潘逸聰 李楚齊 邵毅

遺傳性視網膜疾病(IRD)是一組影響視網膜基因型和表型的致盲性眼病[1]。視網膜神經感覺層是一種薄的多層結構，由多種細胞構成(光感受器、雙極細胞、視網膜神經節(jié)細胞及各種中間神經元亞型)[2]。視網膜周邊富含視桿細胞，對周邊視覺和微光視覺有重要作用。黃斑中心凹富含視錐細胞，對于視敏度和色覺處理非常重要[3]。與之外層相鄰的視網膜色素上皮(RPE)層對這些感光細胞的功能至關重要。許多IRD的病理生理表現(xiàn)被認為是由于RPE層、視桿細胞、視錐細胞的功能障礙引起的。IRD在所有年齡段的視力損害中都占有一席之地，其主要影響雙側和對稱的視網膜，也有感覺神經性耳聾、腎病等眼外表現(xiàn)。臨床診斷主要依靠臨床檢查和輔助診斷試驗，包括光學相干斷層掃描(OCT)、眼底自發(fā)熒光、視網膜電圖(ERG)和視野檢查。然而，鑒于IRD的異質性遺傳特性[4]和當前治療方式的特異性，基因檢測已成為診斷的基本手段。

1 視網膜營養(yǎng)不良的分子診斷試驗

新一代測序技術(NGS)的發(fā)展改變了分子診斷學領域，使快速、高通量、全基因組和全外顯子組測序成本大幅降低。由此可對已知的視網膜營養(yǎng)不良基因和候選基因進行靶向分析，并極大提高了診斷效率和準確性，但傳統(tǒng)的桑格法仍然在突變確認和對深內含子突變(如CEP290)以及鳥嘌呤胞嘧啶核苷酸富集區(qū)(如RPGR)的測序方面發(fā)揮著重要作用，這些突變難以利用NGS進行讀取[5]。自1984年報道第一個與X-連鎖視網膜色素變性(RP)相關的IRD基因以來，該領域進展頗多。歷年來識別的基因數(shù)量穩(wěn)步上升，截至2019年，已有271個基因確認與IRD相關[6]。

2 IRD的基因治療

過去數(shù)十年中，對于視網膜營養(yǎng)不良、玻璃體視網膜手術技術和病毒載體的了解快速增加，為采用基因替換和其他等位基因靶向策略治療這些疾病打下了堅實的基礎。大多數(shù)情況下，是通過用疾病基因的正?？截愺w進行基因替換的。

2.1 視網膜的病毒載體迄今已有包括慢病毒、腺病毒和腺相關病毒(AAV)在內的數(shù)種病毒載體用于基因治療。慢病毒載體的優(yōu)點包括其較大的互補DNA(CDNA)容量(8000～10 000堿基)和高效轉導RPE細胞的能力[7]，缺點包括其靶向分化的光感受器的能力較差，以及把它整合到靶細胞基因組中時有突變的風險。盡管腺相關病毒的容量較小(4800堿基)，但它已成為眼部基因傳遞使用病毒載體的主要選擇。這種重組的無包膜單鏈DNA病毒具有極低的免疫原性(優(yōu)于腺病毒)和毒性[8]，通過修飾病毒外殼和啟動子區(qū)域，可以靶向在特定類型的視網膜細胞中表達蛋白。

2.2 靶向視網膜的可取之處視網膜為基因治療提供了一定優(yōu)勢，主要有：第一，視網膜下空間具有相對的免疫豁免[9]，可將宿主對病毒載體的反應降至最低；第二，與全身給藥相比，視網膜下給藥只需較小的載體體積；第三，視網膜的解剖結構使載體給藥期間更易進行監(jiān)測及觀察；最后，考慮到IRD進展的對稱性，在評估安全性和有效性時，對側眼可以作為對照。

2.3 遞送載體的外科技術玻璃體內注射和視網膜下注射是主要技術，前者最為簡單，只需表面麻醉，通常在門診進行。但出于對載體之于光感受器和RPE層的有效性和炎癥的擔憂[8]，目前大多數(shù)都是通過平坦部玻璃體切割術進行視網膜下輸送，此方法雖成熟但存在白內障和視網膜脫離的風險。目前，視網膜下輸送的手術技術已經得到改進[10]，如MicroDose注射套件，使用踏板式注射技術將病毒載體輸送到視網膜下。術中OCT技術因其濾過泡實時可視化具有一定價值[11]，由于術中視網膜下和中心凹定位準確，已應用于voretigene neparvovec-rzyl(盧克圖納眼內注射懸浮液)的視網膜下輸送中。此外還有新的方法避免了玻璃體切割術及視網膜切開術，如通過脈絡膜上腔向外視網膜下注射。

2.4 里程碑式藥物voretgene neparvovec-rzylvoretgene neparvovec-rzyl是第一個FDA批準的針對遺傳性疾病的基因替換治療藥物[12]，經過多年相關基礎和臨床研究結果顯示，接受該藥治療的參與者的光敏度、視野和在微光條件下行走的能力均表現(xiàn)出明顯的改善[13]。這些有顯著意義的變化在治療后30 d就明顯出現(xiàn)，并在治療后1年和4年依然存在。治療方法為玻璃體切割，視網膜下注射150×109個載體基因組，總體積0.3 mL。通常情況下，注射部位沿著顳上血管拱形，距離中心凹至少2 mm。目前，這種藥物在美國的價格約為每眼需42.5萬美元，不久將在歐洲上市。

3 最新的視網膜基因治療試驗

3.1 先天性黑矇先天性黑矇(LCA)是發(fā)生最早、最嚴重的IRD，出生時或出生后一年內雙眼錐桿細胞功能會完全喪失，主要表現(xiàn)為嬰幼兒期視力減退、神經性耳聾、肥胖、糖尿病、尿崩癥、腎功能不全、性腺功能低下、高尿酸血癥及高甘油三酯血癥等，甚至先天性失明。可喜的是，LCA基因治療試驗的結果證明基因治療IRD是十分可行的[14]，尤其是RPE65介導的LCA基因治療效果顯著，且其具有一定的研究前景，這在兩項臨床二期試驗中得到了充分的證實，在三期試驗中更是獲得了廣泛的關注，并且創(chuàng)造了上述里程碑式的成果——腺相關病毒二型作為載體的基因治療藥物，即鼎鼎大名的voretgene neparvovec-rzyl。目前針對GUCY2D和CEP290相關的LCA，也已經展開了4個Ⅰ/Ⅱ 臨床試驗和一個三期臨床試驗。

3.2 色盲色盲是一種視錐細胞營養(yǎng)不良眼病，其主要特征包括嚴重近視(日盲)、嚴重色盲和視力下降[15]。目前與色盲有關的基因有6個：CNGA3、CNGB3、GNAT2、PDE6C、PDE6H和ATF6[16]，其中CNGB3和CNGA3突變分別占所有病例的50%和25%。目前，CNGB3和CNGA3的5個Ⅰ/Ⅱ 期臨床試驗正在進行中。

3.3 無脈絡膜癥無脈絡膜癥是一種X-連鎖視網膜營養(yǎng)不良，是由CHM基因突變引起的[17]，其特征是RPE丟失，脈絡膜毛細血管和光感受器繼發(fā)性退化，表現(xiàn)為夜視和進行性外周視野萎縮。無脈絡膜癥第一階段Ⅰ/Ⅱ臨床試驗的2年結果表明，經治療的眼睛視力有顯著和持續(xù)的改善(中位數(shù)4.5個字母增加，1.5個字母減少；P=0.04)。這些結果已經在其他試驗中得到證實，還有幾個正在進行或招募的試驗，其中包括第三階段試驗。

3.4 Stargardt病與ABCA4常染色體隱性遺傳性Stargardt病的患病率為萬分之一，由ABCA4基因突變所致[18]。常常由于黃斑RPE層和光感受器萎縮，在青春期之前即視力喪失。Stargardt病大多在恒齒生長期開始發(fā)病，是一種原發(fā)于RPE層的常染色體隱性遺傳病，散發(fā)者亦非少見，較多發(fā)生于近親婚配的子女患者，雙眼受害，同步發(fā)展，無明顯性別差異。它的病理生理包括視黃酰亞甲基磷脂酰乙醇胺(一種視黃醇中間體)在視桿和視錐細胞外段的轉運和清除出現(xiàn)障礙，導致脂褐素在RPE中病理性堆積[19]。幸運的是，同LCA一樣，基因治療Stargardt病有顯著的效果和廣闊的研究前景。但值得注意的是，由于ABCA4基因太大(6800堿基)，而腺相關病毒的容積又相對較小(4800堿基)，故ABCA4基因不能包裝在腺相關病毒(AAV)載體中。而一般使用cDNA容量更大的慢病毒(8000～10 000堿基)，基于此，賽諾菲對27名受試者進行了視網膜下注射SAR422459的I/IIa期劑量遞增安全性研究[20]，并對46名受試者進行了更大規(guī)模的試驗。這項研究工作正在進行中，結果尚未公布。

3.5 視網膜色素變性的基因治療視網膜色素變性(RP)是一種慢性、進行性、遺傳性及營養(yǎng)不良性視網膜退行性變，典型的癥狀包括夜盲、進行性周邊視野喪失，以及晚期由于視錐細胞退化造成的中心視力下降[21]。超過200個基因和3000多個突變與RP有關。遺傳模式包括常染色體隱性(50%～60%)遺傳、常染色體顯性(30%～40%)遺傳和X連鎖隱性遺傳(5%～15%)[22]。其中半數(shù)以上的X連鎖隱性家系中發(fā)現(xiàn)了RP的GTPase調節(jié)器(RPGR)基因突變，目前針對此種RP已有數(shù)種載體的2個 Ⅰ/Ⅱ 期臨床試驗和1個 Ⅱ/Ⅲ 期研究有序進行中。在此之前，已有兩項RPGR小鼠模型(RPGR-KO和RD9)的實驗表明[23]，接受治療的小鼠在治療4個月和6個月時的ERG反應有所改善。

另一方面，原癌基因酪氨酸激酶(MERTK)相關RP的基因替代治療研究也有了進展。一項Ⅰ期臨床試驗表明6名接受了人MERTK構建體視網膜下注射的受試者中[24]，有3名顯示出可測量的視力改善。以及在PDE6B相關RP中一項犬模型的實驗證實，AAV2轉染PDE6B基因的方法在3年中持續(xù)阻止了視桿細胞的退化[25]。

3.6 Usher綜合征一型的基因治療Usher綜合征又稱遺傳性耳聾-色素性視網膜炎綜合征，是以先天性感音神經性聾、漸進性RP而致視野縮小、視力障礙為主要表現(xiàn)的一種常染色體隱性遺傳性疾病，包括3個臨床亞型[26]，且有9個基因與之相關。其中Usher綜合征1B是由MYO7A突變引起的，MYO7A編碼肌球蛋白VIIA，肌球蛋白VIIA是光感受器內外節(jié)段之間纖毛運輸?shù)闹匾鞍譡27]。此型患者耳聾和光感受器功能障礙在出生時就表現(xiàn)出來了，隨后出現(xiàn)視網膜變性。一項英國的Ⅱ期臨床試驗目前正對MYO7A基因療法進行評估，該研究使用慢病毒作為載體攜帶基因產物并進行視網膜下注射，在受試的4例患者中均表現(xiàn)出良好的安全性。

3.7 X-連鎖視網膜劈裂癥的基因治療X-連鎖視網膜劈裂癥(XLRS)由視黃蛋白1(Rs1)基因突變引起，是一種遺傳性視網膜營養(yǎng)不良，主要患病人群為男性[28]，其特征是視網膜各層分裂，導致從光感受器到雙極細胞的突觸傳遞受損。此前的一項小鼠模型實驗顯示，玻璃體內注射人Rs1基因可有效地使這種多肽恢復正常[29]。

3.8 其他治療手段除了之前所敘述的基因替換治療IRD，目前也誕生了更多新穎的方法來實現(xiàn)突變特異性或等位基因特異性靶向。成簇規(guī)律間隔的短回文重復序列(CRISPR)-Cas9是一種RNA引導的核酸酶技術[30]，它對于解決常染色體顯性疾病等不適用傳統(tǒng)基因替換的疾病有巨大幫助。具體來說，CRISPR-Cas9介導DNA斷裂再由同源定向修復或非同源末端連接修復，而這其中核苷酸的缺失或插入是有利于CRISPR介導的基因校正的，在這一基礎上再分化出RPE和光感受器等分化細胞[31]。已經有研究人員開展了利用這種方法治療CEP290基因深內含子突變引起的LCA的二期臨床試驗[32]

另外一種治療IRD的新療法是使用反義寡核苷酸來靶向IRD中涉及的異常前信使RNA[33]，從而以等位基因特異性的方式調節(jié)mRNA編輯中的剪接過程。但玻璃體內注射反義寡核苷酸的安全性和有效性仍有待評估。

4 研究前景

關于基因療法的治療案例和實驗的數(shù)量每年都在不斷地增加，這種精準而有效的醫(yī)療手段在逐步走向成熟。而伴隨著這種技術的進步，視網膜作為一個在免疫原性和組織結構上具有顯著優(yōu)勢的靶向目標，使得IRD的基因治療領域表現(xiàn)較為優(yōu)越[34]，一方面是精確的分子診斷，另一方面是精準的手術治療。這一領域目前不僅包括傳統(tǒng)的基因增強方法(基因替換治療),而且也迅速擴展到使用CRISPR或反義技術的等位基因特異性或突變特異性抑制的前沿方法。同時通過廣泛使用大量已獲悉的與IRD相關的基因，使得我們更加清楚地認識到每例患者的基因改變。并在此基礎上提高了診斷效率以便進行及時治療。在寬度上，記錄顯示最小的接受基因治療的對象為年僅22個月的LCA患者(幼兒眼球震顫要因)[35]，而在接受這一治療的廣度上，全球預計550萬IRD患者將受到影響，其中半數(shù)以上會接受基因診斷，接受這一治療的患者數(shù)量也將十分可觀。

視網膜外科手術的進展也是視網膜基因治療不可或缺的支柱。視網膜下遞送技術被證實是行之有效且安全的，特別是隨著玻璃體視網膜手術可視化和儀器的不斷改進。雖然玻璃體腔入路是一種不錯的常規(guī)手術，但目前看來視網膜下入路是獲得光感受器和RPE層的最佳途徑。

因此，在對IRD患者進行基因治療時，一定需要多學科診療。這是一種新穎的模式，需要生物信息專家和分子病理學家與臨床醫(yī)師共同合作，而臨床醫(yī)師又需要得到遺傳咨詢師、高級診斷測試(如顯微視野檢查、全視野暗視敏感閾值測試)和ERG的幫助。