郝靜然,王少峽

(天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院,天津 301600)

規(guī)律間隔成簇短回文重復序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)基因編輯技術(shù)是目前逐漸興起的一種基因編輯手段,因其操作便捷、簡單、快速、精準等特點而在醫(yī)學研究領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展,獲得了眾多研究者的青睞。2012年,Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna發(fā)表了一篇關(guān)于細菌可以利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來沉默外源入侵的核酸的文章,并對該機制進行了研究,其研究結(jié)果顯示出該項技術(shù)在基因編輯方面的潛力,二人也因該項研究于2020年被授予諾貝爾化學獎[1]。本世紀初以來,針對CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的研究逐漸興起,吸引了生物界、醫(yī)學界等眾多科學家們的目光,在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,包括基因敲除、基因編輯、基因組篩選等各種基因編輯方向。本文將對此做一簡要綜述。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)概述

CRISPR/Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御,可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過將入侵噬菌體和質(zhì)粒DNA的片段整合到CRISPR中,并利用相應(yīng)的RNA酶來指導同源序列的降解,從而達到對自身的保護性。研究表明,CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)的構(gòu)成有內(nèi)切核酸酶-Cas9和指導RNA-gRNA兩個部分。根據(jù)CRISPR-Cas位點的不同,可將CRISPR系統(tǒng)分為六種不同的類型,而我們常用的是II型CRISPR系統(tǒng)即CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng),它可以利用單個內(nèi)切核酸酶-Cas9斷裂外源雙鏈DNA。CRISPR位點上有三個功能區(qū)—反向轉(zhuǎn)錄的特異性非編碼RNA(trancrRNA)區(qū)、不同cas基因區(qū)以及CRISPR array區(qū),三者呈線性排列于一條DNA鏈上[2]。其中Cas區(qū)用來指導切割DNA序列的核酸酶的形成,CRISPR array區(qū)包含repeat序列和spacer序列,外源基因入侵時就會插入spacer序列進行轉(zhuǎn)錄。其抵抗外源DNA入侵的分子機制是：當某病毒首次感染細菌時,來自病毒的基因組的一個片段會整合到該細菌的CRISPR/Cas9的間隔區(qū)；當同一病毒再次感染該細菌時,細菌中已整合外源基因的CRISPR基因?qū)D(zhuǎn)錄形成一種pre-crRNA,pre-crRNA經(jīng)過一系列的加工處理可以形成含有與外源基因相匹配序列的crRNA,此crRNA可識別該病毒基因組的同源序列,然后介導Cas蛋白定向到病毒基因組的互補區(qū)合并切割相應(yīng)DNA片段,以保護自身免遭入侵[3]。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于疾病機制研究近來CRISPR/Cas9技術(shù)在疾病機制研究中成功報道越來越多。研究發(fā)現(xiàn),運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在HepG2肝癌細胞系中構(gòu)建GSTZ1基因敲除模型,可以探索其對肝癌細胞生長遷移的影響。實驗使用慢病毒包裝質(zhì)粒和已含有靶向sgRNA的LentiCRISPR-V2載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,得到包裝好的慢病毒后再用以感染HepG2細胞,證得GSTZ1基因缺失會明顯促進肝癌細胞的遷移和增殖能力,這提示GSTZ1基因可能是肝癌細胞的抑癌基因,參與調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展[4]。有研究者利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功敲除人源結(jié)腸癌細胞SAM-HD1基因,實驗表明該基因缺失后,結(jié)腸癌細胞的增殖能力顯著增強,且能抵抗DNA損傷,這不僅有利于人們對結(jié)腸癌進行更深入的研究還有助于探究SAM-HD1基因在其他腫瘤中的作用[5]。為探討親環(huán)素A(CyPA)對于肺癌細胞放射增敏的作用,有實驗采用CRISPR/Cas9技術(shù),建立CyPA基因敲除的肺腺癌H1975疾病細胞模型,加入中藥扶正增效湯,建立四組實驗,最終得出扶正增效湯可能是通過降低CyPA的表達來抑制肺癌細胞的生長存活[6]。也有文獻報道可以利用CRISPR/Cas9-SAM系統(tǒng)構(gòu)建CHD5基因過表達慢病毒載體,用其感染T24細胞后證得細胞內(nèi)的CHD5基因的mRNA和蛋白的表達均有增加,并且分析得出CHD5基因?qū)τ诎螂装┘毎纳L有一定的影響作用[7]。同時,CRISPR/Cas9系統(tǒng)還可以被應(yīng)用在探究先天性心臟病以及針對HIV、皰疹病毒、人乳頭瘤病毒等可能引發(fā)病毒感染性疾病的研究中[8-9]。

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于建立動物疾病模型和篩選新藥建立動物模型是新藥研發(fā)的基礎(chǔ),由于傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)的諸多不便,CRISPR/Cas9技術(shù)越來越多的被用于動物模型的建立,該技術(shù)不僅具有合成設(shè)計簡便、遺傳穩(wěn)定、高效率耗時短等優(yōu)點,還可以對細胞內(nèi)的多個基因同時進行編輯,建立出與人類疾病相似的動物模型,上述優(yōu)點讓我們看到了該技術(shù)的巨大應(yīng)用潛力。近日有實驗為研究Slc20a2基因是否與原發(fā)性家族性腦鈣化病的發(fā)病機制有關(guān),利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)聯(lián)合Cre-LoxP系統(tǒng)構(gòu)建了敲除紋狀體Slc20a2基因的小鼠模型,該組織特異性基因敲除解決了全身性基因敲除可能會導致的胎兒生長受限問題,從而為之后研究該病的發(fā)病機制和針對該病治療藥物藥物的研究提供了更好的動物模型[10]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)還可以被應(yīng)用在心血管領(lǐng)域的研究中,2017年Chia-Wei Chang等在CRISPR/Cas9技術(shù)的介導下建立了人胚胎干細胞FHL2基因敲除細胞系,為心肌病研究與藥物篩選提供了疾病細胞模型[11]。細胞色素P450 2J2(CYP2J2)酶是體內(nèi)重要代謝酶之一,但尚無用于研究藥物代謝和藥代動力學的CYP2J基因敲除大鼠模型,2020年9月有實驗成功建立了敲除人CYP2J2的直系同源基因大鼠CYP2J3 / 10的動物模型,能夠為研究CYP2J在藥物代謝和心血管疾病中的功能提供有用幫助[12]。為探究Sprr2f基因在腎損傷中的作用,Kieu My Huynh團隊使用CRISPR-Cas9技術(shù)建立Sprr2f基因敲除(Sprr2f-KO)小鼠模型,研究結(jié)果表明Sprr2f基因起一定的腎臟保護作用,給此后針對腎臟用藥的藥物篩選提供了理論基礎(chǔ)[13],這些動物模型的建立為新藥的研發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。

2.3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于治療近年來,隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新與完善,研究者們越來越多將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于疾病的治療。目前已有研究發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對巨噬細胞進行改造,當巨噬細胞和其前體單核細胞中出現(xiàn)特異性Cas9蛋白時,再將靶向Ntn1的gRNA(sgNtn1)構(gòu)入質(zhì)粒中以敲除巨噬細胞和其前體單核細胞中的Ntn1,可以使其編碼蛋白含量下降從而達到緩解Ⅱ型糖尿病的癥狀的目的[14]。還有研究者發(fā)明了一種Cas9/RecA技術(shù),通過提高CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)HDR途徑的效率來治療視網(wǎng)膜色素變性,實驗研究表明,視網(wǎng)膜色素變性實驗小鼠的視力得到了一定程度的修復,該研究為治療由于單基因突變而引起的眼盲提供了新的臨床治療方向[15]。近來,德國學者Theresa Kaeuferle[16],通過CRISPR/Cas9介導敲除了T細胞內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體,獲得了抗糖皮質(zhì)素的病毒特異性T細胞,為正在接受糖皮質(zhì)激素治療的移植后病毒感染患者提供了治療選擇。2020年4月27日,盧鈾團隊在Nature Medicine雜志上發(fā)表了CRISPR基因編輯PD-1細胞治療非小細胞肺癌臨床研究成果,該成果表明靶向PD-1的CRISPR基因編輯T細胞回輸肺癌患者體內(nèi)用于治療肺癌具有安全性及可行性,該實驗為全球首個CRISPR人體試驗[17]。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的潛在不足

盡管CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因其簡便、快捷,而被廣泛應(yīng)用在各領(lǐng)域的研究中,但是該技術(shù)仍存在一些不足之處,許多文獻表明脫靶現(xiàn)象是其最主要的問題。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)特異性識別功能決定于sgRNA上的識別序列,然而,當研究者基于這一特性做出基因編輯時,所得的基因編輯產(chǎn)物除對特定的基因識別外,也會同其他與特定基因堿基片段相差不大的DNA片段結(jié)合而發(fā)生錯配現(xiàn)象,也就是在真核生物復雜的基因組中,經(jīng)改造的sgRNA的識別序列可能會與不是靶點的DNA序列發(fā)生結(jié)合,即脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。為了降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生,研究者們廣泛開展了對于Cas9蛋白和sgRNA修飾的研究,修飾后得到的Cas9蛋白和sgRNA能夠增加一定的穩(wěn)定性[18]。此外,2018年,南方科技大學副教授賀建奎利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對嬰兒進行基因編輯,使其成為能夠天然抵抗艾滋病病毒的嬰兒一事一經(jīng)發(fā)生便得到了社會各界譴責,這很明顯會為人類社會的發(fā)展帶來很大的威脅,其引發(fā)的倫理問題值得我們思考[19]。

4 總結(jié)與展望

從近年來針對于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的各項研究報道、各類文獻中我們不難發(fā)現(xiàn),該項技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展將很有可能幫助人們更深入地了解疾病的發(fā)病機制,為靶向治療提供更多的方向。并且在提倡精準醫(yī)療、個體化醫(yī)療的現(xiàn)今社會中,該技術(shù)的發(fā)展也能夠更好的推動這類醫(yī)療的實施,從而解決臨床治療的一系列難題。相較于傳統(tǒng)基因編輯技術(shù),CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在建立動物模型方面也已經(jīng)凸顯出很大優(yōu)勢,該項技術(shù)的應(yīng)用能夠確保疾病動物模型準確省時的建立,為新藥的研發(fā)與藥物作用機制的研究提供了極大便利。另外,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展也可以為中藥湯劑的多靶向性作用機制的研究提供更好的方法,并且該技術(shù)還可被考慮用于中藥優(yōu)良品種培育和鑒定、分析、改造方面[20],這不僅給醫(yī)藥領(lǐng)域帶來了新的希望,也為人類與疾病的抗爭提供了新的方向。

雖然CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)仍然面對著很多挑戰(zhàn),如脫靶現(xiàn)象的存在以及現(xiàn)實中存在的倫理問題,都提示我們一定要安全規(guī)范的使用這一技術(shù)并且應(yīng)該著重于優(yōu)化該項技術(shù),使其能夠更好的服務(wù)于科學研究。