孫文丹， 孟 強， 王景超， 于燕萍， 田 靜， 于 軍， 商姍姍， 張 娟

(山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院 山東濟南 250100)

硒是人和動物生長必需的微量元素之一，適量的硒可以調(diào)節(jié)生長、增強免疫力、提高抗氧化能力等[1]。人體一旦缺硒，會減弱組織細胞抗氧化損傷能力，影響人體細胞的分裂、繁殖、遺傳及生長，進而干擾核酸、蛋白質(zhì)、多糖和酶的合成及代謝[2-4]。

人體不能自行合成硒，而且人體各器官不具有長期儲存硒的功能，人體所需的硒需要通過食物來獲取，因此合理提高農(nóng)產(chǎn)品中的硒含量是十分必要的[5]。“土壤-植物-人”食物鏈是人體獲取硒的有效途徑。農(nóng)產(chǎn)品中的硒主要來自于土壤中的硒，而我國約有三分之二的地區(qū)存在不同程度的缺硒，其中三分之一為嚴重缺硒地區(qū)[6]。這些地區(qū)的缺硒狀況可以通過在土壤中增施硒肥或向作物葉面噴施含硒制劑得到改善，進而提高農(nóng)產(chǎn)品中的硒含量。

硒在生物體內(nèi)以有機硒和無機硒兩種形態(tài)存在。與無機硒相比，有機硒的安全性和可利用性更高。目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，外源施硒多選用的是無機硒、富硒酵母等，其中無機硒在農(nóng)產(chǎn)品生長過程中能否轉(zhuǎn)化成有機硒及其轉(zhuǎn)化程度，需要進行硒形態(tài)分析[7-8]。因此，建立簡單準確的有機硒含量測定方法十分必要。目前硒的形態(tài)分析方法主要有原子熒光光譜法[9]、高效液相色譜法[10]、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ICP-MS)[11]、電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(CE-ICP-MS)[12]等，其中原子熒光光譜法具有操作簡單、干擾少、靈敏度高等特點。本文采用原子熒光光譜法對糧谷中有機硒含量的測定進行了研究。

1 試驗部分

1.1 材料與試劑

選取小麥、玉米和大米等3種主要糧食作物作為試驗樣品。樣品脫粒后，除去雜物，清洗烘干，縮分至約50 g，粉碎，完全通過孔徑為0.25 mm(60目)的尼龍篩，混勻貯存于聚乙烯瓶中。

硝酸(HNO3)、高氯酸(HClO4)、過氧化氫(H2O2)、氫氧化鉀(KOH)，優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鹽酸(HCl)，優(yōu)級純，煙臺遠東精細化工有限公司；正辛醇(C8H18O)、環(huán)己烷(C6H12)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硼氫化鉀(KBH4)，質(zhì)量分數(shù)97%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硒標準溶液，1 000 μg/mL，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硒標準工作溶液，1 μg/mL；硒代蛋氨酸溶液標準物質(zhì)，上海安譜實驗科技股份有限公司。

硼氫化鉀溶液(8 g/L)：稱取8 g硼氫化鉀，溶于1 000 mL氫氧化鉀溶液(5 g/L)中，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

鐵氰化鉀溶液(100 g/L)：稱取10 g鐵氰化鉀，溶于100 mL水中，混勻。

硝酸-高氯酸(9+1)混合酸：將900 mL硝酸與100 mL高氯酸混勻。

1.2 儀器與設(shè)備

AFS-9760型雙道原子熒光光度計，北京海光儀器公司；MARS6型微波消解儀，美國CEM公司；BSA224S型電子天平，瑞士Sartorius公司；SP-1005型零污染制樣破碎機，天津拓至明實驗儀器技術(shù)開發(fā)有限公司；SHY-2A型恒溫水浴振蕩器，上海梅香儀器有限公司；HC-3018型離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DR-600型數(shù)顯恒溫電熱板，北京盈安美誠科學(xué)儀器有限公司。

1.3 儀器測定條件

負高壓：300 V；燈電流：80 mA；原子化溫度：800 ℃；爐高：8 mm；載氣流量：500 mL/min；屏蔽氣流量：1 000 mL/min；測量方式：標準曲線法；讀數(shù)方式：峰面積；延遲時間：1 s；讀數(shù)時間：15 s；加液時間：8 s；進樣體積：2 mL。

1.4 測定方法

1.4.1 總硒的測定

稱取0.500 0 g試樣，置于消解罐中，加5 mL硝酸，振搖混合均勻，放入微波消解儀中消化。消解結(jié)束，待冷卻后，將消解液轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加幾粒玻璃珠，在電熱板上繼續(xù)加熱至近干。再加 6 mol/L鹽酸溶液5 mL，繼續(xù)加熱至溶液變清亮，冷卻，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入100 g/L鐵氰化鉀溶液1 mL，用水定容，混勻待測。同時做空白試驗。

1.4.2 無機硒的測定

稱取1.000 0 g試樣于50 mL離心管中，加入0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL，混勻靜置8～12 h，置于70 ℃的恒溫水浴振蕩器中，以160 r/min振蕩2 h。提取完畢，冷卻至室溫后，以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上層清液。將收集的上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入環(huán)己烷5 mL萃取。收集水相于燒杯中，在70 ℃水浴上蒸發(fā)至5～10 mL。然后加入硝酸-高氯酸混合酸10 mL及幾粒玻璃珠，在電熱板上加熱至清亮無色并有白煙出現(xiàn)。冷卻，加6 mol/L鹽酸溶液5 mL，再置于電熱板上加熱沸騰幾分鐘后取下。冷卻后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加入100 g/L鐵氰化鉀溶液1 mL，用水定容，混勻待測。同時做空白試驗。

1.4.3 有機硒含量的計算

有機硒含量為總硒含量與無機硒含量的差值。

1.5 工作曲線

移取一系列硒標準工作溶液至100 mL容量瓶中，分別加入100 g/L鐵氰化鉀溶液10 mL，用鹽酸(5+95)溶液定容，配制成質(zhì)量濃度為0、1.00、5.00、10.0、20.0、30.0 μg/L的系列工作溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 無機硒樣品前處理方法的選擇

2.1.1 提取劑

生物體內(nèi)的無機硒主要以硒酸鹽和亞硒酸鹽的形式存在，有機硒以硒蛋白、硒多糖、硒核酸等大分子化合物以及硒代氨基酸等小分子化合物形式存在[13]。測定無機硒常用的提取劑主要有水[14]、酸[15]和乙醇[16]等，其中稀酸為良好的硒提取劑，通常首選鹽酸體系。

考察了不同濃度的鹽酸溶液對小麥中無機硒提取的影響，結(jié)果見表1。

表1 鹽酸濃度對無機硒提取的影響

由表1可知：當鹽酸溶液濃度小于0.1 mol/L時，無機硒的測定值隨鹽酸溶液濃度的升高而增大，其原因是隨著鹽酸溶液濃度的升高，無機硒逐漸被溶解出來；當鹽酸溶液濃度增大至0.5 mol/L時，無機硒的測定值基本不變，說明在稀酸條件下，無機硒可以完全溶出；但繼續(xù)升高鹽酸溶液濃度，無機硒的測定值有大幅增加，其原因可能是酸濃度過高，有機硒的結(jié)構(gòu)遭到破壞后溶解出來，影響了無機硒的測定。因此，試驗選用0.1 mol/L的鹽酸溶液作為提取劑。

2.1.2 提取溫度和提取時間

考察了溫度和時間對小麥中無機硒提取的影響，結(jié)果見表2和表3。

表2 溫度對無機硒提取的影響

表3 時間對無機硒提取的影響

結(jié)果表明：70 ℃下提取2 h，無機硒的測定值較高；隨著提取溫度的升高和提取時間的延長，無機硒的測定值增加不明顯。因此，試驗選取提取溫度為70 ℃，提取時間為2 h。

2.1.3 可溶性淀粉類物質(zhì)

雜糧中的可溶性淀粉類物質(zhì)會對硒元素的檢測產(chǎn)生干擾。在無機硒的提取過程中，雜糧中的可溶性淀粉類物質(zhì)會溶出，導(dǎo)致無機硒提取液的成分復(fù)雜。當直接測試提取液時，硒的熒光信號為0。這是因為提取液中的物質(zhì)與還原劑反應(yīng)產(chǎn)生大量泡沫，影響了氫化物的傳輸。

據(jù)文獻報道，消泡劑可以破壞和抑制泡沫薄膜的產(chǎn)生，選用正辛醇作為消泡劑可抑制大量泡沫，解決大量泡沫影響熒光測定的問題[17]。試驗考察了在5 μg/L硒標準工作溶液中正辛醇對硒熒光強度的影響，結(jié)果見表4。

表4 正辛醇對無機硒測定的影響

由表4可知，加入3滴正丁醇的硒標準工作溶液的測定值降低，這說明消泡劑在一定程度上會減弱硒的熒光信號，使測定結(jié)果偏低。

加大正辛醇的用量后，泡沫消失，但硒標準工作溶液的熒光強度降為零，說明加入消泡劑不能有效解決可溶性淀粉類物質(zhì)對硒含量測定的影響。試驗采用將提取液消解后再進行測定的方法，得到了準確可靠的測定數(shù)據(jù)。

2.1.4 小分子有機硒的分離

用稀鹽酸提取糧谷中無機硒的同時也會將部分小分子有機硒提取出來。研究表明，水相中的小分子有機硒經(jīng)甲苯[18]、環(huán)己烷[19]等有機溶劑的萃取，可以與無機硒有效分離?？紤]到試驗的安全性，采用環(huán)己烷萃取分離提取液中的小分子有機硒。選用小分子有機硒標準物質(zhì)硒代蛋氨酸進行驗證。

配制一定濃度的硒代蛋氨酸溶液，按試驗方法進行無機硒的測定。結(jié)果表明：使用環(huán)己烷萃取分離得到的水相提取液中未檢測出硒元素；未使用環(huán)己烷萃取分離的上層水相清液，硒的回收率為93.1%。說明環(huán)己烷能有效萃取分離小分子有機硒和無機硒。

2.2 工作曲線及檢出限

在相同試驗條件下，對0～30.0 μg/L的硒系列工作溶液進行測定，硒的線性回歸方程為If=279.463ρ+13.161，相關(guān)系數(shù)大于0.999。對樣品空白溶液連續(xù)測定11次，按3倍標準偏差計算方法的檢出限為0.1 μg/L。按稱樣量1 g、定容體積25 mL，計算無機硒的檢出限為0.003 mg/kg。

2.3 方法的精密度與回收率

2.3.1 精密度試驗

對小麥、大米、玉米等樣品中的無機硒進行測定，每個樣品平行測定6次，計算方法的精密度，結(jié)果見表5。

表5 精密度試驗結(jié)果

從表5可以看出：玉米樣品中的無機硒含量較低，未檢出；小麥和大米樣品中無機硒測定值的相對標準偏差分別為3.20%和4.93%，說明試驗方法具有良好的重復(fù)性，可用于糧谷中無機硒含量的測定。

2.3.2 回收試驗

對小麥、大米、玉米等樣品進行加標回收試驗。分別向樣品中加入0.200、0.500 mg/kg硒標準溶液，每個樣品平行測定2次，取2次結(jié)果的平均值作為測定值，結(jié)果見表6。

表6 加標回收試驗結(jié)果

從表6可以看出，糧谷中無機硒的加標回收率為89.0%～93.8%，說明試驗方法的準確度較高。

2.4 實際樣品中有機硒的測定

有機硒含量通過總硒含量與無機硒含量的差減得到。按試驗方法測定2個小麥樣品、2個大米樣品、2個玉米樣品，結(jié)果見表7。

表7 各樣品中總硒、無機硒、有機硒的測定結(jié)果

由表7可以看出：小麥、大米樣品中有機硒占總硒百分比分別為76.7%、77.2%、85.7%、86.1%；玉米樣品中總硒含量較少，未能檢出無機硒。

3 結(jié)語

本文建立了糧谷中無機硒和有機硒的測定方法，用鹽酸溶液在70 ℃水浴中提取其中的無機硒，離心，然后用環(huán)己烷提純上清液，分離得到含無機硒的水相，采用原子熒光光譜法測定總硒和無機硒含量，有機硒含量為總硒與無機硒含量的差值。本方法中無機硒的加標回收率為89.0%～93.8%，測定值的相對標準偏差小于5%，具有良好的重復(fù)性，為糧谷中無機硒和有機硒的測定提供了一種可靠的檢測方法。