呂鵬輝, 張震東, 王曄, 周吉紅, 宋振偉, 段留生, 李潤枝*

(1.北京農(nóng)學院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室, 植物生產(chǎn)國家級實驗教學示范中心, 北京 102206; 2.北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 100029; 3.中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081)

紅三葉(TrifoliumpretenseL.)又叫紅車軸草、紅荷蘭翹搖，屬于豆科(Leguminosae)車軸草屬(TrifoliumL.)，多年生草本，是車軸草屬的最重要物種之一[1]。紅三葉植株具有豐富的營養(yǎng)價值，且生長迅速，有固氮改良土壤的作用，是最重要的栽培豆科牧草之一，普遍用作綠地植物、水土保持植物、藥用植物和優(yōu)質(zhì)牧草[2]。

種子活力是指在田間廣泛條件下，種子迅速整齊出苗和長成正常幼苗潛力的總稱[3]。高活力種子出苗率高、耐貯性強、幼苗健壯整齊、抗逆性強、生物產(chǎn)量高，而低活力種子易造成減產(chǎn)。在種子發(fā)育過程中，隨著種子的成熟，種皮呈現(xiàn)不同的顏色，即種子的顏色可以反映出種子成熟度的差異[4]。孫德利等[5]研究發(fā)現(xiàn)，不同成熟度的苦瓜種子與果實、假種皮顏色變化密切聯(lián)系，在生產(chǎn)上可將瓜皮顏色、假種皮顏色作為種子成熟度的估測指標。同時，很多研究顯示，種子成熟度與種子活力密切相關(guān)。張曉潔等[6]測定了黑褐色、黃褐色、紅色、白色4種不同成熟度棉花種子的活力，結(jié)果顯示黑褐色和黃褐色種子的發(fā)芽率較高；常暉等[7]研究表明，黃芪種子種皮顏色越深、種子越大，種子活力就越高；李賀勤等[8]依據(jù)種子大小和顏色對甘藍種子進行分級加工，結(jié)果表明種子大小和顏色分級能有效提高甘藍種子質(zhì)量，且存在種皮顏色越深種子活力就越高的變化趨勢。

目前，我國在紅三葉生產(chǎn)利用中還存在很多問題，如持久性較弱、再生性差、抗旱抗寒性差、成熟種子易脫落、不可機械收割等[9]。特別是紅三葉在生長過程中由于開花期較長，收獲時同一植株上種子成熟度不一致，種皮呈現(xiàn)黃色、黃綠色、黃褐色、黃紫色等不同顏色，同一種批中種子活力參差不齊，導致種子質(zhì)量不高，是生產(chǎn)中比較突出的問題[10]。張元科[11]對蒙農(nóng)1號紅三葉種子特征的研究表明，紅三葉種子顏色存在多種類型，其中黃色種子出現(xiàn)頻率最大，種子整體顏色在黃色和黃褐色之間。但是對于不同顏色紅三葉種子的活力研究，尚未見報道。因此，本研究以同一紅三葉種批中不同顏色種子為材料，通過常溫發(fā)芽試驗、低溫發(fā)芽試驗、干旱發(fā)芽試驗及種子生理指標測定，研究不同顏色種子的活力差異，明確種子成熟度與種子活力的關(guān)系，為紅三葉種子的清選加工和適期收獲提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用紅三葉種子為試驗材料，將同一批次種子按照顏色分為黃色種子(yellow seed,YS)、黃褐色種子(yellow-brown seed,HS)和褐色種子(brown seed,RS)，與三種顏色的混色種子(mix-color seed,MS)一同進行試驗(圖1)。所用種子來自淘寶北槿園藝官方店。

圖1 不同顏色的紅三葉種子

1.2 試驗設(shè)計與方法

1.2.1種子萌發(fā)試驗 為了更加全面評價不同顏色紅三葉種子的種子活力情況，設(shè)置常溫發(fā)芽、低溫發(fā)芽和干旱發(fā)芽3個種子萌發(fā)試驗。根據(jù)預試驗的結(jié)果設(shè)置種子發(fā)芽試驗的觀察時間為10 d。因而，常溫發(fā)芽試驗的條件設(shè)置為20 ℃培養(yǎng)10 d；低溫發(fā)芽試驗條件設(shè)置為4 ℃培養(yǎng)10 d，后轉(zhuǎn)入20 ℃培養(yǎng)10 d；干旱發(fā)芽試驗為用10%PEG-6000溶液作為培養(yǎng)試劑，其他同常溫發(fā)芽試驗。用1%次氯酸鈉溶液對紅三葉種子消毒10 min，用蒸餾水反復沖洗3遍。在發(fā)芽盒(12 cm×12 cm×6 cm)中放置兩層濾紙，用去離子水潤濕，將消毒的紅三葉種子隨機選取100粒，擺放到發(fā)芽盒中，3次重復。放置到相應(yīng)萌發(fā)條件，每天記錄發(fā)芽種子數(shù)，發(fā)芽結(jié)束后測定各項發(fā)芽指標。發(fā)芽試驗均在PRX-6WB光照培養(yǎng)箱(寧波賽福實驗儀器有限公司)中進行，24 h光照，光強8 000 lx。

發(fā)芽勢(germination energy，GE)、發(fā)芽率(germination percentage，GP)、發(fā)芽指數(shù)(germination index，GI)和平均發(fā)芽天數(shù)(mean germination time，MGT)按照以下公式進行計算。

GE=規(guī)定天數(shù)發(fā)芽數(shù)/種子總粒數(shù)×100%

(1)

GP=末次計數(shù)發(fā)芽數(shù)/種子總粒數(shù)×100%

(2)

GI=∑(Gt/Dt)

(3)

MGT=∑(Gt×Dt)/∑Gt

(4)

式中，規(guī)定天數(shù)取4 d,Dt指第t天，Gt指Dt相對應(yīng)的發(fā)芽種子數(shù)。

1.2.2種子電導率測定 隨機選取100粒種子，用JA2003天平[邦西儀器科技(上海)有限公司]稱重后將種子放入裝有50 mL水的燒杯中，薄膜覆蓋后放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用DDS-307A電導率儀(上海儀電科學儀器股份有限公司)測定電導率[12]，3次重復。

電導率(μS·cm-1·g-1)=樣品值/樣品種子重量

(5)

1.2.3種子OD值測定 將種子放入燒杯，加入50 mL去離子水，放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以純水作為對照，分別浸種4、8、12、24 h時，用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(上海析譜儀器有限公司)測定286 nm吸收波長的光密度[13]，3次重復。

1.3 種子活力的綜合評價

用模糊數(shù)學隸屬法[14]對4種顏色紅三葉種子進行綜合評價，在計算隸屬值時，先將數(shù)據(jù)標準化處理，然后計算每個指標的隸屬函數(shù)值[u(Xj)]、標準差系數(shù)(Vj)、權(quán)重系數(shù)(Wj)和綜合隸屬函數(shù)值(D)。

u(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(6)

u(Xj)=(Xmax-Xj)/(Xmax-Xmin)

(7)

(8)

(9)

(10)

若指標與種子活力呈正相關(guān)，用公式(5)進行計算，否則用公式(6)進行計算。D值越大，種子活力越高；D值越小，種子活力越低。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Excel 2010對所測定的數(shù)據(jù)進行初步整理，然后再用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。選擇LSD差異法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同顏色紅三葉的種子萌發(fā)指標

由表1可知，在常溫發(fā)芽試驗中，紅三葉黃色種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著高于其他3種顏色的種子(P<0.05)，分別為79%、89%和32.0，而黃褐色種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著低于其他3種顏色的種子(P<0.05)。黃色種子、黃褐色種子、褐色種子、混色種子的平均發(fā)芽天數(shù)分別為3.1、3.9、3.4和3.4 d，其中黃褐色種子的平均發(fā)芽天數(shù)顯著高于其他3種顏色的種子(P<0.05)。在低溫發(fā)芽試驗中，黃色和褐色種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)無顯著差異，均較大，且顯著高于黃褐色種子的相應(yīng)指標(P<0.05)。黃褐色種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)顯著低于其他3種顏色的種子(P<0.05)。黃色種子的平均發(fā)芽天數(shù)顯著低于混色種子，與黃褐色和褐色種子差異不顯著。在干旱發(fā)芽試驗中，黃色種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)最高且顯著高于其他3種顏色種子，而黃褐色種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著低于其他3種顏色種子(P<0.05)。黃色種子的發(fā)芽天數(shù)最少，但是與褐色和混色種子差異不顯著，而黃褐色種子的發(fā)芽天數(shù)顯著高于其他3種顏色種子(P<0.05)。綜上可知，在常溫發(fā)芽、低溫發(fā)芽和干旱發(fā)芽試驗中，黃色種子的發(fā)芽能力均顯著高于其他3種顏色種子，種子活力最高。

表1 不同顏色紅三葉的種子萌發(fā)指標

2.2 不同顏色紅三葉種子萌發(fā)指標的相關(guān)性分析

種子活力可以通過不同條件的萌發(fā)試驗來進行評價，而不同萌發(fā)指標是否存在相關(guān)性是綜合評價的基礎(chǔ)。由表2可知，常溫發(fā)芽的發(fā)芽勢與干旱發(fā)芽的發(fā)芽勢呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.999，與干旱發(fā)芽的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為0.970和0.983；常溫發(fā)芽的發(fā)芽率與干旱發(fā)芽的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.999；常溫發(fā)芽的發(fā)芽率與低溫發(fā)芽的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)以及干旱發(fā)芽勢呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；常溫發(fā)芽的發(fā)芽指數(shù)與干旱發(fā)芽的發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；常溫發(fā)芽的發(fā)芽天數(shù)與干旱發(fā)芽的發(fā)芽勢呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與干旱發(fā)芽的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.997、-0.961、-0.975。由此可見，各萌發(fā)指標間存在不同程度的相關(guān)性，因此通過綜合鑒定可以降低誤差，提高活力評價的準確性。

表2 不同顏色紅三葉種子萌發(fā)指標的相關(guān)性分析

2.3 不同顏色紅三葉種子浸出液的OD值和電導率

紫外分光光度計測定紅三葉種子浸泡4、8、12、24 h的OD值，結(jié)果見表3，可見，隨著浸泡時間的延長，種子浸出液的OD值不斷增加，在24 h時達到最大值。為了進一步確定浸出液OD值和發(fā)芽率之間的關(guān)系，對種子浸出液OD值和常溫發(fā)芽率進行回歸分析，得到回歸方程，分別為y=-0.101 8x+0.339 3，R2=0.672 5(浸泡4 h)；y=-0.113 2x+0.443 3，R2=0.385 9(浸泡8 h)；y=-0.332 4x+0.726 0，R2=0.845 1(浸泡12 h)；y=-0.611 0x+1.095 9，R2=0.929 1(浸泡24 h)。由回歸方程得出，不同浸泡時間的浸出液OD值與紅三葉種子萌發(fā)率存在負相關(guān)關(guān)系，即浸出液OD值越低，種子發(fā)芽率越高。其中浸泡24 h的浸出液的OD值與發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)最高，R2=0.929 1，說明在本研究條件下，紅三葉種子浸泡24 h時浸出液的OD值能較好地反映紅三葉種子的活力。

表3 不同顏色紅三葉種子的電導率和OD值

不同顏色紅三葉種子浸泡24 h后，黃褐色種子的OD值最高，為0.80；黃色種子的最低，為0.53，且二者差異顯著。黃褐色種子的電導率也最高的，為428.2，且顯著高于其他顏色種子；黃色、褐色和混色種子的電導率差異不顯著。因此，本研究結(jié)果說明黃褐色種子的活力最低。

2.4 不同顏色紅三葉種子活力的綜合評價

隸屬函數(shù)分析結(jié)果(表4)顯示，黃色種子的D值最大，為0.913，黃褐色種子的D值最小，為0.002，表明黃色種子的活力最高，黃褐色種子的活力最低。4種不同顏色紅三葉種子的活力順序依次為：黃色種子>褐色種子>混色種子>黃褐色種子。

表4 不同顏色紅三葉種子檢測指標的綜合評價分析

3 討論

種子劣變和生理紊亂引起的細胞膜完整性變化是造成種子活力差異的關(guān)鍵因素，種子活力越高，種子浸出液的OD值和電導率越低[15]。魯黎明等[13]研究表明, 在25 ℃條件下, 煙草種子經(jīng)過24 h浸泡后, 種子浸出液的紫外吸光值能夠在較大程度上反映煙草種子的活力，且與之呈負相關(guān)關(guān)系。Dias等[16]研究發(fā)現(xiàn)，大豆種子浸泡8和12 h的電導率可以用于檢測大部分種子活力的差異，16、20和24 h浸泡液的電導率則可以用于檢測種子活力差異小的種子批。本研究發(fā)現(xiàn)，紅三葉種子浸泡24 h后的電導率能較好地反映種子活力。Mavi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，9個不同品種蘿卜種子的標準發(fā)芽率與電導率值呈顯著負相關(guān)關(guān)系，與本研究結(jié)果一致。

隨著種子成熟度逐步提高，種子的種皮顏色也越來越深，生長在母株不同部位的種子由于其接收的營養(yǎng)和成熟期的不同，收獲時同一種批中也存在不同顏色的種子，其活力之間也有差異。王廣印等[18]將同一蕹菜種批按照種子顏色分為三級，然后測定其種子活力，發(fā)現(xiàn)不同顏色種子的活力存在極顯著差異，種子顏色越深其活力越高。李錫香和胡淼[19]研究表明，深褐色紅菜苔種子的發(fā)芽勢、簡化活力指數(shù)、發(fā)芽率均顯著高于深白色和灰褐色種子。董青松等[20]在廣金錢草種子顏色與發(fā)芽率相關(guān)性研究中表明，黃色種子的發(fā)芽率顯著高于其他顏色，同時在儲藏過程中，隨著種皮顏色的變淺，種子活力也隨之降低。由于紅三葉的開花期不一致，收獲時同一種批包含不同種子成熟度的顏色各異的種子。本研究通過常溫、低溫和干旱發(fā)芽試驗比較同一紅三葉種子批中不同顏色種子的萌發(fā)指標，結(jié)果表明，紅三葉黃色種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)明顯高于其他顏色，而發(fā)芽天數(shù)小于其他顏色種子，同時黃色種子浸出液的電導率和OD值也最低。黃褐色種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)明顯低于其他顏色，而發(fā)芽天數(shù)大于其他顏色種子。說明不同顏色紅三葉種子的活力存在差異，即種子成熟度與種子活力密切相關(guān)，這與上述其他植物的研究結(jié)果一致。通過模糊隸屬函數(shù)法綜合評價4種不同顏色的紅三葉種子活力，結(jié)果排序為黃色種子>褐色種子>混色種子>黃褐色種子，本研究結(jié)果為紅三葉種子的清選加工和適期收獲提供了理論參考。