景敏，馬禎元，楊帆，張琦，丁敏，陳曼龍

(1. 陜西理工大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，陜西 漢中 723000； 2. 陜西省工業(yè)自動(dòng)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000)

水是植物體的重要組成部分，參與了植物的蒸騰、呼吸、光合作用等生理反應(yīng)過程.水分含量影響植物的結(jié)構(gòu)形態(tài)和生長發(fā)育，關(guān)系著農(nóng)產(chǎn)品效能產(chǎn)出及經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)化比率.傳統(tǒng)的水分含量監(jiān)測方法大多響應(yīng)速度慢、精度低且直接接觸會(huì)破壞植株生長[1].近年來，隨著各種新型無損檢測儀器研發(fā)及光學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光檢測及成像技術(shù)已經(jīng)逐漸開始大范圍應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[2-4].葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)技術(shù)主要分為主動(dòng)和被動(dòng)2種方法，作為最大的被動(dòng)遙感輻射源，基于日光誘導(dǎo)的葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)在遙感領(lǐng)域最為常見[5-7]；主動(dòng)誘導(dǎo)熒光技術(shù)則是利用激發(fā)光源激發(fā)葉綠素分子產(chǎn)生熒光，通過信號(hào)處理和光電轉(zhuǎn)換的方法獲得熒光信息.由于這一過程與光合作用競爭，因此可以通過葉綠素?zé)晒鈧鞲衼硖綔y植物光化學(xué)的效率[8]及不同因素對(duì)光合作用的影響[9],相當(dāng)于光合作用指示器，從而廣泛應(yīng)用于植物各類脅迫狀態(tài)的監(jiān)測和預(yù)警.

葉綠素是一種優(yōu)良的熒光發(fā)射器.熒光測定技術(shù)可以不破壞細(xì)胞，不傷害生物體，在生物學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域常被用于分析微量元素脅迫和檢驗(yàn)植物樣品.王藝斐等[10]通過測定光合色素含量、吸收光譜和葉綠素?zé)晒鈪?shù), 討論了葉片黃化和脫落的關(guān)系.楊一璐等[11]利用熒光葉片圖像對(duì)辣椒的氮含量進(jìn)行了建模預(yù)測.王迎旭等[12]利用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)研究了黃瓜植株不同病害區(qū)分及早期病害監(jiān)測的可行性，證明了此方法具有良好的應(yīng)用前景.DONG等[13]利用葉綠素成像技術(shù)分析了不同等級(jí)的冷害脅迫對(duì)番茄幼苗的影響.OSRIO等[14]利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)研究了Fe元素對(duì)草莓光合作用的影響；PRADHAN等[15]通過測定葉綠素a熒光參數(shù)，研究了鹽脅迫和部分水分脅迫對(duì)水稻光合性能的綜合影響.除此之外，熒光技術(shù)還廣泛應(yīng)用在遙感監(jiān)測識(shí)別[16-17]等領(lǐng)域.

傳統(tǒng)熒光誘導(dǎo)技術(shù)多利用熒光動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行光化學(xué)效率及光化學(xué)淬滅系數(shù)分析[18]，其中熒光快相反應(yīng)部分在數(shù)秒內(nèi)完成,檢測儀價(jià)格昂貴且批量測量操作不便.由于植物內(nèi)部因素影響，同脅迫下植物二維空間表現(xiàn)不同，而便攜式熒光儀等商用儀器難以大面積表征葉面受迫二維反應(yīng).

文中利用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)對(duì)草莓幼苗進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上?，采集并提取葉綠素?zé)晒鈭D像參數(shù)，利用圖像灰度時(shí)間序列繪制熒光淬滅曲線，建立葉綠素?zé)晒鈪?shù)、動(dòng)態(tài)熒光指數(shù)與干旱脅迫天數(shù)的相關(guān)模型，以實(shí)現(xiàn)草莓幼苗干旱脅迫監(jiān)測，同時(shí)結(jié)合圖像分析均勻光照下熒光圖像受迫二維表現(xiàn)的差異性，為干旱環(huán)境對(duì)草莓的生長影響研究提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

供試草莓品種為“久香”草莓.選20株長勢一致且約為4片真葉的草莓幼苗進(jìn)行培育，植株高度為70～100 mm.

對(duì)草莓幼苗進(jìn)行離體和活體干旱脅迫試驗(yàn).離體試驗(yàn)是指采集草莓幼苗離體葉片熒光圖像，觀察葉綠素?zé)晒鈭D像變化及部分熒光參數(shù)與脅迫時(shí)間的相關(guān)性.在試驗(yàn)時(shí)采摘表面平整且無損傷的草莓葉片，經(jīng)過20 min暗處理后進(jìn)行熒光圖像采集.活體干旱脅迫試驗(yàn)較為復(fù)雜，需要對(duì)草莓幼苗提前進(jìn)行組別培育處理.將草莓幼苗隨機(jī)分為2組A和B，每組10株，剔除異常品種后進(jìn)行分組培育.其中A組不澆水為試驗(yàn)組，B組每日澆水20 mL作對(duì)照組，連續(xù)7 d每隔24 h對(duì)其進(jìn)行熒光圖像采集，觀察葉綠素?zé)晒鈭D像參數(shù)變化規(guī)律.

2 試驗(yàn)與分析

為獲得清晰易于處理的熒光圖像，設(shè)計(jì)了如圖1所示的葉綠素?zé)晒獬上癫杉到y(tǒng)[19].采用大功率集成LED陣列作為激勵(lì)光源，LED通過散熱基座與恒流源相連，確保散熱及持續(xù)工作.圖像采集裝置選用維視MV-EM120/C CCD相機(jī)，鏡頭前安裝有峰值680 nm半帶寬15 nm的帶通濾光片.為避免環(huán)境光的干擾，整個(gè)試驗(yàn)在暗室中進(jìn)行.

圖1 熒光成像系統(tǒng)示意圖

2.1 圖像預(yù)處理

圖像預(yù)處理的主要目的是消除圖像的無關(guān)信息，增強(qiáng)真實(shí)信息及相關(guān)信息的可檢測性和最大限度簡化數(shù)據(jù)，從而改進(jìn)后續(xù)提取處理的可靠性.由于CCD成像設(shè)備及冗余環(huán)境噪聲的影響，為了更好地分析葉片區(qū)域的圖像特征，在進(jìn)行數(shù)據(jù)處理前需要對(duì)采集到的葉綠素?zé)晒鈭D像進(jìn)行去背景操作.文中采用最大類間方差法(OTSU)進(jìn)行閾值分割然后與原圖相乘進(jìn)行去背景，能有效減免干旱脅迫試驗(yàn)過程中植株和設(shè)備移動(dòng)及多次拍攝帶來的不可量誤差.去背景流程如圖2所示.

圖2 去背景流程圖

圖3為草莓葉片預(yù)處理圖像.從左至右依次為草莓熒光葉片原圖、OTSU法進(jìn)行閾值分割處理生成二值化圖像以及去背景后熒光葉片圖像.

圖3 草莓葉片熒光圖像預(yù)處理

圖4為預(yù)處理前后的圖像灰度等級(jí)對(duì)比，圖中縱坐標(biāo)PX為像素，橫坐標(biāo)Gray為灰度值.可以看出，通過基于OTSU閾值分割的圖像預(yù)處理，解決了圖像背景微小灰度值問題，將葉面區(qū)域以外的灰度值置0，保留原有葉片區(qū)域圖像灰度及彩色特征，有利于后續(xù)參數(shù)提取.

圖4 預(yù)處理圖像灰度直方圖

2.2 離體葉片干旱脅迫分析

通過觀察草莓植株，葉片會(huì)在離體后不斷失水干枯.采摘長勢良好的草莓葉片，放置于載物臺(tái)上使其自然失水，分析葉片離體后自然干枯失水和葉綠素?zé)晒鈭D像的變化關(guān)系，并采集自然失水脅迫狀態(tài)下0～14 h下的熒光圖像.

熒光淬滅曲線的測定一般用調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈾z測儀，對(duì)于外場條件而言，抗干擾性較強(qiáng)，結(jié)果較為精確，但價(jià)格昂貴.文中使用CCD熒光成像裝置進(jìn)行室內(nèi)熒光獲取，并提取熒光淬滅曲線進(jìn)行分析.離體葉片經(jīng)過20 min暗適應(yīng)后，預(yù)設(shè)CCD采集速率為1 s，相機(jī)曝光時(shí)間100 ms.外觸發(fā)采集主動(dòng)誘導(dǎo)光源開啟后10 min內(nèi)的熒光圖像600張，利用圖像處理軟件批量背景預(yù)處理，并計(jì)算每幅圖像的平均像素值,分析熒光圖像時(shí)間序列，提取曲線最大值(Fm)和穩(wěn)態(tài)值(Fs)等葉綠素?zé)晒鈪?shù).

圖5為葉綠素?zé)晒獯銣缜€，圖中縱坐標(biāo)PXa為像素均值.可以看出：不同采集時(shí)刻下熒光淬滅曲線衰減速率不同，離體葉片自然失水0～8 h衰減速率快，8 h之后趨于平緩；離體葉片在自然失水的12 h內(nèi)其熒光最大值Fm和穩(wěn)態(tài)值Fs都有所下降，從最大值到穩(wěn)態(tài)之間的熒光衰減過程逐漸平緩；離體12 h后葉片體內(nèi)熒光水平最大值約等于穩(wěn)態(tài)值(Fm=Fs)，相比其他測量時(shí)間(2～10 h)有非常明顯的降低，熒光圖像在主動(dòng)誘導(dǎo)的10 min內(nèi)無劇烈衰減.

圖5 熒光淬滅曲線

計(jì)算熒光衰減比率Rfd與干旱脅迫的天數(shù)間的相關(guān)性，其中熒光衰減比率Rfd為

Rfd=(Fm-Fs)/Fs.

(1)

以圖像中葉面區(qū)域所有像素點(diǎn)平均像素值作為上述動(dòng)力學(xué)參數(shù)參考數(shù)值，熒光衰減比率Rfd與干旱脅迫天數(shù)的相關(guān)性分析如圖6所示.可以看出，Rfd值在離體失水的前2個(gè)記錄點(diǎn)(0,2 h)時(shí)成平穩(wěn)趨勢，在接下來的3個(gè)記錄點(diǎn)(4，6，8 h)時(shí)迅速下降，最后趨于平緩.

圖6 Rfd擬合曲線

通過擬合相關(guān)性曲線，發(fā)現(xiàn)葉片離體后的熒光衰減比Rfd值用Logistic模型擬合度最高，決定系數(shù)R2=0.98，擬合公式為

y=A2+(A1-A2)/[1+(X/X0)P]，

(2)

式中各參數(shù)具體值分別為A1=2.719 6，A2=0.159 8，X0=6.187 3，P=6.288 3.

2.3 活體葉片干旱脅迫分析

對(duì)草莓幼苗進(jìn)行活體干旱脅迫處理，對(duì)2組共20株草莓幼苗進(jìn)行圖像采集.采集過程與離體葉片干旱脅迫圖像采集過程一致，在每次熒光圖像采集前進(jìn)行暗處理.拍攝激發(fā)開始到穩(wěn)態(tài)階段的熒光圖像，并通過閾值分割提取熒光圖像信息.繪制草莓幼苗在不同干旱脅迫分組下的葉綠素?zé)晒獯銣缜€，通過連續(xù)繪制激發(fā)光源開啟后0～10 min內(nèi)600張熒光圖像的像素均值，記錄熒光強(qiáng)度從激發(fā)開始達(dá)到最高值，然后逐漸衰減直至達(dá)到穩(wěn)態(tài)的過程，截取熒光強(qiáng)度從最大值衰減到穩(wěn)態(tài)的過程即為熒光淬滅曲線，如圖7所示.

圖7 草莓幼苗熒光淬滅曲線

圖8為試驗(yàn)組A與對(duì)照組B在連續(xù)7 d干旱脅迫試驗(yàn)中的熒光衰減比率Rfd值變化情況,可以看出：試驗(yàn)組A在7 d內(nèi)進(jìn)行持續(xù)干旱脅迫，Rfd值波動(dòng)較大，但干旱脅迫天數(shù)與Rfd值之間無明顯的相關(guān)關(guān)系；對(duì)照組B在7 d內(nèi)持續(xù)澆水，Rfd值較為穩(wěn)定，在1.35上下波動(dòng).

圖8 熒光衰減比率Rfd 散點(diǎn)圖

動(dòng)態(tài)熒光指數(shù)(DFI，dynamic fluorescence index)是指熒光淬滅曲線到最大值(Fm)與曲線任意一點(diǎn)(Fe)之間連線的最大距離，常被用來分析水分脅迫下植物葉面水勢變化相關(guān)關(guān)系[20]，其定義圖如圖9a所示，圖中縱坐標(biāo)F為熒光強(qiáng)度.連續(xù)高速拍攝的熒光淬滅曲線可以看作是以時(shí)間t為自變量不斷變化的函數(shù)，其中y(t)為熒光淬滅曲線，F(xiàn)m(t0,yt0)表示熒光淬滅曲線最大值，F(xiàn)e(te,yte)表示曲線上除最大值外任一定點(diǎn).

顯然，可以寫出Fm-Fe直線方程與DFI的數(shù)學(xué)表達(dá)式.Fm-Fe直線的一般方程為

(yt0-yte)t-(t0-te)y+yte(t0-te)-te(yt0-yte)=0.

(3)

DFI即為熒光淬滅曲線y(t)上的動(dòng)點(diǎn)(ti,yi)到Fm-Fe直線距離的最大值(即熒光淬滅曲線與直線最大距離)，自變量ti取值區(qū)間為[t0,te]，DFI計(jì)算公式為

(4)

利用圖7a草莓幼苗熒光淬滅曲線，分別計(jì)算Fe(te,yte)取值熒光淬滅曲線上300～600 s時(shí)產(chǎn)生的不同DFI值與脅迫天數(shù)的相關(guān)性.結(jié)果表明，當(dāng)te=550 s,即Fe為熒光淬滅曲線550 s處對(duì)應(yīng)像素均值時(shí)求得DFI值與干旱脅迫天數(shù)有較高相關(guān)性，決定系數(shù)R2=0.84，擬合圖如圖9b所示，擬合方程為

y=A0+At+Bt2，

(5)

式中各參數(shù)具體值分別為A=0.954 6，B=-0.067 2，A0=4.195 1.

圖9 動(dòng)態(tài)熒光指數(shù)DFI示意圖和DFI擬合曲線

2.4 干旱脅迫二維分析

相對(duì)于真彩色熒光圖像，基于灰度變換法的偽彩色圖像轉(zhuǎn)換處理可以提高熒光圖像的可辨識(shí)度.圖10為不同分組脅迫下不同天數(shù)的熒光葉片偽彩色處理后的圖像.

圖10 不同脅迫分組7 d內(nèi)的熒光偽彩色圖像

由圖10可以看出：試驗(yàn)組A長期處于干旱狀態(tài)下的草莓幼苗葉面熒光分布及范圍有明顯變化，由于光合作用與熒光現(xiàn)象處于競爭關(guān)系，葉面熒光均值增大則意味著植物光合效率的降低，在干旱脅迫的第7 d，草莓葉面葉綠素分布明顯增多，這表示葉片表面嚴(yán)重失水，光化學(xué)反應(yīng)能力下降；對(duì)照組B澆水20 mL/d維持了草莓幼苗光合作用所必需的水分及土壤濕度，其光合速率無較大變化，葉片區(qū)域的熒光分布沒有較大差異.干旱脅迫引起的葉綠素含量變化在熒光偽彩色圖像上表現(xiàn)明顯，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大面積監(jiān)測反映植物生理狀態(tài)提供了一定參考.

3 結(jié) 論

1) 通過熒光采集系統(tǒng)對(duì)不同干旱脅迫分組下的草莓幼苗進(jìn)行了圖像采集，基于圖像處理算法的圖像背景預(yù)處理方法可避免多次拍攝及設(shè)備移動(dòng)帶來的誤差，保留葉面區(qū)域的熒光數(shù)據(jù).熒光圖像采集系統(tǒng)通過速率設(shè)定可以實(shí)現(xiàn)部分傳統(tǒng)熒光曲線檢測功能，以時(shí)間序列采集的葉綠素?zé)晒鈭D像，經(jīng)過圖像預(yù)處理，像素灰度平均，可以繪制出熒光淬滅曲線，得到部分熒光曲線參數(shù).

2) 試驗(yàn)表明，離體草莓葉片自然失水可以通過熒光衰減比Rfd與脅迫天數(shù)實(shí)現(xiàn)檢測，決定系數(shù)較高.活體草莓幼苗干旱脅迫7 d內(nèi)Rfd值相比對(duì)照組變化明顯，但無相關(guān)規(guī)律.熒光淬滅曲線550 s處的熒光動(dòng)態(tài)指數(shù)(DFI)與活體草莓幼苗干旱脅迫天數(shù)具有高相關(guān)性，可用作草莓幼苗干旱指示預(yù)警.

3) 結(jié)合圖像的葉綠素?zé)晒夥治龇椒ㄏ鄬?duì)傳統(tǒng)的熒光檢測方法經(jīng)濟(jì)方便，不同分組下的熒光圖像在二維方向上直觀地解釋了在干旱脅迫下植株內(nèi)部葉綠素含量變化導(dǎo)致的植物生理狀態(tài)變化.但成像過程極易受到環(huán)境因素干擾，熒光圖像后續(xù)處理步驟繁雜，部分作物的受脅迫反映并不一致，如何大面積的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域是需要解決的問題.