柳麗 黃菁菁 李曉慶 季軍 周鵬 魯翔 何慧薇

心血管疾病是全人類死亡的主要原因之一，來(lái)源于中動(dòng)脈層的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖是形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的核心機(jī)制之一。在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中，VSMCs經(jīng)歷了復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能變化，產(chǎn)生不同的表型促進(jìn)VSMCs的增殖[1]。VSMCs動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)表型后增殖的能力促使其在控制血壓、血液分布以及維持血管結(jié)構(gòu)完整性方面發(fā)揮著重要作用，參與生理和病理性血管重塑。VSMCs增殖的調(diào)控過程極為復(fù)雜，包含多種調(diào)控分子和信號(hào)途徑的共同作用，因此詳細(xì)了解VSMCs的特征及其增殖過程對(duì)研究用于血管治療的新藥物至關(guān)重要。本文就VSMCs增殖在動(dòng)脈粥樣硬化中的研究進(jìn)展及當(dāng)前藥物研究情況做一綜述。

1 VSMCs增殖與動(dòng)脈粥樣硬化

在正常動(dòng)脈中，VSMCs位于內(nèi)側(cè)層，負(fù)責(zé)動(dòng)脈的收縮以及分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)，并在維持動(dòng)脈順應(yīng)性及彈性回彈中起重要作用。正常動(dòng)脈中的VSMCs表達(dá)一系列“SMC標(biāo)記”，通常包括平滑肌細(xì)胞肌球蛋白重鏈(MYH11)，SM22α/tagln、平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白(ACTA2)、平滑肌素等。在動(dòng)脈粥樣硬化血管中，VSMCs的這些標(biāo)志物表達(dá)降低，反而獲得了細(xì)胞增殖、遷移以及分泌各種ECM和細(xì)胞因子的能力。VSMCs是一種具有表型轉(zhuǎn)化能力的細(xì)胞類型，在動(dòng)脈粥樣硬化前病變彌漫性內(nèi)膜增厚(diffuse intimal thickening，DIT)時(shí)，VSMCs由中膜向內(nèi)膜遷移，并在此過程中完成靜止的“收縮”表型向激活的“合成”表型轉(zhuǎn)化[2]?！昂铣伞毙蚔SMCs以收縮蛋白表達(dá)減少為特征，增強(qiáng)生長(zhǎng)因子、受體以及ECM蛋白酶的表達(dá)，并由中膜向內(nèi)膜遷移和增殖，有助于形成初始的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。在晚期階段，他們會(huì)進(jìn)一步增殖聚集，形成纖維帽以穩(wěn)定易碎斑塊。早期的研究表明，VSMCs可以通過促進(jìn)纖維帽形成，穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，保護(hù)斑塊不破裂，這被認(rèn)為是個(gè)有益的作用。但近年來(lái)的研究表明，VSMCs似乎比預(yù)期更為多變，可以通過失去VSMCs特征變成泡沫細(xì)胞，并獲得炎癥細(xì)胞的特征。

在動(dòng)脈粥樣硬化過程中，VSMCs能向多個(gè)表型轉(zhuǎn)化，包括鈣化(成骨、軟骨形成和破骨)和巨噬細(xì)胞表型。一方面，一些VSMCs在表型轉(zhuǎn)化時(shí)獲得巨噬細(xì)胞特性，分化為脂質(zhì)負(fù)載的泡沫細(xì)胞樣巨噬細(xì)胞，通過降低清除脂質(zhì)、死亡細(xì)胞和壞死碎片的能力以及加劇炎癥來(lái)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化[3]。另一方面，VSMCs向鈣化表型方面轉(zhuǎn)化。VSMCs表型的可塑性和骨軟骨分化在動(dòng)脈粥樣硬化性動(dòng)脈內(nèi)膜鈣化中起關(guān)鍵作用[4]。動(dòng)脈內(nèi)膜鈣化與動(dòng)脈粥樣硬化不良事件，如斑塊破裂、心肌梗死、卒中等有重要關(guān)系。VSMCs通過調(diào)節(jié)表型促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而參與動(dòng)脈粥樣硬化全進(jìn)程。

2 影響VSMCs增殖的主要因子及信號(hào)通路

影響VSMCs增殖最主要的因子是血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)及其受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)。他們可通過影響多條下游信號(hào)通路來(lái)刺激VSMCs增殖，包括Ras/MAPK、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)等通路，這些信號(hào)通路均受蛋白酪氨酸磷酸酶負(fù)性調(diào)控。除此之外，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)、胰島素和膆島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)也可以進(jìn)一步刺激VSMCs的增殖。促進(jìn)VSMCs增殖的活性物質(zhì)包括：血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)和內(nèi)皮素-1(endothelin 1, ET-1)、凝血酶、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、整合素、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶和端粒酶等。炎性細(xì)胞因子ILs、TNF-α、鈣以及活性氧(reactive oxygen species, ROS)等,最終都將通過影響細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)控VSMCs的增殖。

2.1 PDGFR及其相關(guān)信號(hào)通路

2.1.1 Ras/MAPK信號(hào)通路：以癌基因H-Ras, K-Ras以及N-Ras為主要代表的Ras家族成員可調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、致瘤和轉(zhuǎn)移，并與絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38一起參與PDGFR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在VSMCs增殖中發(fā)揮了重要作用。以往研究表明，在血管損傷細(xì)胞模型和活體動(dòng)物研究中，沉默H-Ras基因可以抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增厚[5]；雷公藤內(nèi)酯醇可以使MAPK信號(hào)通路失活，抑制細(xì)胞周期蛋白p21和成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, RB)的表達(dá)，從而抑制VSMCs增殖[6]。

2.1.2 PI3K/Akt途徑：PI3K通過激活蛋白激酶B(Akt)和蛋白激酶C(PKC)家族的一些成員調(diào)節(jié)VSMC增殖和遷移，并在血管損傷后促進(jìn)新生內(nèi)膜增生，使用PI3K或Akt抑制劑可以抑制VSMCs的增殖[7]。過表達(dá)的PKC-δ可以通過抑制細(xì)胞周期蛋白D1和E的表達(dá)來(lái)抑制VSMCs的增殖。研究表明，高水平的趨化素樣因子1與G2/M期中VSMC的積累和少量凋亡的VSMC有關(guān)[8]，而Akt1si-RNA納米粒子洗脫支架具有減輕支架內(nèi)再狹窄的能力[9]。

2.1.3 磷脂酶C-γ(PLC-γ)途徑：PLC-γ與PDGFR結(jié)合后被磷酸化并獲得催化活性，是激活PDGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要介質(zhì)。PLC-γ催化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)分解為肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)，進(jìn)而通過調(diào)控胞內(nèi)Ca2+和PKC活性激活下游信號(hào)。PKC的過度表達(dá)或磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDK1)對(duì)內(nèi)源性激酶的刺激作用可導(dǎo)致p21的降解，p21是細(xì)胞周期進(jìn)程的抑制因子，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。體外實(shí)驗(yàn)表明，PDGFR-β誘導(dǎo)的PLC-γ信號(hào)中斷抑制了PDGF對(duì)VSMCs的分裂和趨化反應(yīng)，促使小鼠因球囊損傷新生內(nèi)膜形成減少[10]。

2.1.4 JAK/STAT途徑：Janus激酶(JAKs)是一種通過JAK-STAT途徑傳遞細(xì)胞外信號(hào)的非受體酪氨酸激酶。JAKs可能與G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子受體[IL-6和干擾素-γ(IFN-γ)受體]的結(jié)構(gòu)域有關(guān)。細(xì)胞因子受體與配體結(jié)合導(dǎo)致JAKs二聚體化、相互轉(zhuǎn)磷酸化和活化，通過酪氨酸殘基為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)蛋白提供對(duì)接位點(diǎn)。STATs在調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程中起著重要作用，在哺乳動(dòng)物中，存在7種不同的STAT基因，他們的特征序列以及其組織特異性分布使特征反應(yīng)成為可能。研究表明，STAT3通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D2、D3和A，細(xì)胞分裂周期25A(CDC25A)以及下調(diào)細(xì)胞周期抑制劑p21和p27來(lái)刺激G1/S相轉(zhuǎn)變。故沉默STAT3的表達(dá)可降低球囊損傷大鼠的VSMCs新生內(nèi)膜增殖。內(nèi)皮細(xì)胞中JAKs活性的負(fù)調(diào)控因子細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子-3(SOCS-3)的過度表達(dá)，可抑制STAT3磷酸化及活化，從而抑制IL-6/IFN-γ介導(dǎo)的VSMCs的遷移和增殖[11]。

2.1.5 蛋白酪氨酸磷酸酶：蛋白酪氨酸磷酸酶是PDGFR及下游信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子。胞漿低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(LMW-PTP)、T細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸酶(TC-PTP)和蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(PTP-1B)均可使PDGFR去磷酸化。 Akt的活性由磷酸酶2A(PP2A)調(diào)節(jié)。磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)是PI3K/Akt途徑的負(fù)調(diào)控因子。有研究表明，在VSMCs中過度表達(dá)PTEN抑制了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移。受體樣磷酸酶密度增強(qiáng)磷酸酶-1(DEP-1)去磷酸化PDGFR，從而影響PLC-γ信號(hào)傳導(dǎo)[12]。磷酸酶通過脫磷酸化STAT激活酪氨酸激酶直接或間接調(diào)節(jié)STAT活性。

2.2 FGF及其信號(hào)通路 FGF可以刺激VSMCs增殖。盡管酸性FGF和堿性FGF都能促進(jìn)VSMCs的分裂，但大量研究表明，與酸性FGF相比，堿性FGF在血管發(fā)育和病理學(xué)中發(fā)揮著更重要的作用。FGF和PDGF有部分相同的信號(hào)通路，如Ras/MAPK的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。全身注射抗堿性FGF的中和抗體可顯著抑制球囊損傷大鼠VSMCs的增殖。

2.3 EGF及其信號(hào)通路 EGF家族由幾種肽類生長(zhǎng)因子組成，包括EGF、肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子、表調(diào)節(jié)素、β纖維蛋白、兩性霉素和4種神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG-1、2、3、4)，他們均具有刺激VSMCs增殖的作用。所有表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)配體均可促進(jìn)VSMCs向增殖表型轉(zhuǎn)化。此家族所有成員都必須被去整合素和金屬蛋白酶蛋白裁切，才能具有生物活性。一些研究表明，表調(diào)節(jié)素是一種由AngⅡ、ET-1和凝血酶誘導(dǎo)的VSMCs分泌的促分裂素，他可能有助于VSMCs的增殖[13]。EGF家族成員與其同源受體結(jié)合以影響VSMCs的遷移和增殖。EGF和PDGF的共同信號(hào)通路，包括Ras/MAPK、PI3K/Akt、PLC-γ和JAK/STAT信號(hào)通路等。

2.4 AngⅡ及其相關(guān)信號(hào)通路 腎素-血管緊張素系統(tǒng)存在于全身和局部循環(huán)中，AngⅡ便來(lái)自于此，并發(fā)揮著收縮血管的重要作用。急性刺激AngⅡ可調(diào)節(jié)體內(nèi)鹽/水平衡、血管運(yùn)動(dòng)張力和血壓，而慢性刺激可加速VSMCs的增殖和肥大，影響VSMCs的遷移和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并導(dǎo)致心臟和血管重塑。大量研究表明，干擾AngⅡ的表達(dá)可抑制VSMCs的增殖。IOX1作為一種含有2AJumonji結(jié)構(gòu)域(JMJD2A)的抑制因子，可通過選擇性調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白D1和p21，抑制AngⅡ刺激的VSMCs增殖，IOX1因此被證明是可能治療動(dòng)脈粥樣硬化的一種潛在的治療劑[14]。

2.5 胰島素和IGF-1信號(hào)通路 胰島素是胰腺β細(xì)胞產(chǎn)生的一種激素，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)葡萄糖。IGF-1是一種與胰島素同源的肽。在VSMCs中，這2種物質(zhì)通過激活胰島素受體(insulin receptor, IR)表現(xiàn)出類似的信號(hào)功能，隨后將由4個(gè)(IRS-1、2、3、4)成員組成的胰島素受體底物蛋白(IRS)磷酸化。IR有2種剪接異構(gòu)體，他們通常在細(xì)胞中共同表達(dá)。這些細(xì)胞還表達(dá)高度相關(guān)的胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF1R)，IGF1R也能被胰島素激活。IRS-1和2可以激活2種主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：PI3K/Akt和MAPK。許多研究表明，IGF-1/胰島素相關(guān)途徑刺激VSMCs增殖。IGF-1在VSMCs中的促分裂作用是通過IGF1R和PI3K介導(dǎo)的。PI3K/Akt、細(xì)胞內(nèi)磷脂酶2(CPLA2)和ERK1/2在VSMCs增殖中也具有重要作用。此外，IGF1R在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)誘導(dǎo)的VSMCs增殖中起重要作用。如反義寡核苷酸抑制TRAIL誘導(dǎo)的VSMCs增殖[15]。

2.6 非編碼RNA(ncRNA)及其信號(hào)通路 非編碼基因組通過調(diào)控基因編程和基因調(diào)控在心血管疾病中起著關(guān)鍵作用，如微小RNA(microRNA，miRNA)、小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)和長(zhǎng)非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)。miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過抑制信使RNA(messenger RNA, mRNA)翻譯或促進(jìn)mRNA降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。許多miRNA參與VSMCs的增殖調(diào)控[16]。miRNA-221和miRNA-222通過沉默靶蛋白CKI p27Kip1、p57Kip2和c-kit實(shí)現(xiàn)VSMCs的增殖。敲除miRNA-221或miRNA-222能夠抑制大鼠頸動(dòng)脈損傷后VSMCs的增殖和新內(nèi)膜的形成[17]。 miRNA-22是VSMCs表型轉(zhuǎn)換和血管新生內(nèi)膜病變形成的新型調(diào)節(jié)劑，通過作用于其靶基因MECP2、HDAC4和EVI1來(lái)促進(jìn)VSMCs收縮基因表達(dá)并抑制VSMCs的增殖和遷移[18]。lncRNA是長(zhǎng)度大于 200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)lncRNA參與多種細(xì)胞信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、遷移和凋亡[19]，例如lncRNA HCG11通過靶向miR-144-3p/FOXF1軸促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化中VSMCs的增殖并抑制其凋亡[20]。lncRNA-H19可以通過lncRNA-H19/miR-148b/WNT/β-catenin軸促進(jìn)VSMCs的增殖并抑制其凋亡，也可以通過miR-675/PTEN軸促進(jìn)VSMCs的增殖[21]。

3 VSMCs增殖的調(diào)節(jié)劑

3.1 臨床上用于抑制VSMCs的藥物

3.1.1 紫杉醇：是從紅豆杉中分離出來(lái)的一種天然二萜類化合物，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)含有紫杉烷環(huán)的化合物，具有抗腫瘤活性[22]。紫杉醇是迄今為止已知的細(xì)胞分裂阻斷劑，能通過穩(wěn)定細(xì)胞來(lái)干擾有絲分裂微管的聚集，阻斷有絲分裂紡錘體的解體，從而抑制有絲分裂活性。起初因紫杉醇不溶于水使其使用受限，后通過其衍生物10-脫乙?；?巴卡亭Ⅲ解決了溶解度問題，使得紫杉醇廣泛被用于洗脫支架。許多臨床研究已經(jīng)明確提出紫杉醇洗脫支架可以預(yù)防再狹窄[23]。目前正在研發(fā)的新制劑主要集中在納米載體技術(shù)上。白蛋白結(jié)合型紫杉醇(Abraxane?)自2007年開始用于臨床治療，其他幾種紫杉醇陽(yáng)離子脂質(zhì)體也已批準(zhǔn)或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的不同階段。

3.1.2 雷帕霉素：早期研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素是一種具有抗真菌活性的化合物，隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)雷帕霉素還具有免疫抑制和抗增殖活性的作用。雷帕霉素可阻斷mTOR，通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)及運(yùn)動(dòng)[24]。目前雷帕霉素衍生物(如依維莫司、佐他莫司)和生物可吸收聚合物是下一代支架研究的熱點(diǎn)[25]。

3.2 體外實(shí)驗(yàn)中有效抑制VSMCs的天然產(chǎn)物 到目前為止，大量體外研究證實(shí)許多天然產(chǎn)物能有效抑制VSMCs增殖。如金絲桃苷、黃岑苷及紅酒和葡萄皮中含有的白藜蘆醇。研究表明：白藜蘆醇可以抑制肺動(dòng)脈高壓小鼠模型中的心室肥大；金絲桃苷作為核受體Nur77的一種有效激活劑，對(duì)血管系統(tǒng)有積極影響[26]；天竺葵苷能顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的遷移，降低局部黏著斑激酶(FAK)和FAK的磷酸化，減少F-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，但不影響細(xì)胞增殖和FAK的磷酸化。黃岑苷是一種類黃酮化合物，在體外實(shí)驗(yàn)中黃岑苷通過miR-126-5p下調(diào)高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的表達(dá)，顯著抑制氧化LDL誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[27]。

4 結(jié)論

VSMCs的增殖受許多生長(zhǎng)因子及其受體、血管活性物質(zhì)、凝血因子、炎性因子、神經(jīng)遞質(zhì)、ncRNA和其他分子的影響。這些因素和信號(hào)通路的相互作用最終形成了一個(gè)共同的調(diào)節(jié)途徑——細(xì)胞周期。由于VSMCs的過度增殖是動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄和肺動(dòng)脈高壓等多種心血管疾病的病因，探尋抑制這一過程的方法具有極其重要的意義。盡管調(diào)控VSMCs增殖過程的機(jī)制很復(fù)雜，但最近三十來(lái)年的許多體外和體內(nèi)研究說(shuō)明VSMCs增殖是可被調(diào)控的，近些年也通過深入研究VSMCs的增殖機(jī)制尋找到一些心血管疾病治療的新靶點(diǎn)。未來(lái)將有更多用于調(diào)節(jié)VSMCs增殖的新藥物被用于治療心血管疾病，這將為心血管疾病的藥物治療提供新的方向。