楊 柳，陳宇飛，劉長(zhǎng)姣

(吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130507)

0 引言

2013年涉及歐洲16國(guó)的“馬肉風(fēng)波”曝光以來，肉及肉制品摻假成為世界各國(guó)共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題。不法商販以鴨肉、雞肉，甚至狐貍?cè)?、鼠肉冒充牛肉、羊肉，?yán)重?fù)p害消費(fèi)者利益，同時(shí)帶來諸多食品安全隱患。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)依靠4條引物，以及一種有鏈轉(zhuǎn)換特性的脫氧核糖核酸聚合酶，在等溫條件下，靈敏、高效、快速地進(jìn)行靶序列擴(kuò)增。微流控技術(shù)是通過對(duì)微通道網(wǎng)絡(luò)內(nèi)流體的操縱和控制，自動(dòng)完成分析檢測(cè)過程，具有體積小、消耗低、高能量等特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)以牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、狐貍?cè)?、馬肉為研究對(duì)象，將LAMP技術(shù)和微流控技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)牛羊肉中摻假微流控檢測(cè)方法。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)原料肉

牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉購(gòu)于長(zhǎng)春沃爾瑪超市；狐貍?cè)庥杉肿蠹姨禺a(chǎn)研究所提供；馬肉、鼠肉、兔肉、狗肉、驢肉、鴿子肉、鵝肉、貂肉由雙陽特種動(dòng)物養(yǎng)殖基地提供。

1.2 化學(xué)試劑及儀器

Takara試劑盒、LAMP法DNA擴(kuò)增試劑盒、熒光染料、Tris-HCl、Chelex-100、甜菜堿、dNTP、Triton X-100、NP-40、瓊脂糖；LA-320C型實(shí)時(shí)濁度儀、RTisochipTM-B恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀、NanoQ型分光光度計(jì)、HB-2恒溫震蕩金屬浴、TGL-165醫(yī)用冷凍離心機(jī)。

2 方法

2.1 樣品核酸提取

提取牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、狐貍?cè)?、馬肉、鼠肉、兔肉、狗肉、驢肉、鴿子肉、鵝肉、貂肉等14個(gè)樣品DNA作為樣本，并將肉類DNA按照1-14號(hào)做好標(biāo)記，在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 靶基因序列及引物設(shè)計(jì)

通過對(duì)牛、羊、豬、雞、鴨、狐貍、馬等7種動(dòng)物基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定了16SrRNA為靶序列。根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)引物如下:羊、豬、雞、狐貍、馬各5套引物；牛、鴨各3套引物。引物合成由上海生工生物科技有限公司完成。

2.3 LAMP體系的建立

25 μL反應(yīng)混合物及各組分濃度為:2.6 μL引物混合液(終引物濃度:40 pmol FIP 和BIP，5 pmol F3和B3，20 pmol LB和LF)；12.5 μL反應(yīng)液(終反應(yīng)液離子濃度20 mM Tris-HCl為pH 8.8，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，0.1% Triton X-100，0.8 M 甜菜堿，8 mM MgSO4，1.4 mM dNTP)；1 μL 8U Bst DNA 聚合酶；2 μL引物模板；6.9 μl 雙蒸水補(bǔ)齊。將混合物置于65℃恒溫反應(yīng)60 min。

2.4 LAMP優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 引物篩選實(shí)驗(yàn)

設(shè)定溫度為65℃，反應(yīng)時(shí)間60 min，依據(jù)DNA提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以7種肉類DNA樣本為對(duì)象，進(jìn)行最佳引物篩選實(shí)驗(yàn)，根據(jù)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)起峰時(shí)間和高點(diǎn)濃度確定最佳引物序列。

2.4.2 特異性實(shí)驗(yàn)

在LAMP反應(yīng)體系中，利用LAMP反應(yīng)管(兩組八聯(lián)管)進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。1～14號(hào)按肉核酸樣本排列，15號(hào)為陰性對(duì)照，16號(hào)為陽性對(duì)照。第1組實(shí)驗(yàn):1～14號(hào)加入LAMP擴(kuò)增試劑和牛特異性引物，將14種肉類DNA按照標(biāo)記順序，分別加入到相應(yīng)反應(yīng)管中，進(jìn)行LAMP特異性檢測(cè)；第2～7組實(shí)驗(yàn)，特異性引物換成羊、豬、雞、鴨、狐貍、馬的引物，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)過程檢測(cè)。

2.5 芯片驗(yàn)證試驗(yàn)

2.5.1 蝶式芯片的引物包埋固定

蝶式芯片上共有22個(gè)反應(yīng)池，分成Ⅰ、Ⅱ兩個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域各有11個(gè)反應(yīng)池，逆時(shí)針依次編號(hào)，其中進(jìn)樣口1對(duì)應(yīng)的為1號(hào)反應(yīng)池。1張芯片可同時(shí)檢測(cè)2份樣品，每張芯片在特定的反應(yīng)池包埋固定1套引物，用于1種核酸靶序列的擴(kuò)增與檢測(cè)。

2.5.2 芯片驗(yàn)證試驗(yàn)

將牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、狐貍?cè)?、馬肉7種肉類核酸樣本，根據(jù)樣本編號(hào)，按照以下方式組合:單一樣本，2種樣本混合，3種樣本混合，共20種組合方式，使用恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀進(jìn)行芯片特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 引物篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的起峰時(shí)間和高點(diǎn)濃度，可知各種肉類的最佳引物分別是:牛為N3、羊?yàn)閅4、豬為Z2、雞為J3、鴨為ya2、狐貍為H1，馬為M2。

3.2 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1～14號(hào)管中加入LAMP擴(kuò)增試劑和牛的特異性引物，當(dāng)14種肉類核酸分別加入后，只有加入牛肉核酸的1號(hào)管中才發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)(16號(hào)管為陽性反應(yīng))；同樣，將引物分別換成羊、豬、雞、鴨、狐貍、馬的特異性引物。結(jié)果顯示，只有羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、狐貍?cè)?、馬肉的核酸才發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)。即每種肉類的核酸，只有在與之對(duì)應(yīng)的引物作用下，才能發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，體現(xiàn)了引物良好的特異性。

3.3 芯片特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，無論是單一肉類品種的DNA，還是幾種肉類混合的DNA，微流控芯片都能準(zhǔn)確無誤地檢測(cè)到相應(yīng)的肉源性基因的存在，體現(xiàn)出良好的特異性。

4 結(jié)論

本文以LAMP技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合微流控芯片技術(shù)，研制了牛羊肉摻假檢測(cè)微流控蝶式芯片。通過LAMP反應(yīng)管優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，建立了最佳的LAMP反應(yīng)體系。芯片分區(qū)點(diǎn)樣后，做了單一核酸，2種、3種核酸混合基因芯片的特異性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化芯片性能。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，微流控蝶式芯片特異性良好。該芯片一次可以檢測(cè)2個(gè)樣本，檢測(cè)通量高。