用STRING 11.0 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 分析，將41 個差異基因映射到PPI 中，共包含28個節(jié)點(diǎn)和108 條線，見圖3A。PPI 分析結(jié)果顯示，28 個差異基因?qū)σ钟舭Y的發(fā)病機(jī)制有影響。應(yīng)用Cytoscape 軟件中的MCODE 插件篩選出了PPI 中3個群集。其中，集群1 得分最高（分?jǐn)?shù)= 8.222），包含10 個 節(jié) 點(diǎn)（FOS、SELE、ATF3、CXCL8、TNFAIP3、IL-6、IL-1B、C5AR1、CCL2、CXCL2）和37條連接線，見圖3B；群集2 包含4 個節(jié)點(diǎn)和6 條連接線（分?jǐn)?shù)= 4.000），見圖3C；群集3 包含3 個節(jié)點(diǎn)和3 條連接線（得分= 3.000）（圖3D）。

在 群 集1 中，Cytoscape 軟 件 的cytohubba 插 件將6 個基因（IL-6、CXCL8、IL-1B、FOS、CCL2、CXCL2）篩選為關(guān)鍵基因（degree＞10）。對得分最高的集群1 中的顯著差異基因進(jìn)行GO 功能注釋富集分析和KEGG 信號通路富集分析。 結(jié)果顯示，對于GO 功能注釋富集分析，群集1 的差異基因大部分在炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中富集，見圖4A。KEGG 信號通路富集分析表明，群集1 的差異基因主要富集在IL-17 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，TNF 信號通路和NOD 樣受體信號通路。全部6 個關(guān)鍵基因（CCL2、CXCL2、FOS、CXCL8、IL-6和IL-1B）都被定位在IL-17 信號通路上，5 個關(guān)鍵基因（CXCL2、CCL2、IL-1B、FOS、IL-6）被定位在TNF 信號上通路，見圖4B。此外，還篩選出了5 個關(guān)鍵基因（CCL2、CXCL2、CXCL8、IL-6和IL-1B）與群集1 中的NOD 樣受體信號通路相關(guān)。

圖4 集群1 的GO 功能和KEGG 信號通路富集分析Fig 4 GO and KEGG enrichment analyses of cluster 1

3 討論

本研究篩選出了41 個顯著差異基因，進(jìn)行了PPI 分析和模塊分析，篩選出了關(guān)鍵基因（IL-6、CXCL8、IL-1B、FOS、CCL2、CXCL2），KEGG 信號通路分析結(jié)果表明，與重度抑郁癥相關(guān)的最主要信號通路是IL-17 信號通路，TNF 信號通路和NOD 樣受體信號通路。本研究確定了可能參與重度抑郁癥發(fā)病機(jī)制的免疫系統(tǒng)新的標(biāo)志物和靶標(biāo)。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和下一代測序技術(shù)已經(jīng)產(chǎn)生了大量的數(shù)據(jù)集，包括lncRNA、miRNA 和mRNA 表達(dá)譜。許多研究者通過使用生物信息學(xué)技術(shù)，篩選出大量核心基因和信號通路來預(yù)測重度抑郁癥潛在的發(fā)病機(jī)制。與其他文獻(xiàn)不同的是，本研究從GEO 公共數(shù)據(jù)庫獲得了重度抑郁癥患者腦皮質(zhì)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的數(shù)據(jù)集（GSE101521），并應(yīng)用生物信息學(xué)分析篩選出了與重度抑郁癥最為相關(guān)的新的關(guān)鍵基因和信號通路。本研究利用DAVID 在線數(shù)據(jù)庫和KOBAS 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 功能注釋富集分析和KEGG 信號通路富集分析。DAVID 對顯著差異基因進(jìn)行GO 富集功能注釋的結(jié)果以及KEGG 信號通路富集分析結(jié)果表明，與重度抑郁癥患者發(fā)病機(jī)制最為相關(guān)的關(guān)鍵功能標(biāo)志是炎癥反應(yīng)。差異基因GO 功能注釋富集分析主要與生物過程有關(guān)，包括炎癥反應(yīng)，血管生成的正調(diào)節(jié)，細(xì)胞對熱的反應(yīng)，對未折疊蛋白的反應(yīng)，免疫反應(yīng)，細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)等。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，顯著差異表達(dá)基因富集到與重度抑郁癥相關(guān)的KEGG 信號通路是IL-17 信號通路，TNF 信號通路和NOD 樣受體信號通路。本研究部分結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致，表明免疫和炎性反應(yīng)是與重度抑郁癥發(fā)病機(jī)制最為相關(guān)的生物學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)［13-15］。腦中炎性因子和炎癥激活的增加在重度抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起著十分重要的作用［16］。一些組學(xué)研究還表明了IL-17 信號通路和TNF 信 號 通 路 與 抑 郁 癥 有 關(guān)［17，18］。TNF-α 通 過NF-κB 信號通路和促炎性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，在神經(jīng)炎癥中起關(guān)鍵作用［19］。IL-17 信號觸發(fā)細(xì)胞因子和趨化因子進(jìn)而激活NF-κB 信號通路［20］，抑制IL-17 細(xì)胞因子家族可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致病條件有益［21，22］。NF-κB 信號級聯(lián)反應(yīng)也可以激活NOD 樣受體［23］，NOD 樣受體炎性體的活化和激活導(dǎo)致人類巨噬細(xì)胞隨后釋放IL-1B［24］. 因此，結(jié)合文獻(xiàn)和本研究結(jié)果，筆者推測，NF-κB 信號級聯(lián)和NOD 樣受體信號的激活可能引起IL-17 信號和TNF 信號失調(diào)，并導(dǎo)致包括釋放細(xì)胞因子和趨化因子（IL-1B、IL-6、CCL2、CXCL2）在內(nèi)的一系列的免疫炎癥反應(yīng)，這在重度抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要

本研究結(jié)果表明，通過IL-17 信號通路，TNF 信號通路和NOD 樣受體信號通路激活了參與重度抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵基因（IL-6、CXCL8、IL-1B、FOS、CCL2、CXCL2），表明這些新的標(biāo)志物和靶標(biāo)參與了重度抑郁癥的免疫炎癥發(fā)病機(jī)制。不過，確切結(jié)論仍需實驗研究驗證。