沈文祥，蔣 威，馬曉宇，楊 潔，武小虎，呂亞楠，王勝義，丁學智，嚴作廷*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2.內蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院，呼和浩特 010018）

中性粒細胞是動物外周血中最豐富的先天免疫效應細胞，在血液循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫監(jiān)視的作用。當機體受到外來入侵時，中性粒細胞迅速募集至感染部位。首先，吞噬內化病原微生物至胞內的吞噬體中，同時胞內的顆?？咕鞍妆粋鬟f到吞噬體中殺傷病原；其次，胞內具有殺菌作用的顆粒蛋白釋放到胞外中和病原微生物；當病原太大無法被吞噬或通過進入細胞質逃避吞噬作用時，中性粒細胞會啟動第三種模式——即中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NET）殺傷病原［1－2］。此外B.G.Yipp等［3］認為，細菌在被PMN吞噬后可能將未被完全殺傷的細菌釋放到胞外，NET還可以防止這些未被完全殺死細菌的擴散。NET是一種細胞外的網(wǎng)狀結構，以DNA為骨架，其上附有組蛋白、顆粒蛋白和細胞質蛋白。當刺激物不同時產(chǎn)生的抗菌蛋白種類數(shù)量不同，如佛波酯（phorbol 12－myristate 13－acetate，PMA）刺激中性粒細胞產(chǎn)生的NET包含24種蛋白，不同的銅綠假單胞菌黏液和非黏液菌株可誘導形成包含33種不同蛋白和多達50種不同蛋白的NET［4］。主要抗菌效應蛋白是來自細胞核的蛋白（組蛋白、HMGB1）和顆粒蛋白酶［如彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、鈣網(wǎng)蛋白－G和蛋白酶－3］，以及髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等。這些蛋白具有強大的殺傷病原微生物的作用。研究發(fā)現(xiàn)NET上的NE會特異性切割福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和小腸結腸炎耶爾森氏菌的毒力因子［5－6］。NET包含的組織蛋白酶G和蛋白酶3與NE密切相關，并可能裂解不同種類病原體的毒力因子［7］。但是，NET不僅可以殺傷病原微生物，同時對感染組織周邊的健康組織發(fā)起攻擊，如果調節(jié)異常，NET可能會導致免疫相關疾病的發(fā)生。Chen L.等［8］研究發(fā)現(xiàn)，NET在敗血癥中可增強炎癥反應，誘導正常的細胞發(fā)生焦亡。此外，最近F.P.Veras等［9］報道，SARSCoV－2可以觸發(fā)PMN釋放NET，引起肺上皮細胞死亡，暗示靶向抑制NET釋放可能是治療新冠肺炎的潛在靶點。

1 中性粒細胞在免疫系統(tǒng)中的作用

中性粒細胞也稱多形核中性粒細胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）或粒細胞，是動物機體中最豐富的白細胞。粒細胞和／或粒細胞前體通常占骨髓和血流中有核細胞的60%［10］。成熟的中性粒細胞在血液中的典型循環(huán)半衰期為6～8 h，在組織中遷移2～3 d。它們的壽命相對較短，主要用于監(jiān)視入侵的微生物。在感染期間，嗜中性粒細胞的壽命延長，粒細胞增多，并且大量嗜中性粒細胞迅速募集到感染部位。在微生物被識別和吞噬之后，中性粒細胞利用一組特殊的氧依賴和氧不依賴的殺菌劑武器來摧毀感染因子［2］。氧依賴機制包括活性氧（ROS）的產(chǎn)生，而氧不依賴機制包括裂解酶和殺菌肽的脫粒和釋放［6］。此外，中性粒細胞還可以產(chǎn)生NET固定殺滅中性粒細胞不能吞噬或可以逃避脫粒釋放的殺菌肽的病原。由于這些過程在殺死大多數(shù)攝入的微生物方面非常有效，中性粒細胞承擔了抵御感染的主要細胞防御任務。

2 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)形成

2.1 NET形成的機制

目前已經(jīng)描述了兩種NET形成機制，即通過緩慢的（120～240 min）裂解細胞死亡機制和從活細胞中快速（5～60 min）釋放NET［11］。第一種是稱為自殺性NET形成（suicidal NETosis）的細胞死亡途徑，它始于細胞核的去分葉化和核膜的解體，持續(xù)到細胞極化喪失、染色質解聚和質膜破裂［12］。第二種是有活力的NET形成（vital NETosis），它可以獨立于細胞死亡發(fā)生，包括核染色質的分泌排出，同時通過脫粒釋放顆粒蛋白［13］。這些成分在細胞外組裝，留下有活性的無核細胞體，可繼續(xù)吞噬微生物［3］。

兩種NET的形成都需要兩個主要過程：（1）中性粒細胞染色質的解聚；（2）核膜和質膜通透性增加。染色質解聚主要由肽基精氨酸酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）所催化，該酶催化組蛋白精氨酸轉化為瓜氨酸，從而降低了組蛋白的強正電荷，削弱了組蛋白與DNA的結合。這種減弱的相互作用隨后解開了核小體的包裹［5，14］。此外，導致染色質解聚的還有NE，NE在MPO刺激下遷移到細胞核酶解組蛋白破壞染色質緊密結構，從而促進核的解聚［15］。研究發(fā)現(xiàn)，在未干擾瓜氨酸化過程的情況下，使用NE抑制劑可以有效阻止真菌性肺炎中動物體內NET形成［16］。

在NET形成過程中質膜通透性增加是程序性發(fā)生的，并不是由染色質解聚后膨脹所造成的物理性破壞的結果。目前研究發(fā)現(xiàn)，核膜和質膜通透性增加是GSDMD成孔蛋白p30（gasdermin D p30，GSDMD－P30）在膜上打孔得以實現(xiàn)［13］。GSDMD以未激活狀態(tài)存在于細胞內，經(jīng)酶（NE、caspase）剪切后分為N端和C端結構，目前發(fā)現(xiàn)N端具有生物活性，GSDMD－P30是GSDMD中的一種，是打孔蛋白，可以在細胞膜上打孔增加膜的通透性［13］。

2.2 NET形成的信號通路

目前對NET形成過程通路尚不完全清楚。NET形成是一個循序漸進的過程，有幾個連續(xù)的步驟：活性氧生成；NE和MPO從顆粒向核的轉移；組蛋白瓜氨酸化；最后，細胞質膜的破壞和染色質的釋放［17］。

最有效且最常用的NET形成（NETosis）激活劑是PKC的直接激活物——PMA。已證明PMA對NETosis通過激活Raf／MEK／ERK信號通路后，誘導NADPH氧化酶組裝成功能復合物，隨后產(chǎn)生抗凋亡蛋白和活性氧（ROS）參與NETosis［18－19］。ROS通過激活MPO，活化的MPO促進NE從顆粒中轉移到細胞核內并酶解組蛋白，破壞染色體緊密包裹的結構［6］。隨后MPO入核，合成次氯酸，加劇染色體解聚，從而促進NET的釋放［20］。此外，ROS還可以通過激活肽基精氨酸酶4（PAD4），瓜氨酸化組蛋白，減少DNA與組蛋白之間的結合，從而促進染色質的解聚。

染色質解聚之后，質膜的破裂或成孔作用會引起NET形成。消皮素（GSDMD）最近被確定在自殺性和有活性的NETosis中發(fā)揮膜成孔的作用，GSDMD通常存在于靜息細胞的胞漿中［13］。當被特定的蛋白酶切割時，會產(chǎn)生成孔片段——GSDMD－P30。在PMA誘導的自殺性NETosis期間，NE裂解GSDMD在中性粒細胞質膜和顆粒膜上產(chǎn)生GSDMD－P30孔，導致在NETosis期間膜的破裂。GSDMD孔在NETosis期間穿透核膜，有助于NETosis過程中核的通透性增加［13］。G.Sollberger等［13］報道，GSDMD抑制劑在不影響NADPH氧化酶、NE或MPO功能的情況下阻斷了PMA誘導的NET代謝，強調了這一途徑中對膜通透性的作用。

3 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)與疾病

3.1 NET在新型冠狀病毒感染中的作用

2019冠狀病毒?。–OVID－19）感染的全譜范圍從無癥狀到急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），以過度炎癥和血栓性微血管病為特征［21］。F.P.Veras等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在重癥COVID－19患者血液和肺部組織中均發(fā)現(xiàn)NET濃度增加；新型冠狀病毒（SARS－CoV－2）可以直接誘導健康中性粒細胞釋放NET。通過SARS－CoV－2的復制、血管緊張素的釋放和絲氨酸蛋白酶的激活觸發(fā)NETosis過程。SARS－CoV－2激活中性粒細胞釋放的NET在體外促進肺上皮細胞死亡［22］。M.Saffarzadeh等［23］研究發(fā)現(xiàn)，誘導肺上皮細胞和內皮細胞死亡的成分主要是組蛋白。NET引起的血栓栓塞是引起新冠病人死亡的主要原因之一。ZUO Y.等［24］報道了NET在COVID－19時引起血栓形成導致的動／靜脈血栓阻塞，由此導致的抗磷脂綜合征可能危及患者生命。NET可以作為血液標志物判斷新冠病人的預后。H.NG等［22］對106例中度至重度新冠病人進行為期4個月的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，新冠病人血液中NET組成的三個主要標志物NE、cf－DNA（cell free－DNA）和citH3均顯著高于健康對照組，需要輔助呼吸和短期死亡的病人NET標志物水平高于病情恢復較好的病人，該研究暗示可將NET作為判斷COVID－19預后的指標。

3.2 NET與癌癥

世界衛(wèi)生組織對于判定是否為良性腫瘤的主要指標是，癌細胞是否能夠發(fā)生轉移、擴散到其他組織。最近的研究發(fā)現(xiàn)NET可能與癌細胞的轉移有關。T.H.Snoderly等［25］發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中NETosis與增加的疾病進展、癌細胞的轉移有關，NET靶向療法已在臨床前癌癥模型中顯示成功，并可能證明在減緩或中止乳腺癌患者的腫瘤進展方面具有重要的臨床目標。YANG L.等［26］研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞上的跨膜蛋白CCDC25可以作為NETDNA復合物受體感知胞外DNA并激活ILK－βparvin（integrin－linked kinase－β－parvin）通路，增強癌細胞的運動性。

3.3 NET與自身免疫病

自身免疫病包括類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗中性粒細胞胞漿抗體（anti－neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相關性血管炎、牛皮癬和痛風等［27］。研究表明，在形成NETs的過程中，NETosis和NET降解之間的失衡可能與自身免疫性疾病有關［28］。白細胞介素－8、ANCA和其他炎癥分子被認為在NET形成中起關鍵作用。長期暴露在與NET相關的caspase中與自身免疫有關，并增加了全身器官損傷的機會［29］。

3.4 NET與炎癥和組織損傷

目前的研究表明，NET具有免疫保護作用，但是同時NET也可引起炎癥和組織損傷。主要原因是NET的組成成分大部分為損傷相關分子模式（DAMPs）。DAMPs主要是來自于自體細胞損傷釋放的物質，它們通過模式識別受體（PRR）激活免疫系統(tǒng)［30］。NET從PMN釋放到胞外后，NET的組成成分，如來自于細胞核的高遷移率蛋白1（HMGB1）、組蛋白、DNA和來自顆粒中的β－防御素、中性粒細胞彈性酶、組織蛋白酶G（cathepsin－G）等，作為DAMPs可以引起組織損傷和炎癥［31－33］。那么這些成分是怎樣引起組織炎癥和損傷的呢？研究發(fā)現(xiàn)NET可以直接殺傷上皮細胞和內皮細胞，在感染新冠時過度的NETosis導致嚴重的肺上皮細胞的損傷［34］。在敗血癥和急性損傷過程中，發(fā)現(xiàn)游離的組蛋白具有損傷細胞膜完整性的能力［35］。其他的NET相關蛋白如防御素可以滲透真核細胞，NE可以破壞細胞間的緊密連接［36］。

3.5 NET調節(jié)的分子機制

微生物和內源性刺激（例如與損傷相關的分子模式和免疫復合物）可觸發(fā)稱為NETosis的嗜中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)的形成。細菌、真菌、病毒、免疫復合物和晶體對許多受體的連接通過各種下游效應蛋白激活NETosis［37］?；罨难“暹€可以通過高糖基化終產(chǎn)物（RAGE）和P－選擇素－P－選擇素糖蛋白配體1（PSGL1）相互作用的HMGB1受體觸發(fā)NETosis［38］。通過MEK細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）信號傳導誘導活性氧，觸發(fā)MPO途徑［19］。在該途徑中，NE需要MPO介導的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）的氧化活化來降解細胞質中的肌動蛋白細胞骨架，以阻斷吞噬作用［20］。然后，NE轉移到細胞核，通過處理組蛋白來驅動染色質的解聚。MPO和原癌基因DEK的結合以及PAD4的激活也促進了染色質的解聚，這使組蛋白瓜氨酸化［39］。自噬也被認為在NET的形成中起作用。吞噬受體通過促進吞噬小體的形成抑制NETosis，從而響應小型微生物，吞噬小體的形成使NE遠離核［40］。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素（Siglec 5和Siglec 9）通過限制中性粒細胞活化和ROS生成來抑制NETosis［41］。內源性絲氨酸蛋白酶抑制劑可以通過抑制NE 來阻斷NETosis。

4 展望

NET在宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用，同時過度釋放的誘捕網(wǎng)會引發(fā)各種疾病，因此靶向誘捕網(wǎng)治療疾病可以作為新的研究方向。NET還可作為標志物判斷某些疾病的嚴重程度。在NET被發(fā)現(xiàn)的早期，其捕獲微生物的能力引起了研究者們極大的熱情，但最近其致病潛力吸引了人們的關注。NET是有益還是有害與調節(jié)其形成的方式和產(chǎn)生水平有關，如組成性激活、抑制機制失調和NET產(chǎn)量過高可能是導致疾病的重要致病機制。因此認為劑量、NET釋放和清除的時間調節(jié)是NET能否致病的關鍵因素。在自身免疫中，異常的NETosis可能是由于先天的耐受性被破壞導致的，但NET在炎癥性疾病的發(fā)病機制中似乎發(fā)揮了主要作用。NET增強或抑制炎癥的能力在無菌疾病和其他未知情況下可能具有有益的作用?？紤]到大量的NET蛋白，可能會發(fā)現(xiàn)新的NET功能。更好地了解NET的功能和對動物健康的影響將能夠抑制有害屬性，而不會干擾有益屬性，并最終使我們能夠利用NET來治療疾病。