呂文海，薛世斌，鄭濤

1.西安鳳城醫(yī)院神經外科，陜西 西安 710000；2.西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院神經外科，陜西 西安 710000

星形膠質細胞是神經系統(tǒng)中數(shù)量最多的神經膠質細胞，參與調控多種中樞神經系統(tǒng)疾病的進展[1]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)能夠激活星形膠質細胞，使其釋放大量的炎性因子毒害神經細胞，誘導神經細胞凋亡和壞死，進而引起一系列的中樞神經系統(tǒng)疾病[2]。而脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，能夠導致星形膠質細胞炎癥損傷[3]。丹參川芎嗪是由丹參和川芎嗪構成的復方制劑，兩者均具有神經保護作用，臨床上常用于腦血栓的治療[4]。研究顯示，丹參川芎嗪可有效用于急性腦梗死的治療，還可抑制炎性反應[5]。丹參川芎嗪聯(lián)合前列地爾對神經功能缺損的改善作用顯著，且可改善患者的預后[6]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與膠質細胞的炎癥反應相關[7]。研究報道，miR-214在LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型中具有促炎作用[8]。miR-214-3p可通過下調組織蛋白酶B(Cathepsin B，CTSB)的表達降低多巴胺能神經元的活力[9]。然而miR-214-3p對炎癥因子的影響還尚不清楚。本實驗通過LPS刺激星形膠質細胞，旨在研究丹參川芎嗪對LPS引起星形膠質細胞炎癥因子釋放和神經元凋亡的影響，及其是否通過調控miR-214-3p影響星形膠質細胞炎癥因子釋放和神經元凋亡。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 星形膠質細胞HA1800購自上海冠導生物工程有限公司；丹參川芎嗪注射液購自貴州拜特制藥有限公司；脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、1%青霉素/鏈霉素購自美國Gibico公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA)購自美國ScienCell公司；二辛可寧酸(BCA)試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒購自上海碧云天公司；熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。miR-con、miR-214-3p、anti-miR-con、anti-miR-214-3p由上海基屹生物科技有限公司構建。

1.2 方法

1.2.1 原代星形膠質細胞的培養(yǎng)與分組 星形膠質細胞HA1800用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，用10μg/L的LPS處理HA1800細胞6 h作為LPS組，以正常培養(yǎng)的細胞作為對照(NC)組；分別用5 mL/L、10 mL/L、20 mL/L丹參川芎嗪注射液(SML)處理24 h后再用10μg/L LPS處理3 h分別作為LPS+5 mL/L SML組、LPS+10 mL/L SML(LPS+SML)組、LPS+20 mL/L SML組；將miR-con、miR-214-3p轉染至HA1800中再用10μg/L LPS處理，分別記為LPS+miR-con組、LPS+miR-214-3p組；將anti-miR-con、anti-miR-214-3p轉染至HA1800中用10 ml/L丹參川芎嗪注射液處理24 h后再用10μg/L LPS處理3 h，分別記為LPS+SML+anti-miR-con組、LPS+SML+anti-miR-214-3p組。

1.2.2 MTT試劑盒檢測細胞存活率 各組細胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說明操作，酶標儀檢測490 nm處各孔吸光度(OD)值。以實驗組和對照組OD值的比值作為細胞存活率(%)。

1.2.3 ELISA法檢測TNF-α、IL-6水平 取各組細胞培養(yǎng)48 h的上清液，然后嚴格按照試劑盒說明操作進行檢測。

1.2.4 Western Blot檢測裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)蛋白表達水平 提取細胞總蛋白，通過聚丙烯凝膠電泳分離蛋白，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Cleaved-caspase-3的一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育90 min，然后加入ECL化學發(fā)光液顯影成像，最后分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白相對表達水平。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集培養(yǎng)48 h細胞，漂洗后按試劑盒說明操作加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育后上流式細胞儀檢測。

1.2.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測miR-214-3p表達水平 提取細胞總RNA，合成cDNA后按試劑盒說明進行PCR，以U6為內參，用2-△△Ct法計算miR-214-3p的相對表達量。miR-214-3p上游引物序列：5'-CTATGTCCTCACCGAACGCAACC-3'，下游引物序列：5'-CAGCAGGCACAGACAGGC-3'；U6上游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.00統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩兩間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度SML對LPS處理的星形膠質細胞HA1800活性的影響 與對照組比較，LPS組的細胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與LPS組比較，不同濃度SML和LPS共處理組的細胞存活率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度SML對LPS處理的星形膠質細胞HA1800活性的影響(±s，n=3)

表1 不同濃度SML對LPS處理的星形膠質細胞HA1800活性的影響(±s，n=3)

注：與NC比較，a P<0.05；與LPS比較，b P<0.05。

組別NC組LPS組LPS+5 ml/L SML組LPS+10 ml/L SML組LPS+20 ml/L SML組F值P值細胞存活率(%)100.00±10.10 151.26±15.10a 140.11±13.52b 125.02±12.01b 113.26±11.16b 24.130 0.000

2.2 SML對LPS處理的星形膠質細胞HA1800炎癥因子釋放和神經元細胞凋亡的影響 與對照組相比，LPS組星形膠質細胞中TNF-α和IL-6水平升高，Cleaved-caspase-3表達水平及細胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+SML組TNF-α和IL-6水平降低，Cleaved-caspase-3表達水平及細胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1和表2。

圖1 SML對LPS處理的星形膠質細胞HA1800炎癥因子釋放和神經元細胞凋亡的影響

表2 SML對LPS處理的星形膠質細胞HA1800炎癥因子釋放和神經元細胞凋亡的影響(±s，n=3)

表2 SML對LPS處理的星形膠質細胞HA1800炎癥因子釋放和神經元細胞凋亡的影響(±s，n=3)

注：與NC比較，a P<0.05；與LPS比較，b P<0.05。

組別NC組LPS組LPS+SML組F值P值細胞凋亡率(%)8.01±0.80 28.63±2.88a 12.01±1.21b 310.462 0.000 TNF-α 1.00±0.10 2.35±0.24a 1.20±0.12b 174.787 0.000 IL-6 1.05±0.13 3.21±0.32a 1.42±0.14b 259.393 0.000 Cleaved-caspase-3 0.35±0.04 0.96±0.10a 0.48±0.05b 197.681 0.000

2.3 SML對miR-214-3p表達的影響 與對照組相比，LPS組的miR-214-3p表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與LPS比較，LPS+SML組的miR-214-3p表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 SML對miR-214-3p表達的影響(±s，n=3)

表3 SML對miR-214-3p表達的影響(±s，n=3)

注：與NC比較，a P<0.05；與LPS比較，b P<0.05。

組別NC組LPS組LPS+SML組F值P值miR-214-3p 1.00±0.10 0.32±0.03a 0.92±0.09b 196.295 0.000

2.4 高表達miR-214-3p對LPS處理的星形膠質細胞HA1800炎癥因子釋放和神經元細胞凋亡的影響 與對照組相比，LPS組的miR-214-3p表達水平降低，TNF-α和IL-6水平升高，Cleaved-caspase-3表達水平及細胞凋亡率升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與LPS+miR-con組相比，LPS+miR-214-3p組的miR-214-3p表達水平升高，TNF-α和IL-6水平降低，Cleaved-caspase-3表達水平及細胞凋亡率降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2和表4。

表4 高表達miR-214-3p對LPS處理的星形膠質細胞HA1800炎癥因子釋放和神經元細胞凋亡的影響(±s，n=3)

表4 高表達miR-214-3p對LPS處理的星形膠質細胞HA1800炎癥因子釋放和神經元細胞凋亡的影響(±s，n=3)

注：與NC比較，a P<0.05；與LPS比較，b P<0.05。

組別NC組LPS組LPS+miR-con組LPS+miR-214-3p組F值P值TNF-α 1.00±0.11 2.42±0.24a 2.40±0.24 1.36±0.14b 128.896 0.000 miR-214-3p 1.00±0.13 0.35±0.04a 0.36±0.05 0.86±0.09b 140.402 0.000 Cleaved-caspase-3 0.35±0.04 0.95±0.10a 0.96±0.11 0.48±0.05b 137.450 0.000 IL-6 1.08±0.11 3.26±0.33a 3.31±0.33 1.42±0.15b 199.696 0.000細胞凋亡率8.15±0.82 26.38±2.65a 28.01±2.88 11.83±1.68b 193.993 0.000

圖2 Western Blot檢測Cleaved-caspase-3表達

2.5 低表達miR-214-3p可以逆轉SML對LPS處理的星形膠質細胞HA1800炎癥因子釋放和神經元細胞凋亡的影響 與LPS組相比，LPS+SML組的miR-214-3p表達水平升高，TNF-α和IL-6水平降低，Cleaved-caspase-3表達水平及細胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與LPS+SML+anti-miR-con組相比，LPS+SML+anti-miR-214-3p組的miR-214-3p表達水平降低，TNF-α和IL-6水平升高，Cleaved-caspase-3表達水平及細胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3和表5。

表5 低表達miR-214-3p可以逆轉SML對LPS處理的星形膠質細胞HA1800炎癥因子釋放和神經元細胞凋亡的影響(±s，n=3)

表5 低表達miR-214-3p可以逆轉SML對LPS處理的星形膠質細胞HA1800炎癥因子釋放和神經元細胞凋亡的影響(±s，n=3)

注：與NC比較，a P<0.05；與LPS比較，b P<0.05。

組別NC組LPS組LPS+miR-con組LPS+miR-214-3p組F值P值TNF-α 1.00±0.10 0.42±0.04a 0.40±0.05 0.89±0.10b 145.631 0.000 miR-214-3p 1.00±0.12 2.35±0.24a 2.40±0.25 1.35±0.14b 117.002 0.000 Cleaved-caspase-3 0.96±0.10 0.45±0.03a 0.46±0.04 0.85±0.09b 121.515 0.000 IL-6 1.05±0.12 0.35±0.04a 0.38±0.05 0.90±0.09b 173.143 0.000細胞凋亡率27.01±2.70 12.05±1.21a 12.11±1.25 23.31±2.43b 131.628 0.000

圖3 Western Blot檢測Cleaved-caspase-3表達

3 討論

以膠質細胞激活為主要特征的炎癥反應與神經退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，抑制星形膠質細胞炎癥因子的釋放有利于改善和治療神經系統(tǒng)疾病[10-11]。有研究報道川芎嗪具有保護神經元細胞損傷的功能[12]；丹參及其有效成分具有抑制神經細胞凋亡、改善腦缺血以及減輕腦梗死的作用[13]。有研究發(fā)現(xiàn)由丹參和川芎嗪構成的丹參川芎嗪注射液能明顯降低急性顱腦損傷患者的TNF-α、IL-6、IL-8水平，對改善患者的臨床癥狀有良好療效，且安全性高[14]。丹參川芎嗪注射液還能抑制機體炎癥反應，有效促進患者的神經功能、認知功能能力[15]。丹參川芎嗪注射液可通過抑制細胞凋亡、抗氧化應激等保護Aβ誘導的PC12細胞損傷[16]。本實驗用LPS處理星形膠質細胞促使細胞凋亡和炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放，引發(fā)炎癥反應。丹參川芎嗪注射液預處理后，LPS作用的星形膠質細胞的存活率降低，TNF-α和IL-6水平降低，細胞凋亡率降低；說明丹參川芎嗪注射液可抑制LPS誘導的神經元細胞凋亡和炎性因子的釋放。

研究表明miRNA不僅參與細胞凋亡，還與炎癥反應有關。有研究報道上調miR-214可抑制炎癥細胞因子的產生[17]。miR-214可抑制異丙酚誘導的神經細胞凋亡[18]。本實驗結果顯示，LPS誘導的星形膠質細胞中miR-214-3p表達下調。過表達miR-214-3p可降低TNF-α和IL-6水平，降低細胞凋亡率；說明過表達miR-214-3p可抑制LPS誘導的神經元細胞凋亡和炎性因子的釋放。還有研究報道顯示，葛根素可通過上調miR-214減輕缺氧導致的神經干細胞損傷[19]。川芎嗪通過下調miR-214-3p減輕了受損脊髓的神經細胞凋亡[20]。本實驗結果顯示，丹參川芎嗪注射液處理后，miR-214-3p表達水平升高；而抑制miR-214-3p表達逆轉了丹參川芎嗪注射液對LPS誘導的神經元細胞凋亡和炎性因子的抑制作用。表明丹參川芎嗪可能通過調控miR-214-3p的表達影響神經元細胞的凋亡和炎性因子的釋放。

綜上所述，丹參川芎嗪可抑制星形膠質細胞HA1800活性，抑制LPS引起的神經元細胞凋亡和炎性因子TNF-α和IL-6的釋放。其機制可能與上調miR-214-3p的表達有關。