張慶, 趙曉美, 王娉, 劉冰, 陳穎*

(1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 省部共建食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300457; 2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心, 北京 100176)

產(chǎn)毒真菌主要是指曲霉屬(Aspergillusspp.)、青霉屬(Penicilliumspp.)、鐮刀菌屬(Fusariumspp.)中能夠產(chǎn)生復(fù)雜有毒次級代謝產(chǎn)物的真菌，如黃曲霉(Aspergillusflavus)、赭曲霉(Aspergillusochraceus)、展青霉(Penicillumexpansum)、鐮刀菌屬(Fusariumspp.)等。它們能夠產(chǎn)生多種真菌毒素，如黃曲霉毒素(aflatoxin)B族和G族化合物具有強(qiáng)致癌、致畸作用，已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Reasearch on Cancer，IARC)列入Group1分組(對人類是致癌物)；赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)會侵害肝腎等器官；展青霉素(patulin)則會引起組織和器官病變、侵害神經(jīng)系統(tǒng)；玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)主要對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生危害，導(dǎo)致不孕、流產(chǎn)等病癥；T-2毒素是一種A型單端孢霉烯族化合物，具有免疫毒性，會抑制蛋白質(zhì)合成。產(chǎn)毒真菌污染食品普遍發(fā)生在食品的加工、運(yùn)輸、貯藏環(huán)節(jié)，其代謝產(chǎn)生的毒素會隨著食物進(jìn)入人體，對健康造成很大威脅。目前國內(nèi)外對于防控真菌污染食品的研究多是針對真菌毒素檢測，采用的技術(shù)主要有色譜技術(shù)、色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、免疫分析技術(shù)和生物傳感器技術(shù)等[1]，雖然可以有效實(shí)現(xiàn)對食品中真菌毒素的定性或定量分析，但是這種針對已被污染食品中的毒素含量檢測難以挽回已造成的經(jīng)濟(jì)損失。

相較于真菌毒素的檢測，直接對產(chǎn)毒真菌檢測能夠前置化干預(yù)其對食品的污染及對人類的危害，能夠在產(chǎn)毒真菌污染食品早期未產(chǎn)生毒素前發(fā)現(xiàn)問題，以便于及時采取措施。食品中產(chǎn)毒真菌鑒定方法有形態(tài)學(xué)觀察和生化鑒定[2]等，存在需要對真菌培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)周期較長、操作步驟繁瑣、主觀依賴性強(qiáng)、靈敏度低等缺陷。也有學(xué)者使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)對絲狀真菌進(jìn)行鑒定[3-4]，但是此技術(shù)依賴于完備的數(shù)據(jù)庫，而種類復(fù)雜且多樣化的真菌給數(shù)據(jù)庫建立帶來了非常大的挑戰(zhàn)。因此，亟需一種快速、高通量的產(chǎn)毒真菌檢測方法來保障食品真菌污染方面的質(zhì)量與安全。

基于核酸的檢測方法可以有效解決上述問題，不僅實(shí)現(xiàn)直接對產(chǎn)毒真菌的檢測，也一定程度上解決了真菌鑒定需要培養(yǎng)的問題，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)在真菌檢測中存在的缺陷，尤其是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展而來的各種檢測方法。本文綜述了近年來基于核酸檢測方法在食品產(chǎn)毒真菌中的檢測鑒定及應(yīng)用，探討了其優(yōu)缺點(diǎn)，并展望了產(chǎn)毒真菌檢測方法的未來發(fā)展趨勢。

1 基于PCR技術(shù)的產(chǎn)毒真菌檢測方法

1.1 常規(guī)PCR方法

PCR技術(shù)是1985年Mullis等[5]最先提出的一項(xiàng)DNA體外擴(kuò)增專利技術(shù)，在產(chǎn)毒真菌檢測方面的應(yīng)用原理是根據(jù)已經(jīng)公布的能實(shí)現(xiàn)分類鑒定的DNA序列設(shè)計引物，使用常規(guī)PCR技術(shù)擴(kuò)增出目的基因后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過比對分析擴(kuò)增的DNA片段實(shí)現(xiàn)真菌的檢測鑒別，通常針對具有產(chǎn)毒能力真菌的檢測會結(jié)合其已經(jīng)公布的毒力基因。張健等[6]使用真菌鑒定通用引物ITS1和ITS4對72株曲霉屬真菌進(jìn)行分類鑒定，結(jié)合OTA合成相關(guān)的聚酮合酶(PKS)的AT域序列設(shè)計特異性引物，使用單重PCR技術(shù)完成對產(chǎn)OTA黑曲霉(Aspergillusniger)的檢測，在基因組DNA濃度為12.5 pg·μL-1時可檢測到，雖然該方法產(chǎn)生了4%的假陽性結(jié)果，但是仍然可以作為產(chǎn)毒性黑曲霉的有效檢測方法。顧雙等[7]提取11種市售食品總DNA，使用ITS序列的引物pITS1和pITS4對其進(jìn)行真菌鑒定，結(jié)合橘霉素生物合成相關(guān)基因pksCT的引物K和L，同樣使用單重PCR技術(shù)完成對食品中產(chǎn)橘霉素真菌的檢測，并對發(fā)酵前、發(fā)酵中及滅菌后的pksCT基因擴(kuò)增情況進(jìn)行了評價，結(jié)果表明，食品加工過程中各條件參數(shù)會影響目的基因的檢出率，紅曲霉發(fā)酵食品能夠擴(kuò)增pksCT基因，而曲霉發(fā)酵食品未擴(kuò)增pksCT基因。Gonzalez-Salgado等[8]采用曲霉rDNA的多拷貝內(nèi)轉(zhuǎn)錄ITS區(qū)域引物ITS1和ITS4，結(jié)合單拷貝的黃曲霉毒素生物合成基因的特異性引物FLA1和FLA2，使用單重PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對小麥粉中產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉及寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)的檢測，結(jié)果表明，F(xiàn)LA1/FLA2的檢測可以有效避免假陰性的產(chǎn)生，檢出限(limit of detection，LOD)為10 pg·μL-1，但是該研究未能區(qū)分開黃曲霉和米曲霉(Aspergillusoryzae)。

以單重PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，多重PCR技術(shù)是在同一個反應(yīng)體系中加入2對或2對以上的引物，實(shí)現(xiàn)單體系同時擴(kuò)增多個片段，進(jìn)一步縮短了檢測時間，減少了工作量。李慧等[9]使用真菌鑒定通用引物ITS-600-F、ITS-600-R，結(jié)合依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)中的aflR(產(chǎn)黃曲霉毒素調(diào)節(jié)基因，aflatoxin biosynthesis regulatory gene)、omt-1(柄曲霉素轉(zhuǎn)甲氧基酶基因，sterigmatocystin o-mcthyltransferase gene)、ver-1(雜色曲霉素A脫氫酶基因，versicolorin A dehydrogenase gene)設(shè)計3對引物，在單體系中同時進(jìn)行4對特異性引物的多重PCR反應(yīng)，快速高效地完成對產(chǎn)黃曲毒素真菌的檢測，在基因組DNA濃度為100 pg·μL-1時可被檢出。Sadhasivam等[10]首先使用4～5組種特異性引物建立了可檢測7個曲霉屬、9個鐮刀菌屬和5個青霉屬的5個多重PCR體系，然后使用根據(jù)真菌毒素生物合成相關(guān)基因設(shè)計的引物建立了檢測產(chǎn)黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A及鐮刀菌毒素真菌的3個多重PCR體系，其LOD也達(dá)到100 pg·μL-1，其多重PCR檢測結(jié)果與LC/MS/MS檢測真菌毒素結(jié)果之間具有很好的相關(guān)性。多個多重PCR聯(lián)用可能成為快速篩選大量樣本的可靠診斷手段，使真菌檢測工作更加便捷高效。但是從以上研究可以看出，多重PCR方法的靈敏度相較于單重PCR均較低，這可能是由于不同引物的特異性不同，存在底物競爭現(xiàn)象會降低體系的靈敏度。

PCR技術(shù)的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)方法中真菌檢測需要經(jīng)過培養(yǎng)的問題，縮短了檢測所需時間，降低了檢測限，使產(chǎn)毒真菌的檢測技術(shù)從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察及生化鑒定邁入了分子生物學(xué)技術(shù)的時代。常規(guī)PCR方法適用于擴(kuò)增較長片段的真菌DNA，也是DNA指紋圖譜方法及DNA條形碼方法中的常用技術(shù)之一，但該方法不能對目標(biāo)真菌實(shí)現(xiàn)定量檢測。

1.2 實(shí)時熒光定量PCR方法

實(shí)時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR)最早是Higuchi等[11]于1993年提出的可以實(shí)現(xiàn)定量的PCR方法，完成PCR技術(shù)從定性到定量的革命性跨越。該技術(shù)的原理是將具有熒光標(biāo)記的核苷酸序列或熒光染料加入到反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，采集這些熒光信號后通過繪制擴(kuò)增曲線即可實(shí)現(xiàn)對PCR反應(yīng)過程的實(shí)時檢測，并且借助建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以實(shí)現(xiàn)對未知樣品的絕對定量或相對定量。

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)不僅簡化了實(shí)驗(yàn)操作流程，縮短PCR反應(yīng)時間，閉管實(shí)驗(yàn)降低氣溶膠污染的風(fēng)險，而且提高了PCR反應(yīng)的特異性和靈敏度。Mylroie等[12]對黃曲霉的rRNA基因間隔區(qū)(IGS)設(shè)計特異性引物，使用SYBR Green染料法的qPCR技術(shù)對人工混合的DNA樣品進(jìn)行定量，定量限(Limit of quantity，LOQ)為2.9 pg·μL-1，相較于普通PCR的LOD，其靈敏度有所提高且實(shí)現(xiàn)了定量檢測。王香君等[13]使用真菌鑒定通用引物對釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉、曲霉進(jìn)行了SYBR Green染料法的qPCR檢測，通過對溶解曲線分析確定0817F/1196R為檢測用引物，建立了單一真菌菌種DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)定量，3種真菌的LOQ約為6.5×10-3pg·μL-1，定量的靈敏度大大提高。Kulik[14]使用TaqMan探針法的單重qPCR方法對鐮刀菌的3ADON、15ADON及NIV3種基因型的Tri12基因進(jìn)行了檢測，確定3種基因型的檢出限分別為20、1、10 pg。

具有多個熒光通道的實(shí)時熒光PCR儀為多重qPCR的建立奠定了基礎(chǔ)，通過設(shè)計合成含有不同熒光標(biāo)記的TaqMan探針可以實(shí)現(xiàn)在單個反應(yīng)體系中進(jìn)行多個片段同時擴(kuò)增的多重qPCR。金燕等[15]根據(jù)真菌rRNA基因序列設(shè)計ASPP、PENP、FUSP 3種特異性探針，將多重qPCR技術(shù)與裸磁珠富集技術(shù)聯(lián)用建立了可對辣椒中曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬3種產(chǎn)毒真菌的快速定量檢測方法，LOD達(dá)到103CFU·g-1，包括DNA提取在內(nèi)的檢測時間縮短至7 h。多重qPCR的檢出限有可能比單重qPCR低，會受反應(yīng)體系使用的引物/探針等因素的影響。Vegi等[16]根據(jù)單端孢霉烯合酶基因(Tri5)、rRNA基因和聚酮化合物合酶基因(Pks)設(shè)計出了3組引物探針，使用多重qPCR技術(shù)開發(fā)了可同時對產(chǎn)真菌毒素的赭曲霉、疣狀青霉(Penicilliumverrucosum)及禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)快速定量的方法，對基因組DNA的最低檢測限達(dá)到3 pg，比Kulik[14]的檢測方法檢出限更低。

qPCR方法適用于擴(kuò)增片段大小為100～300 bp的真菌DNA，并且既可以對真菌的基因組DNA進(jìn)行定量，也可以對真菌菌體數(shù)量進(jìn)行定量。其中，SYBR Green染料法定量較TaqMan探針法成本低，但是該方法存在與非特異擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合產(chǎn)生假陽性的問題，因此不能進(jìn)行多重qPCR體系的建立。

2 基于DNA指紋圖譜技術(shù)的產(chǎn)毒真菌檢測方法

DNA指紋圖譜技術(shù)是利用不同物種DNA水平上的多態(tài)性差異，以現(xiàn)代分子生物學(xué)方法標(biāo)記并建立可以有效鑒定或檢測物種圖譜的技術(shù)[17]。目前，較為常見的DNA指紋圖譜技術(shù)根據(jù)報道時間先后順序主要包括限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism，SSCP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified dragment length polymorphism，AFLP)等。

2.1 RFLP方法

限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)是Botstein等[18]于1980年提出的分子標(biāo)記技術(shù)。其原理通常是使用合適的引物對特定區(qū)域擴(kuò)增后，使用限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，通過與已建立的PCR-RFLP圖譜比對達(dá)到鑒定或檢測的目的。隨著基因測序技術(shù)的普及和發(fā)展，也會將電泳產(chǎn)物純化后測序，結(jié)合序列同源性比對得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。Bisbal等[19]通過對真菌ITS區(qū)域進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增并使用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、NlaⅢ和RsaⅠ對PCR產(chǎn)物酶切后電泳，將電泳圖與4種ITS-RFLP圖譜比對，結(jié)合測序結(jié)果的序列同源性比對完成對132株黑曲霉的分類學(xué)鑒定。王彩虹等[20]通過將RFLP指紋圖譜技術(shù)與真菌ITS基因文庫、測序和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析相結(jié)合，對瀘州老窖高溫大曲和郎酒超高溫大曲的真菌菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，通過使用通用引物ITS1和ITS4對真菌ITS序列擴(kuò)增并通過MspⅠ和HhaⅠ進(jìn)行雙酶切構(gòu)建酶切圖譜，與測序得到的基因文庫片段大小比對分析完成對真菌菌落結(jié)構(gòu)的分析，此外通過ITS文庫法還發(fā)現(xiàn)了Xeromycesbisporus、Thermomucorindicaeseuda-ticae、Trichomonascusciferrii等相關(guān)研究中未曾報道的菌種。Kizis等[21]也使用相同的真菌通用引物對真菌ITS序列進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，并使用HinfⅠ、HhaⅠ、RsaⅠ 3種限制性內(nèi)切酶酶切11種不同的RFLP片段，將124個分離株劃分為4個曲霉菌種，4個分離株劃分為黑曲霉菌株。孫長坡等[22]通過對黃曲霉毒素合成途徑調(diào)控基因aflR及其啟動子序列設(shè)計引物并進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，使用NheⅠ、PvuⅡ、HincⅡ3種限制內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物后電泳，結(jié)合測序結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性及RFLP分析，結(jié)果表明，對aflR啟動子片段的NheⅠ位點(diǎn)分析可判別菌株的產(chǎn)黃曲霉毒素能力，對aflR基因的PvuⅡ和HincⅡ位點(diǎn)分析可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)黃曲霉和寄生曲霉的區(qū)分。根據(jù)ITS序列可以實(shí)現(xiàn)對產(chǎn)毒真菌的分類鑒別，根據(jù)毒力基因可以實(shí)現(xiàn)真菌產(chǎn)毒能力的評價，同時毒力基因也可能具有分類鑒別的功能；RFLP限制性內(nèi)切酶需要根據(jù)真菌ITS序列或毒力基因的酶切位點(diǎn)來選擇。

2.2 SSCP方法

單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)是Orita等[23]于1989年提出的一種單核苷酸鏈多態(tài)性分析技術(shù)，其原理是常規(guī)PCR擴(kuò)增后的特定雙鏈DNA片段經(jīng)變性解旋后變成單鏈，變性后的單鏈核苷酸并不是保持一條直鏈，而是在氫鍵等分子作用力下形成具有一定空間三維構(gòu)象的核苷酸鏈，導(dǎo)致單鏈核苷酸在電泳中具有不同的遷移速度，通過分析在電泳時由于單核苷酸差異所呈現(xiàn)的不同條帶實(shí)現(xiàn)鑒定的目的[24-25]。陳娟等[26]采用基于β-tubulin基因片段的PCR-SSCP技術(shù)檢測藥材六神曲中含有3屬5種真菌，但是基于β-tubulin基因設(shè)計的引物在擴(kuò)增復(fù)雜DNA樣品時存在擴(kuò)增效率低的問題，導(dǎo)致該方法覆蓋面較小。Susca等[27]對鈣調(diào)蛋白基因種特異區(qū)域設(shè)計通用引物SSCPCL1和SSCPCL2，通過對50株曲霉屬真菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，配合高靈敏度特性的毛細(xì)管電泳完成對黑曲霉的檢測，使用SSCP技術(shù)準(zhǔn)確鑒定出屬于16個黑曲霉中的所有39個基因型，說明SSCP在結(jié)合高靈敏度的電泳時,其檢測靈敏度也會大大提高。Dong等[28]使用真菌鑒定通用引物ITS4和ITS5擴(kuò)增目的基因，通過PCR-SSCP技術(shù)結(jié)合低溫時pH可變電泳基質(zhì)的高分辨率特性完成從土壤中分離出尖孢鐮刀菌的鑒定，并進(jìn)行DNA測序、序列同源性比對驗(yàn)證了試驗(yàn)結(jié)果，同時該研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈DNA在變性過程中含有未完全變性的雙鏈DNA，從而形成更加復(fù)雜的構(gòu)象。

2.3 RAPD方法

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)是Williams等[29]和Welsh等[30]提出的一種通過分析隨機(jī)引物經(jīng)PCR擴(kuò)增出的DNA片段多態(tài)性來鑒定物種或探索基因表達(dá)規(guī)律的技術(shù)。其原理是使用人工合成的多條隨機(jī)寡核苷酸(10 nt左右)對基因組DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，通過分析含有不同大小片段的隨機(jī)PCR產(chǎn)物的電泳圖，并與指紋圖譜比對后達(dá)到鑒定或檢測的目的[31]。Khodadadi等[32]通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記確定了產(chǎn)毒性和非產(chǎn)毒性黃曲霉與寄生曲霉之間的遺傳關(guān)系，從開心果中分離出17株黃曲霉和34株寄生曲霉，通過高效液相色譜法測定了其產(chǎn)毒能力，并隨機(jī)選擇6株黃曲霉和13株寄生曲霉，使用5個隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析其多態(tài)性，結(jié)果表明，RAPD技術(shù)雖然無法鑒別產(chǎn)毒性能，但能夠區(qū)分開黃曲霉與寄生曲霉。Fungaro等[33]使用10個隨機(jī)引物擴(kuò)增出95個RAPD位點(diǎn)，與指紋圖譜對比，將25株菌株分為兩組，結(jié)果顯示，RAPD基因型與OTA的產(chǎn)生能力沒有明顯的相關(guān)性，在結(jié)合ITS區(qū)域測序結(jié)果與GenBank提供的數(shù)據(jù)建立了適應(yīng)性更廣泛的系統(tǒng)發(fā)育樹后，不僅能夠完成赭曲霉的檢測，同時也研究了其產(chǎn)毒性能，為赭曲霉的檢測工作奠定了理論基礎(chǔ)。RAPD可以實(shí)現(xiàn)不同真菌的分類，但當(dāng)利用條帶強(qiáng)弱證明菌株之間差異時，很難比較和解釋圖譜。此外，某些產(chǎn)物可能代表擴(kuò)增效率相對低的反應(yīng)，技術(shù)因素的微小變動可能導(dǎo)致不同擴(kuò)增反應(yīng)中特定菌株產(chǎn)生的實(shí)際片段差異很大[34]。

2.4 AFLP方法

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)是Zabeau等[35]以專利的形式發(fā)明并發(fā)展出來的一種DNA多態(tài)性檢測方法，其原理是根據(jù)基因組DNA堿基發(fā)生的插入、缺失、重復(fù)及酶切位點(diǎn)堿基突變等情況，對其進(jìn)行雙酶切產(chǎn)生隨機(jī)大小的片段，通過設(shè)計AFLP的引物序列進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增并進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)電泳，最后在膠塊上會形成不同分子量大小、不同條帶數(shù)指紋圖譜，通過指紋圖譜的比對實(shí)現(xiàn)鑒定或檢測的目的[36]。AFLP技術(shù)是在RFLP技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行的優(yōu)化與改進(jìn)，提高了試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。Schmidt等[37]從食品中分離出70株真菌并進(jìn)行了分類學(xué)及產(chǎn)毒能力鑒定，使用pre-EcoRⅠ primer、pre-MseⅠ primer、pre-BfaⅠ primer 3條AFLP引物對其基因組DNA進(jìn)行了常規(guī)PCR擴(kuò)增并對赭曲霉AFLP圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)合基因測序技術(shù)對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，最終建立了一套適用于赭曲霉鑒定的AFLP方法，相較于Kizis等[21]的黑曲霉鑒定的RFLP方法，其試驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性更好。Botton等[38]對兩株炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)進(jìn)行RNA提取并反轉(zhuǎn)錄出雙鏈cDNA，使用AFLP技術(shù)對雙鏈cDNA酶切后進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，分析試驗(yàn)結(jié)果中119個OTA生物合成及調(diào)節(jié)的差異表達(dá)基因的PAGE條帶指紋圖譜，結(jié)合從電泳條帶純化出的DNA測序結(jié)果分析，為產(chǎn)OTA真菌的檢測提供了一套方法，相較于Fungaro等[33]針對赭曲霉產(chǎn)毒性能的RAPD研究方法，其試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性更好。

總之，不同DNA指紋圖譜方法具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，RFLP方法可以實(shí)現(xiàn)對產(chǎn)毒真菌的檢測但靈敏度較低；SSCP方法適用于高通量食品樣本的篩查，對DNA樣品要求不高；RAPD方法不需要專門設(shè)計引物即可進(jìn)行檢測，適用于未知真菌序列的樣品檢測；AFLP方法相較于RFLP酶切的目的性更強(qiáng)，電泳分辨率更高，可用于構(gòu)建真菌基因組高密度連鎖圖譜，適用于產(chǎn)毒真菌單一菌種的檢測。但是，目前真菌DNA指紋圖譜檢測方法在產(chǎn)毒真菌檢測中存在的問題是沒有完整的指紋圖譜庫，不同實(shí)驗(yàn)室之間很難進(jìn)行比較。

3 基于DNA條形碼技術(shù)的產(chǎn)毒真菌檢測方法

DNA條形碼技術(shù)(DNA barcode)是Hebert等[39]于2003年提出的一種使用常規(guī)PCR技術(shù)及基因測序技術(shù)，利用短DNA片段進(jìn)行物種鑒定或檢測的技術(shù)。其中，短DNA片段通常是在物種中具有一定保守性的序列，比如線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(mitochondrial gene cytochrome coxidase I，COI)的特定DNA片段可以完成動物界中除刺胞動物門外的物種鑒定；葉綠體核糖激酶1，5-二磷酸羧化酶基因(ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase，rbcL)和蛋白成熟酶K基因(maturase K，matK)以及核基因片段(internal transcribed spacer，ITS)可完成植物界的物種鑒定[40-41]等。

DNA條形碼技術(shù)在真菌鑒定時是將ITS確定為真菌的通用條形碼[42]，配合其基因組其他DNA序列實(shí)現(xiàn)對真菌的分類學(xué)鑒定或者產(chǎn)毒性能檢測[43]。DNA條形碼在生物物種鑒定方面逐漸得到了廣泛應(yīng)用。如Geiser等[44]結(jié)合β-tubulin(微管蛋白基因)、CAL(鈣調(diào)蛋白基因)實(shí)現(xiàn)對曲霉屬的分類學(xué)鑒定；Seifert等[45]使用COI基因?qū)崿F(xiàn)對青霉亞屬的鑒定；Panelli等[46]擴(kuò)增包括核糖體ITS1、ITS2和26SrRNA基因的D1/D2區(qū)域和非核糖體的β-tubulin、EF-1α基因的DNA條碼，通過基因測序及序列比對，鑒定出了3株尖孢枝孢菌屬(Cladosporiumoxysporum)的真菌及2株新菌種。Chen等[47]在Seifert研究的基礎(chǔ)上研制了COX1條碼寡核苷酸陣列，實(shí)現(xiàn)了對青霉亞屬真菌的高通量檢測，但是由于真菌種類復(fù)雜，其青霉亞屬之間的COX1基因序列相似性很高，導(dǎo)致容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，需要更多的實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化此檢測方法。

DNA條碼的選取是真菌分類鑒定的關(guān)鍵，由于目前在研究真菌的DNA條碼時不能做到全部取樣，僅用幾個代表屬種來驗(yàn)證此條碼，具有一定的不合理性[48]。運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對真菌進(jìn)行鑒別時，重點(diǎn)在于真菌種間和種內(nèi)差異的界定，對于一些半知菌而言，無法明確其分類學(xué)地位，在應(yīng)用該技術(shù)對半知菌進(jìn)行鑒別時會有一定困難。隨著DNA條碼技術(shù)及真菌分類學(xué)的發(fā)展，對真菌種水平以下細(xì)分化的DNA條碼也許會在實(shí)現(xiàn)真菌分類的同時,能預(yù)測其產(chǎn)毒性能。

4 展望

基于核酸的產(chǎn)毒真菌檢測方法使用的技術(shù)雖然不同，但其原理相通，通常使用通用引物結(jié)合毒力基因或生化合成途徑關(guān)鍵調(diào)控基因的特異性引物可實(shí)現(xiàn)對真菌分類及產(chǎn)毒性能鑒別。其中，真菌分類鑒定通用引物所選取的區(qū)域通常是多拷貝的核糖體DNA(rDNA)，包括18S小亞基單元、ITS1區(qū)、5.8S區(qū)、ITS2區(qū)和大亞基單元28S的序列[49]，并且不同產(chǎn)毒真菌可能攜帶相同或不同的毒力基因[50]。因此可以在毒力基因上提高檢測的特異性，當(dāng)對一種產(chǎn)毒真菌的多個毒力基因同時鑒別時，其鑒別特異性越強(qiáng)，檢測結(jié)果越可靠。例如我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582—2010中對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的檢測使用ITS序列引物結(jié)合黃曲霉毒素調(diào)節(jié)基因aflR、柄曲霉素轉(zhuǎn)甲氧基酶基因omt-1、雜色曲霉素A脫氫酶基因ver-13種基因，實(shí)現(xiàn)了對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的高特異性檢測。

隨著核酸技術(shù)的快速革新，其在食品中產(chǎn)毒真菌鑒定的應(yīng)用上也發(fā)生著日新月異的變化，對真菌的鑒定也變得更加多元化。目前，核酸檢測方法在產(chǎn)毒真菌方法檢測中存在的技術(shù)難點(diǎn)是：在真菌污染食品的早期潛藏的菌體量非常少，需要對真菌進(jìn)行富集，對核酸提取的方法要求高，否則達(dá)不到核酸檢測方法的最低檢測限，導(dǎo)致無法實(shí)現(xiàn)檢測。數(shù)字PCR技術(shù)(digital PCR，dPCR)是[51]在常規(guī)PCR技術(shù)和qPCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第三代PCR技術(shù)，其原理是通過一種技術(shù)方案將帶有熒光探針的PCR反應(yīng)體系稀釋至單分子水平，并分配到幾十至上千萬個單元再進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，最后通過對熒光單元進(jìn)行讀取計數(shù)分析計算，從而實(shí)現(xiàn)對樣品拷貝數(shù)的絕對定量。數(shù)字PCR的技術(shù)方案主要分為微孔式、微腔式、微滴式等。其中，微滴式數(shù)字PCR技術(shù)(droplet digital PCR, ddPCR)以操作較簡便、成本較低的優(yōu)勢得到了更廣泛的應(yīng)用[52]。ddPCR目前在微生物檢測、肉制品摻假成分檢測、產(chǎn)前診斷等領(lǐng)域取得了很大的進(jìn)展，由于DNA被稀釋成單分子并在單個反應(yīng)室內(nèi)進(jìn)行，所以ddPCR具有很高的靈敏度并且可以降低復(fù)雜食品基質(zhì)抑制因子的干擾，能夠滿足微生物快檢的快速、高通量的要求，未來在產(chǎn)毒真菌快速檢測中會有巨大的發(fā)展前景。